崔亞杰，張培蓮，盧天捷，黃喜英，呂淑蘭

(1.西安市第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西 西安 710002；2.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科,陜西 西安 710061)

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西安地區(qū)宮頸病變婦女人乳頭瘤病毒感染狀況及基因型別分析

崔亞杰1，張培蓮1，盧天捷1，黃喜英1，呂淑蘭2

(1.西安市第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西 西安 710002；2.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科,陜西 西安 710061)

[摘要]目的回顧性分析西安地區(qū)宮頸病變婦女人乳頭瘤病毒(HPV)感染狀況及基因型別，為宮頸病變的防治提供臨床資料和依據(jù)。方法收集2010年1月至2013年12月在西安市第一醫(yī)院及陜西友誼檢驗中心病理診斷為宮頸癌和宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)的450例女性宮頸組織石蠟標(biāo)本，應(yīng)用Hybrimax基因芯片導(dǎo)流雜交技術(shù)對標(biāo)本進(jìn)行HPV基因型分型檢測。比較宮頸癌及不同級別宮頸上皮內(nèi)瘤變組HPV感染狀況及基因型別并進(jìn)行分析。結(jié)果①低度、高度宮頸上皮內(nèi)瘤變及宮頸癌組織中均存在高危型HPV感染，20～29歲年齡組常存在低危型HPV感染，感染率為20%，χ2=29.98，P<0.0001，與其他年齡組有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異；②HPV感染的高危型主要是16、58、18、31，低危型主要是11、43、42、6、44。結(jié)論HPV感染基因型別在不同宮頸病變中有不同表現(xiàn)，高危型HPV持續(xù)感染是宮頸癌及宮頸上皮內(nèi)瘤變發(fā)生發(fā)展的必要條件。

[關(guān)鍵詞]宮頸上皮內(nèi)瘤變；宮頸癌；人乳頭瘤病毒；基因亞型

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)常見惡性腫瘤，在發(fā)展中國家，宮頸癌發(fā)病率在女性惡性腫瘤中居第1位。資料顯示，每年全世界大約有50萬人患宮頸癌，其中約30萬左右患者死亡，發(fā)展中國家占80%；近年來宮頸癌發(fā)生有年輕化趨勢，在我國每年約有10萬新發(fā)病例，是世界宮頸癌新發(fā)病例的四分之一。已知人乳頭瘤病毒( human papillomavirus，HPV)感染是宮頸癌發(fā)生的確切病因。目前已知的HPV亞型有100余種，其中人類生殖道可感染30多種亞型并導(dǎo)致宮頸病變。不同地域性研究資料表明，全球HPV感染的最主要型別是HPV-16，而其他亞型的感染率存在著較大的地域差異,通過對以下資料分析，研究西安地區(qū)不同HPV基因型別感染與宮頸病變的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1研究對象

1.2實驗方法

主要應(yīng)用PCR體外擴(kuò)增和DNA反向雜交的DNA芯片技術(shù)。首先依據(jù)HPV的基因特點(diǎn)設(shè)計出特異引物，并應(yīng)用PCR體外擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增出23種HPV基因型的目標(biāo)片段，之后將擴(kuò)增產(chǎn)物與固定在膜條上的23種HPV基因型的分型探針進(jìn)行雜交，并根據(jù)雜交信號來判斷是HPV基因型的存在。其中檢測的23種HPV基因型分別包括高危型18種(HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、MM4、73、83)和低危型5種(HPV6、11、42、43、44)。使用基因芯片技術(shù)可對HPV DNA進(jìn)行分型診斷，還可判斷多重感染。

1.2.1組織DNA的提取

將新鮮組織剪成大約1mm×3mm的組織塊，切取4mm厚度組織片4張，取病灶點(diǎn)，去石蠟，放入1.5mL滅菌離心管中，加入裂解液，沸水浴加熱10分鐘，13000rpm離心10分鐘，留上清液待用。

1.2.2 PCR擴(kuò)增

取提取液5μL加入內(nèi)有PCR反應(yīng)液20μL的反應(yīng)管中，低速離心，避免污染，設(shè)置陽性和陰性質(zhì)控，共40個循環(huán)。

1.2.3雜交

書包除了實用以外，其安全性能也應(yīng)該受到大家的關(guān)注。為了讓同學(xué)們在上學(xué)放學(xué)的路上更安全，許多書包上添加了新型的多角度反光條。無論是步行還是騎車，書包上的反光條被光照射后都能反光，發(fā)出醒目的警示信號，有效地警告和提示50～100米外的過往車輛注意行人。

取15mL塑料離心管，放入標(biāo)有樣本編號的膜條、PCR產(chǎn)物25μL及A液5mL，將離心管放入沸水浴中加熱10分鐘后取出，放入雜交箱51℃雜交1.5小時。50mL塑料離心管，加入50mL B液，放入雜交箱內(nèi)預(yù)熱至51℃待用。

1.2.4洗膜

取出膜條，將膜條置入裝有50mL B液的離心管內(nèi)，51℃輕搖洗滌5分鐘。

1.2.5顯色

配制孵育液，室溫輕搖孵育30分鐘；A液搖洗2次，每次5分鐘；C液室溫洗膜1～2分鐘；配顯色液，膜條浸入避光顯色至少30分鐘；去離子水浸泡后，觀察結(jié)果。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

運(yùn)用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，對于多型感染，需對各亞型的檢出率重復(fù)計算。對于HPV感染率的差異比較采用卡方檢驗，P<0.05表示差別有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 人乳頭瘤病毒感染在不同年齡段及宮頸病變中的分布

CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ及宮頸癌組織中高危型HPV感染率為100%。20～29歲年齡組常合并低危型HPV感染，感染率為20 %，明顯高于其他年齡組(χ2=29.98，P<0.05)。HPV感染在不同年齡段及宮頸病變中的分布見表1。

表1　HPV感染在不同年齡段及宮頸病變中的分布情況[n(%)]

2.2高危型人乳頭瘤病毒感染在宮頸病變病例中的基因型別

在不同宮頸病變中常見高危型HPV感染的基因型別有所不同，CINⅠ常見的HPV型別主要是：16(20%)、58(12%)、51(10%)；CIN Ⅱ是16(25%)、31(17%)、33(15%)；CIN Ⅲ是16(36%)、52(15%)、31(10%)；宮頸癌是16(80%)、18(11%)、52(5%)；宮頸癌中HPV16感染率明顯高于CIN，有統(tǒng)計學(xué)差異，P<0.05。高危型HPV感染在宮頸病變病例中的基因型別見表2。

表2高危型HPV感染在宮頸病變中的基因型別比例[n(%)]

Table 2　Proportion of genotype in cervical lesions with high-risk HPV infection[n(%)]

3討論

3.1宮頸病變合并人乳頭瘤病毒感染與年齡的關(guān)系

本研究資料顯示宮頸上皮內(nèi)瘤變好發(fā)年齡為30～49歲之間，宮頸癌好發(fā)年齡為40～59歲。低度、高度宮頸上皮內(nèi)瘤變及宮頸癌組織中均可見高危型HPV感染，說明高危型HPV感染與宮頸癌及CIN密切相關(guān)，研究結(jié)果與高危型HPV 感染是宮頸癌發(fā)生必要條件的觀點(diǎn)一致。20～29歲年齡組常合并低危型HPV感染，感染率為20%，明顯高于其他年齡組。王穎[1]研究表明20歲之前結(jié)婚宮頸癌發(fā)病率為1.58%；宮頸癌發(fā)病率21歲以后結(jié)婚者較20歲之前結(jié)婚者明顯下降，僅為后者的1/4，Zheng[2]研究發(fā)現(xiàn)性生活過早是宮頸癌發(fā)生的高危因素之一。說明HPV感染可能與性行為活躍及多個性伴侶有關(guān)，當(dāng)HPV感染呈持續(xù)狀態(tài)，宮頸癌的風(fēng)險也明顯增高。

3.2 人乳頭瘤病毒基因型別與不同宮頸病變的關(guān)系

HPV有200多種亞型，根據(jù)致病力的不同分為高危型和低危型2種[3]，在HPV的各亞型中已證實HPV16、18與宮頸癌的發(fā)病關(guān)系密切[4]，尤其伴淋巴轉(zhuǎn)移者檢出率較其他宮頸病變者明顯升高[5]。表明HPV16、18是宮頸癌發(fā)展過程中的關(guān)鍵因素。本研究表明在宮頸病變中，高危型HPV 感染的基因型別主要為：16、58、18。但HPV基因型別在不同宮頸病變中有不同表現(xiàn):CIN Ⅰ常見的HPV 型別主要是: 16、58、51；CIN Ⅱ是16、31、33；CIN Ⅲ是16、52、31；宮頸癌是16、18，與以往的研究結(jié)果一致。

3.3 人乳頭瘤病毒感染的地區(qū)差異及分布

多項研究顯示HPV 感染的亞型分布具有一定的地域性差異，歐洲地區(qū)以16、31、18型為主，南美地區(qū)以16、58、18型為主。我國HPV感染類型也呈現(xiàn)地區(qū)差異，中國南方地區(qū)52、58 亞型的感染率高于北方地區(qū)。廖秦平[6]報道北京地區(qū)婦女宮頸感染的主要亞型是HPV 52、58，并且該兩型之和高于16、18 亞型?；萘柙频萚7]報道西安地區(qū)HPV感染以16型、58型、35型、18型、6型為主。本資料中西安地區(qū)婦女宮頸病變中，高危型HPV 感染的基因型別主要是：16、58、18。本研究發(fā)現(xiàn)西安地區(qū)低度宮頸上皮內(nèi)瘤變常見的HPV基因型別主要是: 16、58；CIN Ⅱ是16、31； CIN Ⅲ 是16、52，宮頸癌常見的HPV基因型別主要是16、18。本研究發(fā)現(xiàn)：低度、高度宮頸上皮內(nèi)瘤變及宮頸癌組織中均可見HPV高危型感染，與高危型HPV感染是宮頸癌發(fā)生必要條件的觀點(diǎn)一致。但高危型感染率均為100%，這樣的研究結(jié)果可能與樣本量較小有關(guān)，在未來的研究工作，應(yīng)該增加樣本量，減小偏倚，從而證實這一研究結(jié)果。由于目前國際上還沒有公認(rèn)的治療HPV 感染的藥物，因此對HPV感染以預(yù)防為主。目前研究HPV疫苗成為熱點(diǎn)。但現(xiàn)已上市的HPV疫苗，僅對HPV16、18型感染有效，但HPV型別分布存在明顯的地區(qū)差異。本研究使用基因芯片技術(shù)對HPV DNA進(jìn)行分型診斷，同時進(jìn)行多重感染檢測，將為研制出適合西安地區(qū)的預(yù)防性HPV疫苗提供參考依據(jù)，也為我國的HPV疫苗研究提供數(shù)據(jù)資料。

3.4不同宮頸病變中人乳頭瘤病毒多重感染率

本研究表明不同宮頸病變中HPV多重感染率CIN Ⅰ40%，CIN Ⅱ和CIN Ⅲ 27.5%，宮頸癌22%。Lee等[8]認(rèn)為多重感染比單一型別感染者發(fā)生宮頸癌的危險性高。本資料顯示在高度CIN及宮頸癌的發(fā)病率中，單一感染和雙重以上感染兩組之間無明顯差別。

在西安地區(qū)，對于HPV 16、18、31、52、58 等高危亞型感染的患者要做到密切隨訪，以便及時發(fā)現(xiàn)病變并給予干預(yù)，但也應(yīng)合理分析其導(dǎo)致高度宮頸上皮內(nèi)瘤變和宮頸癌的風(fēng)險，避免過頻的復(fù)查和過度治療。

[參考文獻(xiàn)]

[1]王穎.宮頸癌發(fā)病相關(guān)因素的研究分析[J]實用預(yù)防醫(yī)學(xué),2014,21(3) : 345-347.

[2]Zheng J. Diagnostic value of MCM2 immunocytochemical staining in cervical lesions and its relationship with HPV infection [J]. Int J Clin Exp Pathol, 2015, 8(1): 875-880.

[3]McLaughlin-Drubin M E,Meyers J,Munger K.Cancer associated human papillomaviruses[J].Curr Opin Virol,2012,2(4):459-466.

[4]王朝暉,李玉中,宋麗媛，等.TSHR蛋白在宮頸癌的表達(dá)及其與HPV-16感染的關(guān)系[J].中國微生態(tài)學(xué)雜志,2013,25(11):1267-1269.

[5]Aguilar-Lemarroy A,Vallejo-Ruiz V,Cortés-Gutiérrez E I,etal.Human papillomavirus infections in Mexican women with normal cytology, precancerous lesions, and cervical cancer: type-specific prevalence and HPV coinfections[J].J Med Virol,2015,87(5):871-884.

[6]廖秦平.要真正理解和重視人乳頭瘤病毒感染[J].中國實用婦科與產(chǎn)科雜志,2010,26(5):321-323.

[7]惠凌云,王亞文,馮艾,等.西安市1 650例已婚婦女宮頸細(xì)胞HPV感染調(diào)查分析[J].中國婦幼健康研究,2012,23(6):738-741.

[8]Lee S A,Kang D,Seo S S,etal.Multiple HPV infection in cervical cancer screened by HPVDNAChip[J]. Cancer Lett, 2003,198(2):187-192.

[專業(yè)責(zé)任編輯：安瑞芳]

[收稿日期]2016-01-13

[基金項目]陜西省社會發(fā)展科技攻關(guān)資助項目(項目編號：2015SF185)。

[作者簡介]崔亞杰(1974-)，女，副主任醫(yī)師，碩士研究生，主要從事婦科腫瘤的研究。

[通訊作者]呂淑蘭，教授。

doi:10.3969/j.issn.1673-5293.2016.07.011

[中圖分類號]R711.74

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

[文章編號]1673-5293(2016)07-0819-03

Study on genotypes and infection of human papillomavirus in cervical lesions of women in Xi’an area

CUI Ya-jie1, ZHANG Pei-lian1, LU Tian-jie1, HUANG Xi-ying1, LYU Shu-lan2

(1.Department of Obstetrics and Gynecology, Xi’an First Hospital, Shaanxi Xi’an 710002, China;2. Department of Obstetrics and Gynecology, First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University, Shaanxi Xi’an 710061, China)

[Abstract]Objective To conduct a retrospective analysis of human papillomavirusm (HPV) infection status and genotypes of women with cervical lesions in Xi’an so as to provide clinical data and basis for prevention and treatment of cervical lesions. Methods Cervical tissue paraffin specimens of 450 cases of cervical cancer and cervical intraepithelial neoplasia (CIN) were collected in Xi’an First Hospital and Shaanxi Youyi Inspect Center from January 2010 to December 2013. Hybrimax flow-through hybridization technique was used to detect HPV genotype of the specimens. HPV infection and genotype were compared among cases of cervical cancer or different grades of CIN. Results There was high-risk HPV infection in cases of CIN and of cervical cancer. Low-risk genotypes of HPV infection was often observed in 20-29 aged cases, and the rate was 20% (χ2=29.98,P<0.0001). There was significant difference from that of other aged cases. The high-risk genotypes of HPV infection majored in 16, 58, 18 and 31, while the low-risk genotypes mainly were 11, 43, 42, 6 and 44. Conclusion HPV genotypes have different clinical features in case with different cervical lesions. High-risk HPV infection is a necessary condition for cervical cancer and CIN development.

[Key words]cervical intraepithelial neoplasia (CIN); cervical cancer; HPV; genotype