孫笑笑，王科，張彥

(1.無錫市第三人民醫(yī)院，江蘇 無錫　214041；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院，重慶　402160；3.重慶醫(yī)科大學(xué)，重慶　400016)

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長鏈非編碼RNA Linc00461干擾慢病毒的構(gòu)建與鑒定

孫笑笑1，王科2，張彥3

(1.無錫市第三人民醫(yī)院，江蘇 無錫214041；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院，重慶402160；3.重慶醫(yī)科大學(xué)，重慶400016)

摘要：目的制備shRNA干擾人長鏈非編碼RNA Linc00461的慢病毒載體(shRNA-Linc00461)，為進(jìn)一步深入研究長鏈非編碼RNA的功能奠定基礎(chǔ)。方法利用在線干擾設(shè)計(jì)網(wǎng)頁進(jìn)行干擾引物設(shè)計(jì)，根據(jù)小干擾RNA的設(shè)計(jì)原則，選取三對針對Linc00461特異性干擾引物送公司合成。合成的片段連接到慢病毒載體質(zhì)粒pSIH1-H1，形成pSIH1-H1-shRNA-Linc00461質(zhì)粒。用PCR及測序?qū)ζ溥M(jìn)行鑒定，之后與慢病毒包裝質(zhì)?；靹?，由脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞進(jìn)行包裝，產(chǎn)生慢病毒shRNA-Linc00461，收集上清液使其感染乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞，通過RT-PCR鑒定重組慢病毒干擾效果。并選取干擾效果最好的Linc00461感染MDA-MB-231細(xì)胞，運(yùn)用MTT和流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞增殖和周期的改變。結(jié)果SIH1-H1-shRNA Linc00461質(zhì)粒經(jīng)PCR驗(yàn)證和測序后，證實(shí)其構(gòu)建成功。shRNA-Linc00461在HEK293T細(xì)胞中重組成慢病毒，并成功感染MDA-MB-231，感染效率約為70%。shRNA-Linc00461感染乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞后Linc00461的表達(dá)下調(diào)65.32%； 感染shRNA-Linc00461第3天MTT 結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組吸光度值(0.232±0.032)明顯低于實(shí)驗(yàn)對照組(0.398±0.037)。流式結(jié)果提示實(shí)驗(yàn)組G2M 期細(xì)胞(47.55±5.063)%高于實(shí)驗(yàn)對照組(8.876±3.565)%。結(jié)論成功構(gòu)建了shRNA-Linc00461慢病毒載體，并能有效抑制Linc00461表達(dá)，為深入研究人Linc00461基因功能奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：RNA,小分子干擾;乳腺腫瘤;慢病毒屬

在女性惡性腫瘤中，最常見的是乳腺癌，占第一位。其中中青年婦女乳腺癌的發(fā)病率呈逐年上升狀態(tài)[1]。乳腺癌是一個多基因多因素參與的復(fù)雜性疾病,病理機(jī)制極其復(fù)雜，乳腺癌的診斷目前主要是依據(jù)蛋白類腫瘤標(biāo)志物的篩查和影像學(xué)檢查。一般乳腺癌病人發(fā)現(xiàn)的時候很多都是中晚期，臨床治療上有很大的難度，所以對于乳腺癌來說，做到早期發(fā)現(xiàn)早期治療顯得尤為重要。乳腺癌的發(fā)生往往是由遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的，近年來，在遺傳研究方面,全基因組關(guān)聯(lián)研究(genome-wide association studies,GWAS)和基于候選基因的單核苷酸基因多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphisms,SNPs)關(guān)聯(lián)研究找到一些與乳腺癌相關(guān)的遺傳變異[2]。研究者發(fā)現(xiàn)表觀遺傳學(xué)在乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制中發(fā)揮著極其重要的作用。

長鏈非編碼RNA lncRNA(long non-coding RNA) 是一類長度大于 200 nts且不編碼蛋白質(zhì)的RNA分子。lncRNA能通過形成復(fù)雜的二級甚至更高級結(jié)構(gòu)來發(fā)揮多種生物學(xué)功能。lncRNA在生物體中可通過與DNA、RNA或蛋白質(zhì)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后或表觀遺傳學(xué)水平發(fā)揮一定的調(diào)節(jié)作用。近來研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA作為一種表觀遺傳修飾類型，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用[3]。最近報(bào)道LncRNA UCA1在膀胱癌組織中呈現(xiàn)表達(dá)上調(diào)，過表達(dá)UCA1可以促進(jìn)BLS-211細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移現(xiàn)象，王帆等人在卵巢癌SKOV3細(xì)胞中過表達(dá)UCA1能促進(jìn)其侵襲、遷移而且這種現(xiàn)象與MMP2和MMP9的表達(dá)上調(diào)有關(guān)[4]。王銘輝課題組發(fā)現(xiàn)lncRNA HOTAIR在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)明顯升高，HOTAIR表達(dá)與食管鱗狀細(xì)胞癌的臨床分期、浸潤深度、有無淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移及其分化程度密切相關(guān)[5]。另有研究報(bào)道SChLAP1 能夠通過拮抗具有腫瘤抑制作用的 SWI/SNF 復(fù)合體來促進(jìn)前列腺癌的浸潤和轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致前列腺癌相關(guān)死亡率升高。lncRNAs-uc001lsz 的表達(dá)與胃癌的 TNM 分期具有較高的關(guān)聯(lián)性，可作為胃癌早期診斷的潛在生物學(xué)指標(biāo)。

課題前期研究發(fā)現(xiàn)Linc00461在乳腺癌中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，那么Linc00461在乳腺癌中是否發(fā)揮著一定的作用呢？Linc00461的升高是否會影響著乳腺癌細(xì)胞的增殖和周期的改變呢？為此，課題通過靶向RNA干擾技術(shù)研究Linc00461在乳腺癌中的具體作用。

1　材料與方法

1.1材料pSIH1-H1質(zhì)粒(美國SBI公司)；乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞(中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫)；STBL-3菌種、HEK293T細(xì)胞(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院分子醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室)；Trizol，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒，L15培養(yǎng)基(Life公司)；試驗(yàn)中所用引物，普通PCR和DNA連接試劑盒(大連寶生物技術(shù)有限公司)；限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、EcoRⅠ和T4連接酶(New England Biolab公司)；質(zhì)粒小抽試劑盒和DNA純化試劑盒(Omega公司),逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega公司)。

1.2方法

1.2.1shRNA干擾LINC00461引物和陰性對照引物的獲得將人Linc00461的mRNA基因(GenBank序列號為NR_015436.1)mRNA區(qū)輸入至Life RNA在線設(shè)計(jì)干擾網(wǎng)頁中，按照小干擾RNA的設(shè)計(jì)原則，選取三對干擾引物作為實(shí)驗(yàn)組，同時設(shè)計(jì)一對完全隨機(jī)引物作為陰性干擾對照組，將選取的干擾引物按照shRNA的構(gòu)成原則，中間以TCAAGAG為頸環(huán)結(jié)構(gòu)。兩端添加BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位點(diǎn)。合成的DNA分別命名為shRNA-Linc00461的和shRNA-Negtive。表1。

表1　 shRNA Linc00461干擾序列設(shè)計(jì)

1.2.2干擾質(zhì)粒PCR驗(yàn)證引物的設(shè)計(jì)Linc00461干擾質(zhì)粒PCR驗(yàn)證引物上游5’AATGTCTTTGGATTTGGGAATCTTAT-3’;下游5’-TGGTCTAACCAGAGAGACCCAGTA-3’，未插入干擾片段質(zhì)粒擴(kuò)增長度105 bp，插入干擾片段后質(zhì)粒擴(kuò)增長度為161 bp,Linc00461PCR 上游引物：5’-GCGTGGACTACTCTGATG-3’下游引物：5’-CACCCAAGTGCTTACTGTCT-3’擴(kuò)增長度192 bp;GAPDH上游引物：5’-CAGCGACACCCACTCCTC-3’,下游引物：5’-TGAGGTCCACCACCCTGT -3’擴(kuò)增長度122 bp。

1.2.3shRNA-LINC00461和shRNA-Negtive基因與載體pSIH1-H1的連接BamHⅠ和EcoRⅠ酶切pSIH1-H1質(zhì)粒，酶切產(chǎn)物經(jīng)純化后與DNA連接試劑盒連接，shRNA-Linc00461基因連接產(chǎn)物命名為pSIH1-H1-shRNA-Linc00461，shRNA-Negtive基因連接產(chǎn)物命名為pSIH1-H1-shRNA-Negtive。

1.2.4pSIH1-H1-shRNA-LINC00461和pSIH1-H1-shRNA-Negtive質(zhì)粒的鑒定以上連接產(chǎn)物經(jīng)Cacl2化轉(zhuǎn)入STBL-3菌，接種于LB平板，37℃培養(yǎng)過夜后挑取單個菌落增菌培養(yǎng)12 h后提質(zhì)粒，取5 μL菌落進(jìn)行PCR鑒定， 取10 μL送南京金斯瑞有限公司進(jìn)行測序。

1.2.5shRNA干擾慢病毒(shRNA-Linc00461和shRNA-Negtive)的包裝將測序正確的干擾質(zhì)粒和慢病毒包裝質(zhì)粒按慢病毒包裝質(zhì)粒試劑盒混勻，并將以上產(chǎn)物與Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染入HEK293T細(xì)胞，37℃，5%CO2培養(yǎng)，適時觀察熒光表達(dá)量， 48 h后離心，收集上清至無菌EP管備用。

1.2.6重組干擾慢病毒在MDA-MB-231中干擾效果的測定收集包含病毒顆粒的培養(yǎng)液加入到MDA-MB-231中，24 h后觀察慢病毒感染熒光的表達(dá)情況，并提取細(xì)胞總RNA。在RNA水平觀察干擾效果。

1.2.7慢病毒感染與熒光觀察MDA-MB-231細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%時加入慢病毒干擾顆粒。設(shè)空白對照組(MDA-MB-231)、GFP感染組、陰性對照感染組、慢病毒干擾組。加病毒24h后觀察各組的熒光表達(dá)情況。

1.2.8逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)Trizol法提取各組細(xì)胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,以cDNA為模板進(jìn)行PCR。反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,53 ℃退火30 s,72 ℃延伸20 s,共30個循環(huán);最后72 ℃延伸5 min。行瓊脂糖凝膠電泳后成像結(jié)果用Qunantity One軟件進(jìn)行分析,目的基因LncRNA相對表達(dá)量以目的基因條帶的灰度值/內(nèi)參條帶灰度值表示。

1.2.9MTT 檢測細(xì)胞增殖將前期感染慢病毒細(xì)胞及各對照組細(xì)胞，以5×106個/L 的密度接種于96 孔板中，每孔100 μL，每組設(shè)5 個平行孔，細(xì)胞培養(yǎng)1～5 d 后分別在酶聯(lián)免疫檢測儀上波長492 nm 處對各孔進(jìn)行吸光度(D)值的檢測。

1.2.10流式檢測細(xì)胞周期的改變收集慢病毒感染MDA-MB-231 后3天的各組細(xì)胞， 經(jīng)過消化，離心，洗滌，重懸后收集于1.5 mL EP 管中，上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。

2　結(jié)果

2.1shRNA-Linc00461和shRNA-Negtive的鑒定經(jīng)PCR初步驗(yàn)證后在200 bp左右有條帶，認(rèn)為連接成功(圖1)，送公司測序并將測序結(jié)果比對后，證明質(zhì)粒完全構(gòu)建成功，實(shí)驗(yàn)流程以shRNA-Linc00461-1構(gòu)建過程為例說明。

圖1　shRNA-Linc00461-1PCR檢測結(jié)果

2.2shRNA-Linc00461和shRNA-Negtive慢病毒在MDA-MB-231細(xì)胞中的感染情況將收集于EP管內(nèi)的病毒液(shRNA-Linc00461和shRNA-Negtive慢病毒)加入直徑為6 cm細(xì)胞密度為60%～80%的MDA-MB-231培養(yǎng)皿中，24 h后觀察細(xì)胞的熒光表達(dá)情況，鏡下可見熒光表達(dá)量約為70%(圖2)。

圖2　 MDA-MB-231中加入shRNA-Linc0046-1、 shRNA-Negtive熒光表達(dá)情況(×100)

2.3shRNA-Linc00461和shRNA-Negtive在RNA水平的表達(dá)慢病毒感染MDA-MB-231后，24 h提取細(xì)胞總RNA，通過RT-PCR檢測linc00461干擾慢病毒的干擾效果。慢病毒感染24 h后，感染效率均約70%。RT-PCR顯示shRNA-Linc00461-1、shRNA-Linc00461-2和shRNA-Linc00461-3組細(xì)胞Linc00461 RNA 的表達(dá)較shRNA-Negtive組均有所降低(圖2)，分別降低了52.17%、56.37%和65.32%，由此可見shRNA-Linc00461-3的干擾效果最好，故選取shRNA-Linc00461-3用于做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。RT-PCR結(jié)果提示：干擾慢病毒載體構(gòu)建成功(圖3)。

注：1：shRNA-Negtive；2：shRNA-Linc00461-1；3：shRNA-Linc00461-2；4：shRNA-Linc00461-3。

圖3干擾慢病毒對Linc00461基因的沉默效果

2.4MDA-MB-231中干擾Linc00461的表達(dá)對細(xì)胞增殖和周期的影響慢病毒感染MDA-MB-231第3天，MTT 結(jié)果顯示：干擾組吸光度值(0.232±0.032)明顯低于實(shí)驗(yàn)對照組(0.398±0.037)，第5天，干擾組吸光度值(0.378±0.042)明顯低于實(shí)驗(yàn)對照組(0.631±0.047)(P<0.05)。慢病毒感染MDA-MB-231的第3天，細(xì)胞周期阻滯在G2M期，干擾組G2M 期細(xì)胞(47.55±5.063)%高于陰性對照組(8.876±3.565)%(P<0.05)。結(jié)果提示Linc00461參與了MDA-MB-231細(xì)胞的增殖及周期過程(圖4)。

注：(A)RT-PCR檢測shRNALinc00461的干擾效果，(B)干擾Linc00461對細(xì)胞增殖的影響，(C)干擾Linc00461對細(xì)胞周期的影響。

圖4 shRNALinc00461的干擾效果及干擾Linc00461后對MDA-MB-231增殖、周期的影響

3　討論

乳腺癌作為女性最常見的惡性腫瘤(全世界每年有大約50萬人死于乳腺癌)，是一個多基因多因素參與的復(fù)雜性疾病,病理機(jī)制極其復(fù)雜，越來越多的學(xué)者致力于乳腺癌發(fā)病機(jī)理的研究。近年來，研究者發(fā)現(xiàn)表觀遺傳學(xué)在乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著著重要作用[6-8]。

LncRNA作為一種重要表觀遺傳修飾類型，在許多腫瘤中存在異常的表達(dá)，是腫瘤發(fā)生的一類重要因素。目前，對LncRNA的研究尚處于起步階段，其可能的來源包括(1)蛋白質(zhì)編碼基因的結(jié)構(gòu)中斷；(2)染色質(zhì)重組；(3)非編碼基因通過逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子進(jìn)行復(fù)制的產(chǎn)物；(4)非編碼 RNA 發(fā)生相鄰的串聯(lián)復(fù)制；(5)基因組中轉(zhuǎn)座因子的插入產(chǎn)生功能性非編碼 RNA[9-10]。研究發(fā)現(xiàn)含有端粒重復(fù)單元的 RNA 序列與乳腺癌細(xì)胞的無限增殖能力相關(guān)；BCAR4與乳腺癌內(nèi)分泌治療雌激素抵抗相關(guān)；HOTAIR 的表達(dá)量可作為預(yù)測乳腺癌轉(zhuǎn)移及預(yù)后的有效指標(biāo)；LOC554202可以通過啟動子甲基化影響下游基因而調(diào)控乳腺癌的轉(zhuǎn)移；抑制ARA的表達(dá)可以降低乳腺癌化療中阿霉素的耐藥耐藥率[11]。張霞等人通過lncRNAs 表達(dá)譜也找到一些與乳腺癌密切相關(guān)的長鏈非編碼RNA[12]，而且有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA SPRY4-IT1可通過上調(diào)乳腺癌基因ZNF703表達(dá)來促進(jìn)乳腺癌增殖[13]。H19 高表達(dá)影響細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)移[14-15]，LSINCT5 高表達(dá)可增加乳腺癌細(xì)胞增殖能力[16]，而對于Linc00461，國內(nèi)罕有報(bào)道，有學(xué)者認(rèn)為它與抑郁癥相關(guān)，我們前期探索發(fā)現(xiàn)Linc00461在乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)廣泛，Linc00461可能參與乳腺癌惡性轉(zhuǎn)化過程。隨后通過SBI公司第四代慢病毒包裝系統(tǒng)，利用干擾在線設(shè)計(jì)網(wǎng)頁，設(shè)計(jì)三對針對Linc00461的短發(fā)卡RNA，并成功包裝成干擾慢病毒。經(jīng)RT-PCR發(fā)現(xiàn)三對短發(fā)卡RNA對Linc00461均有干擾效果，shRNA-Linc00461-1(52.17%)、shRNA-Linc00461-2(56.37%)和shRNA-S Linc00461-3(65.32%)，shRNA-Linc00461-3干擾效果最好。干擾慢病毒感染MDA-MB-231細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)其增殖能力明顯減弱，細(xì)胞周期檢測顯示細(xì)胞G2M期增多，表現(xiàn)為G2M期阻滯，初步證實(shí)Linc00461在乳腺癌增殖中的作用。

Linc00461干擾慢病毒的成功構(gòu)建為后續(xù)研究Linc00461功能做了良好的鋪墊，進(jìn)而可深入研究Linc00461在乳腺癌中的作用機(jī)制，為乳腺癌的治療尋找新的靶點(diǎn)新的思路。

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基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金(81172017)；重慶市教委課題(KJ1500202)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.07.021

(收稿日期：2016-04-20，修回日期：2016-05-09)

Construction and identification of recombinant lentivirus vector interferring the expression of long non coding RNA Linc00461

SUN Xiaoxiao1,WANG Ke2,ZHANG Yan3

(1.WuxiNo.3People’sHospital,Wuxi,Jiangsu214041,China;2.YongchuanAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing402160,China;3.ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China)

Abstract:ObjectiveTo construct the recombinant lentivirus vector interfering human Linc00461 gene for its further research.MethodsShort hairpin RNA(shRNA) targeting Linc00461 gene was designed and DNA template was synthesized and subcloned into the Lentivirus expression plasmid pSIH1-H1.The recombinant plasmid pSIH1-H1-shRNA-Linc00461 was confirmed by PCR and gene sequencing.Then pSIH1-H1-Linc00461 and Lentiviral packaging plasmid was transfected into HEK293 cells for packaging by liposome.And supernatant culture medium was collected to infect MDA-MB-231 breast cancer cells.shRNA-Linc00461 was identified by RT-PCR.Breast cancer cells MDA-MB-231 were transfected with shRNA-Linc00461 and the cells proliferation and change cell cycle were detected by MTT and FCM.ResultsThe recombinant Lentivirus expression plasmid pSIH1-H1-shRNA-Linc00461 was successfully constructed.The recombinant Lentivirus vector shRNA-Linc00461 could be packaged in HEK293T and infected MDA-MB-231 successfully.The expression of Linc00461 gene was reduced by 65.32% when the breast cancer MDA-MB-231 cells were infected by shRNA-Linc00461.MTT assay showed that cell proliferation capacity decreased from (0.5780±0.047)to(0.432±0.042) and blocked cell cycle in G2M Phase was(47.55±5.063)%,higher than(8.876±3.565)% in control group.ConclusionsThe recombinant Lentivirus vector interfering Linc00461 gene was successfully constructed and inhibited the expression of Linc00461,which laid foundation for further research of Linc00461.

Key words:RNA,Small Interfering;Breast Neoplasms;Lentivirus