羅科學　王欽賢　陳富興

[摘要] 目的 調(diào)查長期夜班工作醫(yī)務人員腸道菌群結構的變化，探討腸道菌群與長期夜班工作所致慢性疾病的關系。方法 采集30例有5年以上夜班工作經(jīng)歷的醫(yī)務人員（試驗組）及30例非夜班工作的健康志愿者（健康對照組）的糞便，利用熒光定量PCR方法定量分析兩組人群腸道主要菌群結構的變化。 結果 試驗組與健康對照組相比，長期夜班工作的醫(yī)護人員的擬桿菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌含量均有下降，差異有高度統(tǒng)計學意義（P<0.01）。而腸球菌和腸桿菌則較健康對照組有所升高，其中腸球菌組間比較，差異有高度統(tǒng)計學意義（P<0.01），腸桿菌組間比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。 結論 長期夜班工作醫(yī)務人員腸道內(nèi)益生菌擬桿菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌減少，條件致病菌腸球菌和腸桿菌增多，存在較明顯的腸道菌群結構失調(diào)。

[關鍵詞] 長期夜班工作醫(yī)務人員；腸道菌群；熒光定量PCR；調(diào)查

[中圖分類號] R378 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2017）28-0126-04

[Abstract] Objective To investigate the changes of intestinal flora structure in medical staff taking long-term night shift， and to explore the relationship between intestinal flora and chronic diseases caused by long-term night work. Methods Faeces of 30 cases of medical personnel with more than 5 years working experience of night work（experimental group） and 30 healthy volunteers who had no night work（healthy control group） were collected. Fluorescence quantitative PCR method was used to quantitatively analyze the changes of main intestinal flora structure in the two groups. Results Compared with the healthy control group， the contents of Bacteroides， Bifidobacterium and Lactobacillus in the medical staff taking long-term night shift were all decreased in the experimental group. There were statistically significant differences between the two groups（P<0.01）. The contents of Enterococcus and Enterobacteriaceae were higher than those in the healthy control group， and there was significant difference in Enterococcus between two groups（P<0.01）. The difference in Enterobacteriaceae was significant between two groups（P<0.05）. Conclusion The contents of intestinal probiotics such as Bacteroides， Bifidobacterium and Lactobacillus are decreased in the medical staff taking long-term night shift， while the conditioned pathogens such as Enterococcus and Enterobacteria are increased. There are more significant intestinal flora structural disorders.

[Key words] Medical staff taking long-term night shift； Intestinal microflora； Fluorescence quantitative PCR； Investigation

醫(yī)務工作者工作繁忙，工作節(jié)奏快，職業(yè)壓力大，會影響到本身的心身健康。尤其是長期夜班工作的醫(yī)護人員，長期的睡眠-覺醒周期不規(guī)律，缺乏運動，飲食不規(guī)律，以及經(jīng)常面對夜班突發(fā)應激事件，不但會引起職業(yè)倦怠，導致亞健康狀態(tài)，使醫(yī)療工作效率下降，甚至會出現(xiàn)醫(yī)療差錯。而且也會導致疲勞綜合征、肥胖、高血壓、慢性胃炎、抑郁癥等疾病[1]。

腸道菌群參與人體的消化、營養(yǎng)物質(zhì)的吸收、能量的供應、脂肪代謝、免疫調(diào)節(jié)等諸多環(huán)節(jié)，不管是在健康狀態(tài)還是在疾病狀態(tài)下的人體代謝過程均會受腸道菌群的影響[2-3]。長期夜班工作有可能會導致腸道菌群的變化，而這種變化可能是導致亞健康狀態(tài)和相關慢性疾病產(chǎn)生的關鍵因素。因此，研究夜班工作醫(yī)務人員腸道菌群的變化，不但對相關慢性疾病有預防意義，同時可以進一步針對腸道菌群為靶點進行治療。然而專門針對醫(yī)護人員腸道菌群變化的研究較少，單純細菌培養(yǎng)方法有很大局限性，已有研究顯示腸道菌群結構失調(diào)是在“種屬”的水平發(fā)生的，因此，必須用不同種屬的細菌比例研究腸道菌群結構變化[4]。本文利用熒光定量PCR方法通過研究5年以上夜班工作經(jīng)歷醫(yī)務人員的腸道菌群變化，比較其與健康人群腸道菌群的差異。endprint

1 資料與方法

1.1一般資料

選取我院工作的醫(yī)護工作者，納入及排除標準：①年齡20～50歲之間；②1周內(nèi)需輪值夜班1次，連續(xù)5年以上；③排除既往有心臟病、肝臟、腎臟等重要器官以及內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病者；④排除消化系統(tǒng)疾病病史，未進行過胃腸道手術，1個月內(nèi)無急性腹瀉癥狀的急性腸傳染??；⑤前3個月內(nèi)未使用各種抗生素，1個月內(nèi)未服用腸道益生菌、質(zhì)子泵抑制劑、膠體鉍劑。最終入選30例為試驗組。并隨機選取沒有輪值夜班的符合上述①、③、④、⑤條件的健康志愿者30例為健康對照組。其中試驗組平均年齡（36.0±5.2）歲，健康對照組平均年齡（36.0±7.2）歲，男女比例均為1∶1，兩組年齡、性別等一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 標本的收集 采集試驗組和健康對照組成員糞便樣品，樣品均用無菌容器收集，置于干冰上，30 min內(nèi)送至實驗室，-80℃凍存。

1.2.2 糞便DNA提取 ①標本于常溫下融凍，取0.2 g大便，加1 mL磷酸鹽緩沖液（PBS），0.05 mol/L，pH7.4，充分混勻5 min；②1000 rpm離心10 min，取上清液，按上述方法重復3次；③收集全部上清液14000 rpm離心10 min后，棄上清留取沉渣；④加1 mL PBS混勻沉渣，14000 r/min離心15 s，棄上清；反復用PBS洗滌4次。⑤DNA的純化：將上述菌體液14000 r/min離心15 s后，取200 μL上清，為分離出的細菌。⑥取200 μL DNA提取A液于0.5 mL離心管中，每管分別加入待檢細菌液50 μL，顛倒數(shù)次充分混勻，室溫靜置3 min。⑦加入250 μL DNA提取B液，顛倒數(shù)次充分混勻。⑧13000 rpm離心10 min，取上清。⑨加入200 μL DNA提取C液，顛倒數(shù)次混勻。⑩13000 rpm離心5 min，吸棄上清，室溫或55℃放置2～5 min晾干。加入20 μL樣品稀釋液混懸沉淀物，短暫離心使液體落于管底，取上清行PCR。

1.2.3 引物的設計合成 PCR特異擴增引物片段長度和序列見表1。

1.2.4 熒光定量PCR ①陽性標準品及其梯度的制備：（標準曲線定量法）；②陽性標準品的制備：預實驗PCR擴增的陽性產(chǎn)物經(jīng)過2%低熔點瓊脂糖凝膠電泳（含溴化乙胺啶，用TAE緩沖液配制），在長波紫外燈下，割下目的條帶。用回收試劑盒（QIA quick CEL Extraction KIT）回收純化，克隆。提取陽性克隆質(zhì)粒，即為陽性標準品。③陽性標品梯度的制備：取陽性標準品50 μL按10倍稀釋（加水45 μL并充分混勻），依次稀釋下去，制備成陽性定量標準品梯度，倍比稀釋一定要準確，否則影響定量結果。每次上機必須新鮮配置陽性定量標準品梯度，正式上機時以包含所有樣本的4個梯度上機即可。④反應體系及反應條件。采用iQTMSYBR Green supermix（Bio-Rad，USA）配置定量PCR反應體系，25 μL總體積含2×Supermix 12.5 μL和上下游引物（12.5 μmol）各1 μL。⑤待測樣本Ct值均落在標準曲線上，通過各Ct值在標準曲線上所對應的拷貝數(shù)得到待測樣本拷貝數(shù)。因按照試劑盒提取說明0.2 g糞便組織共提取200 μL基因組，檢測前待測樣本按不同倍數(shù)稀釋到同一濃度，最后結果需乘以總稀釋倍數(shù)，計算出每克糞便的細菌拷貝數(shù)，單位換算成1 g copies/g濕便，進行統(tǒng)計學分析。

1.3 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 13.0軟件包進行統(tǒng)計學分析，符合正態(tài)分布的計量資料用（x±s）表示，非正態(tài)分布參數(shù)經(jīng)自然對數(shù)轉換后進行統(tǒng)計分析，多重組間比較采用單因素方差分析方法，組間兩兩比較采用q檢驗，組內(nèi)治療前后比較采用配對設計t檢驗，數(shù)據(jù)相關分析采用Pearson直線相關性分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義，P<0.01為差異有高度統(tǒng)計學意義。

2 結果

實時熒光定量PCR結果顯示，試驗組與健康對照組比較，長期夜班工作的醫(yī)護人員的擬桿菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌含量均有下降，三者組間比較差異有高度統(tǒng)計學意義（P<0.01）。而腸球菌和腸桿菌則較健康對照組有所升高，其中腸球菌組間比較，差異有高度統(tǒng)計學意義（P<0.01），腸桿菌組間比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表2。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)長期夜班工作醫(yī)務人員的腸道菌群結構與健康對照組相比發(fā)生了明顯的變化，其中擬桿菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌含量均有下降；而腸球菌和腸桿菌則比健康對照組數(shù)量有增高。

擬桿菌是腸道中最主要的厭氧菌。有研究發(fā)現(xiàn)，其在幫助宿主分解多糖、促進腸黏膜的血管再生和免疫系統(tǒng)的發(fā)育方面有重要作用，有利于維持腸道微生態(tài)的平衡[5]；研究發(fā)現(xiàn)擬桿菌屬中有多種細菌對腸黏膜抵抗力有益[6]。擬桿菌門/厚壁菌門這一比值與血糖濃度和肥胖呈正相關[7-8]。

雙歧桿菌能夠粘附于腸上皮細胞表面，可以防止病原菌或條件致病菌的定植[9]；作為免疫原可誘導增強機體的各種免疫功能，從而增強機體免疫功能[10]；可使膽固醇轉化為人體無法吸收的糞甾醇，隨糞便排出體外，因而可以起到降血酯作用[11]；有研究者通過對高脂膳食喂養(yǎng)的小鼠飼喂寡果糖益生元來改善腸道內(nèi)雙歧桿菌的含量，發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌可以改善糖耐量、降低內(nèi)毒素血癥、減少細菌移位，使低濃度炎癥好轉[12-13]。

乳酸桿菌可促進腸道黏蛋白分泌，抑制大腸桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌等有害菌對黏液、腸上皮細胞的粘附，對維護、穩(wěn)定腸黏液層屏障功能有重要作用[14]?？梢种朴泻姆敝?，對胃腸道的感染具有預防與治療作用[15]；能激活機體的免疫系統(tǒng)，特別是巨噬細胞、自然殺傷細胞（NK）細胞和B淋巴細胞；乳酸菌還具有降低血清膽固醇等作用[16]。上述三種細菌是有益菌，能夠幫助消化、維持腸道屏障、降血脂、增強免疫功能等，其數(shù)量在長期夜班工作醫(yī)務人員的腸道較健康人下降，說明長時間頻繁的夜班工作已經(jīng)使腸道菌群結構發(fā)生了變化，使機體更容易出現(xiàn)腸功能紊亂、高血脂、免疫異常等疾病。endprint

本研究發(fā)現(xiàn)長期夜班工作醫(yī)務人員腸球菌和腸桿菌較健康對照組有所升高。腸桿菌和腸球菌是人體內(nèi)常駐菌群，正常生理狀態(tài)下不引起疾病，但在一定條件下可導致感染。有研究顯示，腸桿菌細胞壁可產(chǎn)生LPS，導致脂多糖LPS釋放增加，當腸道黏膜屏障功能受損時，LPS通過腸道屏障吸收入血，易導致內(nèi)毒素血癥，刺激大量炎性因子產(chǎn)生，這些炎性因子參與維持機體的長期慢性低度炎性反應狀態(tài)[17]；也有研究發(fā)現(xiàn)腸球菌屬與脂代謝水平相關，腸球菌屬和腸球菌屬占總細菌的比例與甘油三酯水平呈顯著正相關關系，其比例與高密度脂蛋白呈顯著負相關[18]。兩種是條件致病菌，其數(shù)量的增加，會增加腸道的通透性，容易導致慢性低度的炎癥反應狀態(tài)，出現(xiàn)胰島素抵抗，從而使長期頻繁的夜班工作的醫(yī)務人員更容易出現(xiàn)肥胖、高血壓、冠心病等一系列的代謝紊亂性疾病。

近幾年，腸道菌群對人體健康的重要性隨著研究的不斷深入已逐漸顯現(xiàn)出來，人類的腸道內(nèi)定值的腸道菌群共約500～1000個不同的種屬，其細胞總量超過1000萬億[19]。腸道菌群是與人體共生、相互影響的復雜系統(tǒng)，幾乎是一個被遺忘的器官[20]。許多研究表明[21]，腸道菌群失調(diào)不僅會導致多種胃腸道疾病，如幽門螺桿菌感染、腹瀉、便秘、炎癥性腸病等，同時還會誘發(fā)肥胖、糖尿病、代謝綜合征、心血管疾病和過敏疾病等。因此，可以通過調(diào)節(jié)腸道菌群預防疾病，促進健康，改善癥狀，縮短病程。

研究發(fā)現(xiàn)和事實證明頻繁的夜班，工作量大，長期在高風險、高壓力下超負荷、快節(jié)奏的工作，使機體經(jīng)常處于應激狀態(tài)。應激狀態(tài)下機體內(nèi)會產(chǎn)生內(nèi)分泌、神經(jīng)生化及免疫功能的變化，長期的影響會導致機體內(nèi)環(huán)境失衡，出現(xiàn)多系統(tǒng)的功能障礙，進一步產(chǎn)生焦慮、抑郁情緒異常[22]。同時根據(jù)微生態(tài)原理，每一個人腸道微生態(tài)菌群的形成和結構與其飲食結構和生存環(huán)境密切相關[23]。醫(yī)務人員長時間在細菌、病毒高濃度的環(huán)境中工作，也可能引發(fā)腸道菌群結構的變化。本研究采用實時熒光定量PCR方法從種屬的水平、定量的角度檢測長期夜班工作醫(yī)務人員和非夜班健康人腸道菌群的異常，證實長期夜班工作醫(yī)護人員的腸道菌群結構發(fā)生了顯著地變化，存在失調(diào)情況。這種腸道菌群結構的失調(diào)可能是導致亞健康狀態(tài)、疲勞綜合征、肥胖、代謝紊亂和抑郁癥等一系列疾病的早期病理生理基礎。在臨床治療中，也可以利用微生態(tài)試劑靶向調(diào)控腸道菌群結構，并通過改善腸道菌群結構改善亞健康狀態(tài)及導致的多種疾病。

目前，對腸道菌群的研究多聚焦于某種特定的疾病，只是針對長期夜班工作容易導致的幾種疾病有相關研究。如對于肥胖和代謝綜合征，諸多研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群是連接飲食結構異常到肥胖和代謝綜合征發(fā)生的重要橋梁，其基本機制：影響合成脂肪的基因，導致脂肪過度積累[24]；破壞腸屏障，腸道通透性增加，引發(fā)代謝性內(nèi)毒素血癥，從而引發(fā)宿主全身的低度、系統(tǒng)性的慢性炎癥，誘發(fā)胰島素抵抗，進而導致肥胖、代謝綜合征等疾病[25]。關于慢性疲勞綜合征，研究發(fā)現(xiàn)，與健康人相比，慢性疲勞綜合征患者腸道菌群發(fā)生了改變，包括雙歧桿菌和大腸桿菌的數(shù)量減少，糞鏈球菌則大量增加，部分患者表現(xiàn)有Lactonifactor和Alistipes增多[26]。本研究關于腸道菌群的研究突破了僅僅圍繞某種疾病的固有范疇，針對某個特定的職業(yè)的特定人群，不但拓展了腸道菌群研究的對象，而且也為更多的職業(yè)病及地方病研究提供了一種新的思路和方法。

盡管本研究顯示長期夜班工作醫(yī)護人員的腸道菌群較健康人發(fā)生了變化，揭示了長期夜班工作所導致的慢性疾病與腸道菌群之間有密切的聯(lián)系，但對于兩者之間的因果關系和具體機制，仍有眾多不確定之處。而且，本研究所用的熒光定量PCR方法，只能檢測到腸道中的優(yōu)勢菌，下一步可應用更先進的高通量測序的方法進行研究，期望能更全面地檢測腸道中的完整菌群。

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（收稿日期：2017-02-23）endprint