李　艷，景　瑋，馬　彪，李新毅

?

遠(yuǎn)志總皂苷對(duì)癲癇模型大鼠NMDA 受體表達(dá)的影響

李艷1，景瑋1，馬彪2，李新毅1

1.山西醫(yī)科大學(xué)附屬山西大醫(yī)院(太原 030001)；2.山西省晉中市第一人民醫(yī)院

摘要：目的觀察遠(yuǎn)志總皂苷(Tenuigenin，TEN)對(duì)癲癇模型大鼠N-甲基-D天門冬氨酸(NMDA)受體表達(dá)的影響，探討TEN對(duì)癲癇繼發(fā)認(rèn)知障礙干預(yù)作用的機(jī)制。方法32只雄性Wistar大鼠，隨機(jī)分為對(duì)照組(8只)、模型組(12只)、遠(yuǎn)志總皂苷防治組(12只)。采用腹腔注射戊四氮(PTZ)溶液制作癲癇大鼠模型，遠(yuǎn)志總皂苷防治組在腹腔注射戊四氮的同時(shí)給予灌服遠(yuǎn)志總皂苷，對(duì)照組分別注射及灌服等劑量的生理鹽水。采用免疫組化方法檢測(cè)大鼠海馬CA1區(qū)NMDA受體表達(dá)。結(jié)果模型組大鼠海馬CA1區(qū)NMDA受體平均灰度值顯著高于對(duì)照組，遠(yuǎn)志總皂苷防治組大鼠海馬CA1區(qū)NMDA受體平均灰度值顯著低于模型組。結(jié)論遠(yuǎn)志總皂苷可顯著提高癲癇模型大鼠海馬CA1區(qū)NMDA受體表達(dá)，這可能是其減輕癲癇繼發(fā)認(rèn)知障礙的部分機(jī)制。

關(guān)鍵詞：癲癇；遠(yuǎn)志總皂苷；海馬；NMDA受體

癲癇是由腦部神經(jīng)元高度同步異常放電而引起的腦功能障礙綜合征。目前，全世界有1%的人口受到此病的困擾，而我國(guó)癲癇患病率更是高達(dá)7%[1]。值得關(guān)注的是，30%～40%癲癇病人伴有不同程度的認(rèn)知功能受損[2]，成為影響病人生活質(zhì)量的一個(gè)重要因素。遠(yuǎn)志是我國(guó)傳統(tǒng)的安神益智良藥，遠(yuǎn)志的成分復(fù)雜，而其中的總皂苷是改善認(rèn)知的重要成分。有研究證明，遠(yuǎn)志總皂苷(Tenuigenin，TEN)可以在多個(gè)階段影響小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，關(guān)于遠(yuǎn)志總皂苷對(duì)學(xué)習(xí)記憶影響的膽堿能機(jī)制已有部分研究，但其對(duì)癲癇后N-甲基-D天門冬氨酸(NMDA)受體表達(dá)影響的研究尚不多見[3]。本實(shí)驗(yàn)采用腹腔注射PTZ溶液制作癲癇大鼠模型，通過免疫組化方法觀察大鼠海馬CA1區(qū)NMDA受體表達(dá)變化及遠(yuǎn)志總皂苷對(duì)其影響，探討TEN改善學(xué)習(xí)記憶功能的機(jī)制。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物32只雄性Wistar大鼠，體重為200 g～250 g，由北京海淀興旺動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)提供，室溫(25.5±2)℃喂養(yǎng)。

1.1.2藥品、試劑及實(shí)驗(yàn)儀器遠(yuǎn)志總皂苷，純度為72%，在山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心提取，取37.5 g溶于1 L的蒸餾水中，充分溶解后置于4℃環(huán)境保存；戊四氮(Pentylenetetrazole，PTZ)購(gòu)于Sigma公司，將其溶于生理鹽水配成1%的溶液(10 mg/mL)后置于4℃環(huán)境保存；腦立體定位儀購(gòu)于深圳瑞沃德公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1動(dòng)物分組及造模將32只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、遠(yuǎn)志總皂苷防治組(375 mg/kg)，對(duì)照組8只，模型組與遠(yuǎn)志總皂苷防治組各12只。模型組給予腹腔注射致驚厥劑量的PTZ(40 mg/kg)，注射時(shí)間為每日08：00～09：00，注射完觀察大鼠2 h，注意記錄發(fā)作次數(shù)和分級(jí)，每隔1 d稱大鼠體重進(jìn)行劑量調(diào)節(jié)，連續(xù)給藥28 d，停藥7 d，再以相同劑量點(diǎn)燃，以連續(xù)2次以上、4級(jí)以上發(fā)作視為造模成功，驚厥發(fā)作以Racine法分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷。遠(yuǎn)志總皂苷防治組在腹腔注射戊四氮的同時(shí)灌服遠(yuǎn)志總皂苷溶液(375 mg/kg)，給藥35 d，然后腹腔注射戊四氮點(diǎn)燃。對(duì)照組則給予生理鹽水灌胃及腹腔注射。

造模結(jié)果：對(duì)照組8只大鼠均存活，模型組大鼠由于癲癇發(fā)作死亡3只，未達(dá)點(diǎn)燃標(biāo)準(zhǔn)的1只，造模成功8只，遠(yuǎn)志總皂苷防治組大鼠癲癇發(fā)作死亡2只，未達(dá)點(diǎn)燃標(biāo)準(zhǔn)的1只，造模成功9只。

1.2.2切片制備經(jīng)以上處理后，大鼠經(jīng)7%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔麻醉，開胸腹充分暴露心臟和肝臟，剪開左側(cè)心尖部，將導(dǎo)管插入左心室并固定，同時(shí)剪開右心耳?？焖俟嘧⑸睇}水250 mL 左右至肝臟完全變白，待右心室流出澄清液體后，用40 mol/L 多聚甲醛固定液先快速再緩慢灌注100 mL左右至大鼠肝臟變硬，肢體僵直后斷頭，完整取出鼠腦并投入含4%的多聚甲醛中4℃固定4～6 h，脫水，透明，石蠟包埋。冠狀位連續(xù)海馬切片，切片厚度為4 μm。

1.2.3免疫組化染色采用SABC(Strept Actividin-Biotin Complex)免疫組化染色法，具體步驟如下：①石蠟切片常規(guī)脫蠟；②PBS洗2 min×2 次，3% 的過氧化氫溶液滴至切片，室溫10 min，滅活內(nèi)源性酶；③PBS洗2 min×2 次，0.1% 胰酶修復(fù)；④PBS洗2 min×2次，滴加5% BSA 封閉液，室溫30 min，甩去多余液體，不洗；⑤滴加稀釋的兔抗大鼠NMDAR2B(1∶30)，4 ℃ 過夜；⑥ 復(fù)溫40 min，PBS 沖洗2 min×2次；⑦滴加生物素化山羊抗兔IgG，37℃ 30 min，PBS 洗2 min×2次；⑧滴加SABC，37℃ 20 min，PBS 洗2 min×3 次；⑨ DAB 顯色，鏡下控制染色程度，7 min～8 min后蒸餾水終止顯色反應(yīng)；⑩蘇木素輕度復(fù)染11 s。脫水，封片。光鏡下觀察。

1.2.4陰性對(duì)照的建立以10% PBS 代替一抗進(jìn)行免疫組化染色，其余步驟如前。1.2.5灰度值測(cè)定采用BI2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)，400倍物鏡下，在相對(duì)應(yīng)的海馬CA1區(qū)內(nèi)，隨機(jī)各取5個(gè)視野，測(cè)單個(gè)視野中NMDA受體的灰度值。

2結(jié)果

各組海馬CA1區(qū)NMDA受體(見圖1)，免疫染色陽性物質(zhì)主要存在于神經(jīng)元細(xì)胞表面。其中對(duì)照組免疫染色陽性細(xì)胞排列規(guī)則，細(xì)胞免疫染色深；模型組NMDA免疫染色陽性細(xì)胞排列欠規(guī)則，染色較淡，其平均灰度值顯著大于對(duì)照組(P<0.05)；遠(yuǎn)志總皂苷防治組免疫染色陽性細(xì)胞排列較模型組規(guī)則，染色較深，其平均灰度值顯著小于模型組(P<0.05)。詳見表1。

圖1　各組海馬CAI區(qū)NMDA受體

組別nNMDA受體灰度值對(duì)照組8186.87±1.46 模型組8205.99±2.531)遠(yuǎn)志總皂苷組9195.35±2.332) 與對(duì)照組比較,1)P<0.01;與模型組比較,2)P<0.05。

3討論

NMDA 受體在短暫記憶、空間記憶以及被動(dòng)回避記憶中均有重要的作用[4]。長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(LTP)是一種突觸可塑性的形式，是學(xué)習(xí)和記憶的細(xì)胞基礎(chǔ)[5]。神經(jīng)電生理學(xué)研究表明[6]，大腦海馬LTP 是記憶形成和鞏固過程中神經(jīng)元活動(dòng)的客觀指標(biāo)。海馬發(fā)育早期，谷氨酸能神經(jīng)元內(nèi)的NMDA 受體參與了LTP的建立，一定強(qiáng)度和頻率的電刺激，可使谷氨酸能突觸的后膜去極化，移除阻礙Ca2+內(nèi)流的Mg2+，使NMDA 受體通道復(fù)合體的Ca2+通道開放，Ca2+內(nèi)流并觸發(fā)神經(jīng)元內(nèi)一系列生化反應(yīng)，最終改變突觸后膜的性質(zhì)，建立LTP。

癲癇與認(rèn)知功能損害的關(guān)系已引起廣泛重視，癲癇發(fā)作次數(shù)越頻繁，持續(xù)時(shí)間越長(zhǎng)，導(dǎo)致的損害就越大[7]。癲癇的發(fā)生、發(fā)展與腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)失衡有關(guān)，谷氨酸是大腦中含量最高的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)之一，而N-甲基-D-天門冬氨酸受體是一種重要的離子型谷氨酸受體，它在突觸傳遞和神經(jīng)可塑性等生理過程中扮演了關(guān)鍵角色，而突觸可塑性是學(xué)習(xí)記憶的基礎(chǔ)，因此研究癲癇后NMDA受體表達(dá)的變化對(duì)闡明其認(rèn)知障礙發(fā)生的機(jī)制具有重要的意義[8]。

作為益智安神藥遠(yuǎn)志在臨床上的應(yīng)用已有千年的歷史，遠(yuǎn)志總皂苷作為其主要成分[9]，對(duì)學(xué)習(xí)記憶影響的研究也日益受到重視[10]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示模型組大鼠海馬CA1區(qū)NMDA受體平均灰度值顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，遠(yuǎn)志防治組大鼠海馬CA1區(qū)NMDA受體平均灰度值顯著低于模型組(P<0.05)。結(jié)果表明，癲癇模型組大鼠海馬CA1區(qū)NMDA受體表達(dá)下降，而遠(yuǎn)志總皂苷可顯著提高Ep模型大鼠海馬CA1區(qū)NMDA 受體的表達(dá)。

遠(yuǎn)志總皂苷可能通過對(duì)癲癇后NMDA受體表達(dá)的影響減輕對(duì)海馬LTP的抑制，進(jìn)而改善癲癇后的認(rèn)知障礙。

參考文獻(xiàn)：

[1]Binder DK，Steinhauser C.Role of astrocyte dysfunction in epilepsy encyclopedia of basic epilepsy research[M].Academic Press，Oxford， 2009：412-417.

[2]Fisher RS，van Emde Boas W，Blume W，et al.Epileptic seizures and epilepsy：definitions proposed by the International League Against Epilepsy(ILAE) and the International Bureau for Epilepsy (IBE)[J].Epilepsia，2005，46：470-472.

[3]陳勤，高晨曦，葛禮浩，等.遠(yuǎn)志皂苷對(duì)腦定位注射Aβ1-40擬AD大鼠腦內(nèi)神經(jīng)形態(tài)病理學(xué)變化的影響[J].激光生物學(xué)報(bào)，2006，15(3)：294-298.

[4]焦聚，馬融，任獻(xiàn)青.NMDA受體及其與癲癇所致認(rèn)知功能損害的關(guān)系[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合兒科學(xué)，2014(3)：215-218.

[5]柯珂，喬琰 ，王俊.NMDA 受體概述及其在學(xué)習(xí)記憶中的作用[J].廣西科學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，27(1)：49- 54.

[6]Durand GM，Kovalchuk Y，Konnerth A.Long-term potentiation and functional synapse induction in developing hippocampus[J].Nature，1996，381：71-75.

[7]Thompson PJ，Duncan JS.Cognitive decline in severe intractable epilepsy[J] .Epilepsia，2005，46(11)：1780-1787.

[8]唐玲，唐榮偉，唐晶，等.突觸可塑性與學(xué)習(xí)記憶關(guān)系的研究進(jìn)展[J].川北醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2012(1)：89-92.

[9]馬彪.遠(yuǎn)志總皂苷對(duì)癲癇模型大鼠認(rèn)知功能障礙的影響及其突觸機(jī)制[D].太原： 山西醫(yī)科大學(xué)，2015.

[10]李曉峰，趙大鵬，陳樹沙，等.遠(yuǎn)志總皂苷對(duì)AD模型大鼠海馬nACHRα4亞基及PSD-95表達(dá)的影響[J].神經(jīng)藥理學(xué)報(bào)，2011，1(3)：16-22.

(本文編輯王雅潔)

基金項(xiàng)目：山西省青年科技研究基金(No.2013021036-1)，課題名稱：癲癇模型大鼠認(rèn)知功能障礙突觸機(jī)制探討及遠(yuǎn)志總皂苷對(duì)其影響

通訊作者：李新毅，E-mail：876379752@qq.com

中圖分類號(hào)：R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

doi：10.3969/j.issn.1672-1349.2016.13.013

文章編號(hào)：1672-1349(2016)13-1481-03

(收稿日期：2016-03-16)