唐修君+樊艷鳳+葛慶聯(lián)+賈曉旭+張靜+劉茵茵+張小燕+王玨+高玉時

摘 要：為建立畜禽肉中雞源性成分的快速檢測方法，以線粒體DNA細胞色素C氧化酶亞基Ⅰ（COⅠ）基因序列為靶點，比較羊、牛、豬、兔、鴿、鵪鶉、雞、鴨、鵝9 種動物COⅠ基因的差異位點，設(shè)計篩選雞特異性引物，進行常規(guī)聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）和熒光定量PCR檢測。結(jié)果表明：所設(shè)計的引物僅對雞肉DNA模板有擴增條帶和典型擴增曲線，且循環(huán)閾（cycle threshold，Ct）值為21.78，對其他動物DNA模板無擴增。方法特異性較強，靈敏度較高，達pg級，可以用于畜禽肉與肉制品中雞源性成分的快速、有效、準確檢測。

關(guān)鍵詞：雞源性成分；線粒體DNA；COⅠ基因；熒光定量PCR

Identification of Chicken Origin Ingredients in Livestock and Poultry Meat Based on Mitochondrial DNA COI Gene

TANG Xiujun， FAN Yanfeng， GE Qinglian， JIA Xiaoxu， ZHANF Jing， LIU Yinyin， ZHANG Xiaoyan， WANG Jue， GAO Yushi*

（Institute of Poultry， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Yangzhou 225125， China）

Abstract： In this study， a quick method to identify ingredients of chicken origin in livestock and poultry meat was developed by polymerase chain reaction （PCR） and fluorescence quantitative PCR using mitochondrial DNA cytochrome C coxidase subunit Ⅰ （CO Ⅰ） gene as target gene. The mitochondrial DNA CO Ⅰ genes from chicken， duck， goose， pig， cattle， sheep， rabbit， pigeon and quail revealed distinct loci. Based on this， a set of chicken-specific primers was designed. The results showed that the designed primers could only amplify template DNA from chicken with a cycle threshold （Ct） value of 21.78. The PCR assay had a high specificity and sensitivity （at pg level） and it could be used to detect ingredients of chicken origin in livestock and poultry meat quickly and accurately.

Key words： chicken origin ingredients； mitochondrial DNA； cytochrome C coxidase subunit I （CO I） gene； fluorescence quantitative PCR

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201708009

中圖分類號：TS207.3 文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2017）08-0044-05

作為人類重要的營養(yǎng)來源，肉類與人們的生活和健康密切相關(guān)，然而在利益驅(qū)動下肉制品摻雜、摻假事件時有發(fā)生，“掛鵝頭賣鴨肉”、非法使用添加劑牛肉膏等食品安全事件不斷出現(xiàn)，嚴重侵害了消費者的權(quán)益。肉類來源鑒別的傳統(tǒng)方法是依靠感官評價和肉類形態(tài)學手段，但這些已遠不能滿足監(jiān)管部門對肉制品摻雜、摻假現(xiàn)象的監(jiān)控，因此加強肉類產(chǎn)品中動物源性成分的檢測技術(shù)研究意義重大。

隨著分子生物學技術(shù)的不斷發(fā)展，以DNA為基礎(chǔ)的聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)以其獨特的優(yōu)勢被越來越多地應(yīng)用于畜禽肉源性成分的鑒別，并已逐步成為肉類產(chǎn)品中動物源性成分鑒定的核心方法[1-4]。近年來，實時熒光定量PCR技術(shù)憑借其特異性良好、自動化程度高、檢測周期短以及擴增目的片段較小等優(yōu)勢在動物源性成分鑒別中成為研究熱點，極大地提高了動物源性成分定性檢測的效率和靈敏度[5-6]。林彥星等[7]根據(jù)鴨mt DNA Cox基因保守序列設(shè)計特異性引物和Taq Man探針，建立了畜禽肉制品中鴨源性成分的熒光定量PCR檢測方法。孫晶瑩等[8]根據(jù)牛線粒體DNA片段設(shè)計合成了2 對特異性引物，以生牛肉、熟牛肉和牛肉制品為研究對象，建立了牛肉制品中牛源性成分的多重實時熒光PCR檢測方法。熒光定量PCR技術(shù)的絕對優(yōu)勢使其能夠?qū)崿F(xiàn)樣品的定量檢測，并且能夠簡化實驗步驟，可以同時實現(xiàn)對目標片段的定性和定量檢測，但由于其靈敏度較高，檢測結(jié)果易產(chǎn)生假陽性，因此對實驗室條件和檢驗人員的要求較高。

動物線粒體基因組序列具有高度物種特異性、拷貝數(shù)多以及在食品加工過程中未完全降解等特點，是進行動物源性成分鑒別的良好靶基因[9-11]。近年來陸續(xù)報道了一些基于12S rRNA[12]、Cyt b[13]等序列的線粒體基因片段進行肉品中動物源性成分鑒別的方法，但所用到的動物品種相對較少。為進一步完善畜禽肉中雞源性成分的檢測技術(shù)，本研究擬選擇線粒體DNA COⅠ基因為靶基因，根據(jù)羊、牛、豬、兔、鴿、鵪鶉、雞、鴨、鵝9 種動物COⅠ基因的差異位點設(shè)計、篩選雞特異性引物，建立基于常規(guī)PCR和熒光定量PCR技術(shù)的畜禽肉中雞源性成分的快速鑒別方法，為肉制品的摻雜識別提供依據(jù)。endprint

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮的羊肉、牛肉、豬肉、兔肉、鴿肉、鵪鶉肉、雞肉、鴨肉、鵝肉 揚州市邗江區(qū)竇莊農(nóng)貿(mào)市場；火

腿腸 金鑼集團有限公司；臘雞腿 上海萬有全集團有限公司。

基因組DNA抽提試劑盒 北京天根生化科技有限公司；

2×PCR Mix 南京博爾迪公司；電泳上樣緩沖液

寶生物工程（大連）有限公司；瓊脂糖 美國Promega公司；熒光染料預(yù)混液：AceQ qPCR SYBR Green Master Mix 南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BioPhotometer Plus核酸蛋白檢測儀、5331 PCR儀 德國Eppendorf公司；7500實時熒光PCR擴增儀 美國ABI公司；GBox凝膠成像分析系統(tǒng) 基因有限公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取

將9 種動物肉樣分別攪碎至肉糜狀，備用。使用Beyotime基因組DNA小量抽提試劑盒提供的蛋白酶K法提取各樣本的DNA。經(jīng)核酸蛋白檢測儀測定，9 種動物肉樣的DNA模板質(zhì)量濃度在110～210 ng/μL之間，其中雞肉為174.57 ng/μL。

1.3.2 引物設(shè)計與合成

以Genbank上公布的羊、牛、豬、兔、鴿、鵪鶉、雞、鴨、鵝的線粒體DNA COⅠ基因序列為靶基因，通過Arraydesigner 2.0、Oligo 6.0和Primer Premier 5.0軟件進行比對分析，設(shè)計合成雞特異性引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司負責合成，引物序列、DNA熔解溫度（melting temperature，Tm）、PCR擴增片段大小和產(chǎn)物序列如表1所示。

1.3.3 常規(guī)PCR擴增與測序

20 μL反應(yīng)體系：2×PCR Mix 10 μL、10 μmol/L正向引物和反向引物各0.2 μL、模板1 μL、雙蒸滅菌水8.6 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，30 個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后用15 g/L瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進行檢測，電泳結(jié)束后割膠回收、純化，交由上海華大基因科技有限公司進行雙向測序，將測序結(jié)果與GenBank上的已知序列進行比對。

1.3.4 熒光定量PCR擴增

15 μL反應(yīng)體系：Mix 7.5 μL、染料（Dye）0.3 μL、1 μmol/L正向引物和反向引物各0.5 μL、模板1 μL、雙蒸滅菌水5.2 μL。反應(yīng)條件：50 ℃酶激活2 min，95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃延伸1 min，40 個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，觀察各動物模板DNA的擴增曲線及循環(huán)閾（cycle threshold，Ct）值，判定引物的特異性。若無典型擴增曲線且Ct值大于35，則檢測體系無特異性擴增。

1.3.5 靈敏度實驗

將DNA模板分別稀釋101～108 倍，測定方法的靈敏度，反應(yīng)條件同1.3.3和1.3.4節(jié)。

1.3.6 實際樣品檢測

隨機抽取市售火腿腸和臘雞腿作為樣品，利用本研究建立的方法進行檢測。

1.4 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用7500實時熒光PCR擴增儀自帶軟件對PCR擴增產(chǎn)物進行高分辨率熔解曲線分析，確定擴增產(chǎn)物的Tm值和熔解曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 常規(guī)PCR擴增結(jié)果

由圖1可知，用雞特異性引物分別與不同動物的DNA模板進行擴增時，僅雞的DNA模板擴增出195 bp的條帶，而其他物種的DNA模板無擴增。由圖2可知，將雞的DNA模板按10倍梯度進行稀釋，當稀釋倍數(shù)達104，即DNA模板質(zhì)量濃度為17.457 pg/μL時仍有特異性條帶出現(xiàn)，表明檢測靈敏度達到pg級。

2.2 熒光定量PCR擴增結(jié)果

以設(shè)計篩選的雞特異性引物作為引物，以9 種動物的肌肉DNA為模板，進行熒光定量PCR擴增檢測。由圖3及表2可知，只有雞的肌肉DNA模板出現(xiàn)了典型擴增曲線，且Ct值為21.78，而其他動物的肌肉DNA模板均未出現(xiàn)典型擴增曲線。

2.3 熒光定量PCR的靈敏度檢測

將雞的DNA模板分別稀釋101～108 倍，采用2 種體積的引物（上、下游引物濃度均為10 μmol/L）進行方法的靈敏度檢測，確定方法的檢測下限。由圖4～5及表3可知，當引物體積為0.05 μL時，稀釋103 倍的雞DNA模板有典型擴增曲線，且Ct值小于35，此時雞DNA模板質(zhì)量濃度為175 pg/μL；當引物體積為0.20 μL時，稀釋104 倍的雞DNA模板有典型擴增曲線，且Ct值小于35，此時雞DNA模板質(zhì)量濃度為17.5 pg/μL。表明所建立的熒光定量PCR方法靈敏度較高，達到pg級。

2.4 實際樣品測定

對大、中型超市和農(nóng)貿(mào)市場的相關(guān)樣品進行抽檢，火腿腸及臘雞腿肉樣品均通過優(yōu)化后的十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyltrimethy ammonium bromide，CTAB）法[14]進行DNA提取。由表4可知，標識主要原料肉為雞肉的火腿腸和臘雞腿中檢測出雞源性成分，而標識主要原料肉為豬肉和牛肉的火腿腸中未檢測出雞源性成分，表明該方法可以用于畜禽肉與肉制品中雞源性成分的快速、有效檢測。

3 討 論

近年來，肉類摻假等食品安全事件屢屢發(fā)生，建立畜禽肉中動物源性成分的快速鑒別技術(shù)顯得尤為重要[15-17]。目前我國肉類摻假識別方面的技術(shù)相對落后，肉類制品摻假的定量檢測方法和相關(guān)國家標準仍為空白[18]。隨著人們對食品安全的日益重視以及分子生物學等技術(shù)的飛速發(fā)展，動物源性成分的多種檢測技術(shù)相繼涌現(xiàn)[3，19]，其中以核酸檢測為基礎(chǔ)的食品中肉類成分的鑒別與分析技術(shù)已逐漸成熟[20-21]。endprint

熒光定量PCR技術(shù)近年來迅速發(fā)展，具有簡單、快速、靈敏度和準確性高等優(yōu)點，不僅可以提高肉與肉制品中動物源性成分定性檢測的準確性，而且使得定量檢測成為可能，應(yīng)用前景非常廣闊[22-24]。齊春萌等[25]根據(jù)鴕鳥線粒體細胞色素C氧化酶亞基Ⅰ（COXⅠ）基因序列設(shè)計特異性引物和Taq Man探針，建立了肉制品中鴕鳥源性成分的實時熒光PCR鑒定方法。許如蘇等[26]基于馬的種屬保守序列設(shè)計特異性引物和Taq Man-LNA探針，建立了可快速檢測肉制品中馬源性成分的Taq Man-LNA熒光PCR檢測方法。馮震等[27]以線粒體細胞色素b（cytochrome b，Cytb）基因的核苷酸序列為檢測靶點，設(shè)計并優(yōu)化引物，建立了基于熒光定量PCR技術(shù)的生鮮肉中牛、羊源性成分的檢測方法，并對方法的特異性和靈敏度進行了驗證。

目前，有關(guān)畜禽肉中雞源性成分檢測方法的研究報道相對較少，而且已有報道中涉及到的動物種類較少[28-29]。

本研究根據(jù)羊、牛、豬、兔、鴿、鵪鶉、雞、鴨、鵝9 種動物線粒體DNA COⅠ基因序列的位點差異設(shè)計雞特異性引物，進行常規(guī)PCR和熒光定量PCR擴增檢測。結(jié)果表明，所選定的引物對只有在雞模板DNA存在的情況下才會發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生特異性擴增條帶和擴增曲線，而與羊、牛、豬、兔、鴿、鵪鶉、鴨、鵝8 種動物的DNA模板均無反應(yīng)，可見所設(shè)計篩選的引物特異性較好，可以用于畜禽肉中雞源性成分的快速、準確檢測。該方法的建立不僅可以完善我國肉與肉制品中雞肉摻假的定量檢測方法，也為打擊肉類產(chǎn)品的摻雜、摻假等違法違規(guī)行為提供了技術(shù)保障，對于政府部門的監(jiān)督管理工作具有極其重要的意義。

4 結(jié) 論

本研究以線粒體DNA COⅠ基因為靶基因，設(shè)計篩選出了雞特異性引物，采用常規(guī)PCR和實時熒光定量PCR技術(shù)建立了畜禽肉中雞源性成分的快速、準確定量分析方法，方法特異性較好，靈敏度較高，可達pg級。

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