趙莘瑜，蘇　剛

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450052　△女，1972年2月生，博士，主任醫(yī)師，教授，研究方向：神經(jīng)系統(tǒng)變性病和腦血管病,E-mail：cindy_zhaoxinyu@163.com

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早期生長反應(yīng)因子對U87MG細(xì)胞Aβ40表達(dá)的影響*

趙莘瑜△，蘇剛

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450052△女，1972年2月生，博士，主任醫(yī)師，教授，研究方向：神經(jīng)系統(tǒng)變性病和腦血管病,E-mail：cindy_zhaoxinyu@163.com

摘要目的：研究早期生長因子EGR1對U87MG細(xì)胞Aβ40表達(dá)的影響。方法：構(gòu)建EGR1表達(dá)質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染U87MG(實驗組)，以轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒的U87MG細(xì)胞作為對照。采用qRT-PCR法檢測兩組EGR1 mRNA的表達(dá)；收集細(xì)胞培養(yǎng)液用ELISA法檢測Aβ40的水平；提取總蛋白用蛋白印跡法檢測BACE1和PS1蛋白的表達(dá)。結(jié)果：質(zhì)粒成功構(gòu)建并表達(dá)。實驗組EGR1 mRNA表達(dá)水平較對照組明顯增高(P<0.001)；實驗組細(xì)胞培養(yǎng)液中Aβ40水平較對照組增高(P<0.001)；實驗組BACE1蛋白的表達(dá)較對照組增加(P<0.001)；兩組PS1蛋白的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.367)。結(jié)論：EGR1在體外可能使Aβ40表達(dá)增加，且可能與上調(diào)BACE1有關(guān)。

早期生長反應(yīng)因子(early growth response 1, EGR1)基因是即刻早期基因(immediate early gene, IEG)家族成員，是含有鋅指結(jié)構(gòu)的核轉(zhuǎn)錄因子，該類基因在細(xì)胞受外部刺激后最先表達(dá)[1-2]。其在人腦內(nèi)基礎(chǔ)表達(dá)量非常低，但在一定條件下能迅速被大量誘導(dǎo)[2]。最初研究[3]發(fā)現(xiàn)其與炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)、生長分化相關(guān)。也有研究[4]發(fā)現(xiàn)EGR1與認(rèn)知功能存在著密切聯(lián)系。文獻(xiàn)[5-6]論述了EGR1與人長時程記憶形成密切相關(guān)，EGR1在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)是長期記憶形成和突觸可塑性地由短期轉(zhuǎn)變?yōu)殚L期必不可少的條件之一。研究[7]認(rèn)為EGR1可能參與阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)的發(fā)病過程。 有報道[7]證明EGR1可導(dǎo)致Taus蛋白磷酸化，形成神經(jīng)纖維纏結(jié)，傾向于支持Tau蛋白假說；有學(xué)者[8]認(rèn)為淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein,APP)過量表達(dá)使EGR1的表達(dá)水平降低，相反在APP基因敲除的實驗動物內(nèi)EGR1的表達(dá)量增高，更傾向于支持β淀粉樣蛋白瀑布假說。EGR1參與AD的發(fā)病過程似乎得到了科學(xué)家們的共識，但具體的參與機(jī)制尚存爭議。研究[9]認(rèn)為慢性炎癥、缺氧及應(yīng)激等條件下可導(dǎo)致Aβ蛋白沉積和神經(jīng)元損傷與丟失，EGR1作為一種早期生長反應(yīng)因子在慢性炎癥、缺氧、應(yīng)激條件下表達(dá)迅速增高[10]。以上證據(jù)提示EGR1是通過調(diào)節(jié)Aβ蛋白參與癡呆的發(fā)病過程。Aβ蛋白是β淀粉樣蛋白瀑布假說的分子基礎(chǔ)[11]，是APP病理代謝的產(chǎn)物，而BACE1和PS1是APP病理代謝過程中的關(guān)鍵酶[12]。作者構(gòu)建了CMV-EGR1過表達(dá)載體，通過檢測惡性膠質(zhì)瘤(U87MG)細(xì)胞Aβ40、BACE1及PS1的表達(dá)來初步探討EGR1對Aβ蛋白的影響。

1材料與方法

1.1主要試劑 BACE1及PS1一抗購自Abcam公司，ELISA試劑盒(Aβ40)購自上海拜利生物公司，山羊抗兔二抗及GADPH一抗購于武漢三鷹生物公司；DMEM高糖培養(yǎng)基購自索萊寶公司，胎牛血清購自四季青生物公司；蛋白裂解液、RNA提取試劑盒購自康為公司；Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司；pCMV-EGR1-FLAG、空白載體CMV-EGFP-Kanamycin、XhoⅠ/KpnⅠ內(nèi)切酶及Taq polymerase 由上海吉凱基因公司提供；qRT-PCR試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、T4連接酶購自TAKARA公司。

1.2質(zhì)粒構(gòu)建 以pCMV-EGR1-FLAG質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增目的基因。EGR1轉(zhuǎn)化子上游引物序列為5’-CACATCCGATCCACACAG-3’，下游引物序列為5’-CGTCGCCGTCCAGCTAGACCAG-3’,擴(kuò)增產(chǎn)物大小為750 bp。反應(yīng)體系：ddH2O 12.4 μL，5×Taq buffer 4 μL，dNTPs(2.5 mmol/L)1.6 μL，上游引物(10 μmol/L)0.4 μL，下游引物(10 μmol/L)0.4 μL，模板1 μL，Taq polymerase 0.2 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，60 ℃30 s ，72 ℃ 40 s 30個循環(huán)；72 ℃ 5 min，割膠純化。載體酶切：用XhoⅠ/KpnⅠ內(nèi)切酶對質(zhì)粒載體進(jìn)行酶切。反應(yīng)體系：ddH2O 40.5 μL，10×buffer 15 μL，100×BSA 0.5 μL，純化的DNA質(zhì)粒(1 g/L)2 μL，XhoⅠ(10 kU/L)1 μL，KpnⅠ(10 kU/L)1 μL。37 ℃下酶切2 h。重組質(zhì)粒構(gòu)建：將添加了黏性末端的EGR1 cDNA與空載體混合，在T4連接酶的作用下進(jìn)行連接反應(yīng)，用感受態(tài)的大腸桿菌轉(zhuǎn)化，于4 ℃過夜；37 ℃培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌1 d，在含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基上篩選克隆。結(jié)果鑒定：擴(kuò)大培養(yǎng)后，用質(zhì)粒提取試劑盒提取后對轉(zhuǎn)化子行PCR鑒定。送樣本至吉凱生物公司進(jìn)行測序鑒定，結(jié)果與GenBank上EGR1(NM_001964)比較。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及總蛋白的提取 細(xì)胞培養(yǎng)：將U87MG細(xì)胞接種于25 mL培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)液為DMEM高糖培養(yǎng)基。根據(jù)細(xì)胞生長情況約2～3 d換液1次。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染：取生長良好的U87MG細(xì)胞按照Lipofectamine 2000說明書操作進(jìn)行轉(zhuǎn)染。并在轉(zhuǎn)染6 h后于熒光顯微鏡(×200)下觀察，轉(zhuǎn)染成功后繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞2 d后提取總蛋白。總蛋白提?。簩⒓?xì)胞用胰酶消化2 min，轉(zhuǎn)移至2 mL離心管中1 500×g離心5 min，棄上清，加入2 μL蛋白酶抑制劑2 min后加入198 μL細(xì)胞裂解液，反復(fù)吹打均勻，于冰上裂解20 min，13 000×g4 ℃下離心10 min。BCA法測蛋白濃度，將各管蛋白濃度調(diào)整至相同水平，加入lodding煮沸5 min，置于-80 ℃冰箱備用，實驗重復(fù)3次。

1.4EGR1 mRNA的qRT-PCR檢測 采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，按照qRT-PCR試劑盒說明書進(jìn)行操作，以GADPH為內(nèi)參，引物見1.2。反應(yīng)條件為95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s重復(fù)40個循環(huán)，采用2-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)的相對定量分析，實驗重復(fù)3次。

1.5BACE1、PS1的蛋白印跡實驗 取30 μg總蛋白樣品(約25 μL)于120 V恒定電壓條件下電泳90 min。于220 mA恒定電流條件下將電泳過的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。將膜置于50 g/L的脫脂牛奶中室溫封閉2 h。將封閉后的硝酸纖維素膜置于2 mL單克隆抗體稀釋液中4 ℃過夜。次日用TBST液漂洗3次，每次10 min。用TBST將二抗稀釋2 000倍，在搖床上孵育1 h，用TBST漂洗5次，每次10 min。于暗室中用ECL發(fā)光液曝光。實驗以GAPDH作為內(nèi)參對照。用Image J軟件進(jìn)行灰度值分析，以目的蛋白與內(nèi)參灰度值的比值作為目的蛋白的相對表達(dá)量，實驗重復(fù)3次。

1.6Aβ40蛋白的酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)檢測 轉(zhuǎn)染成功后繼續(xù)培養(yǎng)48 h后更換為無血清DMEM培養(yǎng)基，收集無血清細(xì)胞培養(yǎng)液。取無血清培養(yǎng)液用TCA進(jìn)行蛋白質(zhì)沉淀，4 ℃過夜。按照Aβ40的ELISA說明書步驟操作，每樣本設(shè)2個復(fù)孔。實驗重復(fù)3次。

1.7統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 21.0分析，兩組EGR1 mRNA和BACE1、PS1蛋白的表達(dá)以及Aβ40水平比較采用兩獨立樣本t檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2結(jié)果

2.1EGR1轉(zhuǎn)化子鑒定結(jié)果 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化成功(圖1)。測序結(jié)果與GenBank一致。

M:Marker;1～5:EGR1轉(zhuǎn)化子。圖1　EGR1轉(zhuǎn)化子鑒定

2.2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染情況熒光顯微鏡下可見綠色梭形細(xì)胞，表明重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染了U87MG細(xì)胞(圖2)。

圖2　CMV-EGR1-EGFP轉(zhuǎn)染6 h后熒光顯微鏡圖(×200)

2.3兩組U87MG細(xì)胞EGR1 mRNA的表達(dá)和Aβ40水平情況見表1。

2.4兩組U87MG細(xì)胞BACE1和PS1蛋白的表達(dá)情況見圖3、4和表1。

1：實驗組；2：對照組。圖3　各組BACE1蛋白的表達(dá)情況

1：實驗組；2：對照組。圖4　各組PS1蛋白的表達(dá)情況

組別nEGR1mRNAρ(Aβ40)/(mg·L-1)BACE1蛋白PS1蛋白實驗組33.042±0.1740.365±0.0290.452±0.0070.234±0.013對照組31.002±0.0730.191±0.0270.151±0.0040.231±0.012t18.75522.839212.7810.910P<0.001<0.001<0.0010.367

3討論

APP的正常代謝不產(chǎn)生Aβ蛋白，而是經(jīng)過α剪切酶的作用產(chǎn)生對神經(jīng)細(xì)胞有保護(hù)作用的sAPPα[13]；當(dāng)APP進(jìn)入非正常代謝途徑時，BACE1作用于APP，剪切產(chǎn)生APP-βCTF和可溶性片段sAPPβ；APP-βCTF進(jìn)一步被γ分泌酶作用，最后釋放Aβ40和Aβ42[14]。γ分泌酶為四聚體結(jié)構(gòu)，由PS1、APH1、PSEN2、NCT四個亞基構(gòu)成，其中PS1是其催化亞基[15]。因此BACE1和PS1在APP的病理剪切過程中起著重要作用。由于Aβ42分泌量較Aβ40少很多，考慮到蛋白濃度過低時對實驗結(jié)果影響較大，作者僅檢測Aβ40蛋白濃度。

有研究[3]表明EGR1與AD關(guān)系密切。Hendrickx等[4]闡明了EGR1的過表達(dá)可以導(dǎo)致APP蛋白表達(dá)增多，在酶活性和總量不變的情況下，也可導(dǎo)致Aβ蛋白的增加。該研究結(jié)果顯示外源性的EGR1成功轉(zhuǎn)染U87MG細(xì)胞后，細(xì)胞培養(yǎng)液中Aβ40分泌量較對照組明顯增加。研究[16]發(fā)現(xiàn)APP的剪切過程在很大程度上決定了Aβ蛋白的表達(dá)量，這說明Aβ蛋白的產(chǎn)生主要來自于APP的異常代謝。BACE1介導(dǎo)APP的病理剪切，并對Aβ蛋白的表達(dá)起著重要作用。PS1對Aβ蛋白的產(chǎn)生也起有一定的作用。因此作者推測實驗組Aβ40的增多可能是由于EGR1在參與APP異常剪切的過程時，關(guān)鍵酶BACE1和PS1表達(dá)增加所導(dǎo)致的結(jié)果。

該研究結(jié)果顯示實驗組BACE1蛋白的表達(dá)較對照組增高。目前尚無相關(guān)研究表明EGR1與BACE1之間有明確關(guān)系。有學(xué)者[17]指出溶血卵磷脂酸能通過上調(diào)BACE1的表達(dá)影響Aβ的形成，提示EGR1使Aβ40的表達(dá)增高可能是因為BACE1的表達(dá)上調(diào)所導(dǎo)致。PS1是γ分泌酶四聚體的穩(wěn)定表達(dá)成分，其表達(dá)的高低可以在一定程度上代表γ分泌酶的表達(dá)。雖然有研究[18]表明γ分泌酶能很大程度上影響Aβ蛋白的形成，但目前尚無明確證據(jù)顯示EGR1對PS1的表達(dá)有影響。該研究結(jié)果顯示兩組PS1蛋白的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明EGR1可能不會通過調(diào)節(jié)γ分泌酶的量而影響Aβ蛋白的表達(dá)。

綜上所述，過表達(dá)EGR1可能刺激U87MG細(xì)胞內(nèi)Aβ40的表達(dá)，并且可能與BACE1的上調(diào)相關(guān)。該結(jié)論尚需進(jìn)一步實驗驗證。

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(2015-10-11收稿責(zé)任編輯李沛寰)

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.04.020

中圖分類號R742

關(guān)鍵詞阿爾茨海默病；Aβ40；EGR1;U87MG細(xì)胞

Effect of early growth response 1 on expression of Αβ40 in U87MG cells

ZHAO Xinyu,SU Gang

DepartmentofNeurology,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

Key wordsAlzheimer′s disease;beta amyloid protein 40;early growth response 1;U87MG cells

AbstractAim: To research the effect of early growth response 1(EGR1) on the expression of beta amyloid protein 40(Aβ40) U87MG cells. Methods: To construct overexpression plasmid of CMV-EGFP-EGR1-Kanamycin and transfect U87MG cells as the experimental group; the control group cells were transfected by the plasmids of CMV-EGFP-Kanamycin. The expression of EGR1 mRNA was detected by qRT-PCR. The culture media was collected and Aβ40 was detect by ELISA. The total proteins of U87MG cells from the 2 groups was extracted and BACE1 and PS1 was measure by Western blot.Results: The experimental group and the control group were transfected by plasmids successfully. The expression of EGR1 mRNA increased significantly in the experimental group compared with the control group(P<0.001). Average concentration of Aβ40 was significantly higher in the experimental group than that in the control group(P<0.001). There was a significant increase of BACE1 protein level in the experimental group than that in the control group(P<0.001).There was no significant difference in PS1 protein level between the two groups(P=0.367).Conclusion: EGR1 can increase the expression of Aβ40 in vitro, which may associate with up-regulating the expression of BACE1 protein.

*河南省科技廳基礎(chǔ)與前沿項目340600531605；河南省教育廳自然科學(xué)研究計劃12A320072