田　云，曹林友，周　賡，鄧成剛，陳　帥，盧向陽，周海燕

(1.湖南省農(nóng)業(yè)生物工程研究所，湖南 長沙 410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)東方科技學(xué)院，湖南 長沙 410128；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128)

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一株纖維素酶高產(chǎn)菌的篩選、鑒定與產(chǎn)酶研究

田云1,3，曹林友1,2,3，周賡1,3，鄧成剛1,2,3，陳帥1,2,3，盧向陽1,3，周海燕3

(1.湖南省農(nóng)業(yè)生物工程研究所，湖南 長沙 410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)東方科技學(xué)院，湖南 長沙 410128；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128)

摘要：從蘑菇培養(yǎng)基質(zhì)中篩選到一株纖維素酶高產(chǎn)菌株，將其命名為SAISA10，經(jīng)形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)鑒定，確認(rèn)該菌為真菌Hypocreales sp.。發(fā)酵產(chǎn)酶條件分析結(jié)果表明，該菌株最佳發(fā)酵條件為：發(fā)酵時(shí)間3 d、發(fā)酵溫度40 ℃、pH值4.0、m(羧甲基纖維素鈉)∶m(麩皮)=1∶1(g∶g)、(NH4)2SO4含量0.8 g·(100 mL)-1。酶學(xué)性質(zhì)初步研究結(jié)果表明，該菌株所產(chǎn)纖維素酶的最適酶解條件為：溫度45～55 ℃、pH 值4.0；最佳穩(wěn)定條件為：溫度40 ℃、pH值4.5。菌株SAISA10是一株高產(chǎn)纖維素酶的真菌，在高溫和低pH值下仍有高活性和穩(wěn)定性，具有較高的開發(fā)價(jià)值。

關(guān)鍵詞：纖維素酶；真菌；篩選；鑒定；產(chǎn)酶條件；Hypocreales sp.

隨著社會發(fā)展和經(jīng)濟(jì)水平的不斷提高，能源危機(jī)、資源短缺等問題日益突出。目前第一代化石燃料仍占能源消耗的85%以上[1-2]，其造成的污染使人類的居住環(huán)境變得惡劣。為了既滿足人類對能源的需求、實(shí)現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展，又能最大程度地降低能源物質(zhì)開發(fā)和使用造成的環(huán)境污染，尋找并開發(fā)資源豐富、可再生、綠色環(huán)保、廉價(jià)適用的新能源物質(zhì)，成為近年的研究熱點(diǎn)[3-6]。

纖維素資源十分豐富，主要存在于植物細(xì)胞壁中[7]，其植物碳素比例超過50%，藻類、被囊動(dòng)物以及一些細(xì)菌也能合成纖維素[8]。纖維素是由D-吡喃式葡萄糖基通過β-1,4糖苷鍵連接而成的線性不分支的同聚多糖。天然的纖維素由排列整齊且規(guī)則的結(jié)晶區(qū)和相對不規(guī)則、松散的無定形區(qū)組成，其結(jié)晶度一般在30%～80%之間[9]。纖維素降解成小分子物質(zhì)后，可以轉(zhuǎn)化為具有廣闊應(yīng)用前景的能源物質(zhì)[10]。由于纖維素本身的致密結(jié)構(gòu)使得其分子結(jié)構(gòu)十分穩(wěn)定，通常采用酶法對其進(jìn)行降解。

纖維素酶是一種多組復(fù)合酶系，相對分子量為45～75kDa，由3種相互起協(xié)同作用的酶組合而成[11]，這3種酶分別為內(nèi)切葡聚糖酶(1,4-β-D-glucanglucanohydrolase,EC3.2.1.4)、外切葡聚糖酶(1,4-β-D-glucancellobilhydrolase,EC3.2.1.91)、葡萄糖苷酶(β-1，4-glucosidase，EC3.2.1.21)[12-13]。纖維素酶廣泛存在于微生物、原生動(dòng)物和植物中，甚至一些昆蟲和動(dòng)物也能產(chǎn)生纖維素酶[14]。自1912年Kellerma等首次從土壤中篩選出一株纖維素降解菌以來，各種降解纖維素的菌種陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)[15]。已報(bào)道的對纖維素降解作用較強(qiáng)的菌株多是木霉屬(Trichoderma)、曲霉屬(Aspergillus)、青霉屬(Penicillium)、枝頂孢霉屬(Acremonium)、漆斑霉屬(Myrothecium)、脈孢霉屬(Neurospora)、毛殼霉屬(Chaetomium)等的菌株[16-20]。最近幾年對纖維素酶研究的熱衷使得有關(guān)纖維素酶高產(chǎn)菌種的篩選有不少報(bào)道，如：吳文韜等[21]從蚯蚓養(yǎng)殖場中分離出一株高效纖維素降解菌株NH11，其對稻草具有較高的降解效率；劉韞滔等[22]從用于堆肥的水稻秸稈中篩選到斜臥青霉；Kaur等[23]篩選到一株可產(chǎn)較高活力的耐熱、中性纖維素酶嗜熱菌Melanocarpussp.。作者從蘑菇培養(yǎng)基質(zhì)中篩選出一株纖維素酶高產(chǎn)菌株，對其進(jìn)行了鑒定，并分析了其產(chǎn)酶條件及酶學(xué)性質(zhì)。

1實(shí)驗(yàn)

1.1菌株的篩選與鑒定

蘑菇培養(yǎng)基質(zhì)配制成5mL懸浮液進(jìn)行菌落富集。將稀釋的菌液樣品涂布到加有1%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)的PDA培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)3d，長成的菌落用剛果紅染色，觀察培養(yǎng)基上的水解圈，選擇水解圈直徑(D)與菌落直徑(d)比值較大的菌株，采用DNS法測定其酶活，根據(jù)酶活大小進(jìn)行復(fù)篩。

觀察篩選菌株的菌絲、菌落顏色、表面、邊緣、孢子形態(tài)和菌落質(zhì)地等，同時(shí)對菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，按試劑盒說明進(jìn)行基因組提取，根據(jù)真菌ITSDNA基因的序列特征，以菌株總DNA為模板，ITS5和ITS4為引物，擴(kuò)增真菌的ITS基因片段?；虍a(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在含有Amp+的LB平板培養(yǎng)基上進(jìn)行抗性篩選，其中陽性克隆菌采用通用引物M13F與M13R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增檢測中具有564bp條帶的菌株送至華大基因公司測序。

1.2產(chǎn)酶條件優(yōu)化

纖維素酶高產(chǎn)菌的產(chǎn)酶初始條件為：接種量5%、發(fā)酵時(shí)間3d、發(fā)酵溫度28 ℃、pH值5.0、CMC-Na和麩皮的含量均為1g·(100mL)-1、(NH4)2SO4含量0.4g·(100mL)-1。產(chǎn)酶優(yōu)化研究中分別考察發(fā)酵時(shí)間(1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d)、發(fā)酵溫度(25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃)、pH值(3、4、5、6、7)、CMC-Na和麩皮的質(zhì)量比(0∶1.0、0.25∶0.75、0.5∶0.5、0.75∶0.25、1.0∶0，g∶g)、(NH4)2SO4含量[0、0.4、0.8、1.2、1.4，g·(100mL)-1]對產(chǎn)酶的影響。

1.3酶學(xué)性質(zhì)研究

菌株在優(yōu)化后的條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)物于4 ℃、5 000 r·min-1離心10 min，收集上清液即得到粗酶液。

內(nèi)切葡聚糖酶(Cx)酶活的測定：以CMC-Na為底物進(jìn)行反應(yīng)測定酶活。取1.5 mL 0.05 mol·L-1醋酸緩沖液(含0.5%的CMC-Na)于50 ℃水浴預(yù)熱后加入0.5 mL粗酶液，保溫30 min，立即取出并加入1.5 mL DNS試劑以終止酶反應(yīng)，沸水浴5 min，取出后加水定容至25 mL，測定540 nm處吸光度。

濾紙酶(FPA)酶活的測定：以去淀粉的濾紙為底物進(jìn)行反應(yīng)測定酶活。往1.5 mL 0.05 mol·L-1醋酸緩沖液中加入0.5 mL粗酶液，50 ℃預(yù)熱后加入50 mg新華定量濾紙，保溫1 h后取出并加入1.5 mL DNS試劑以終止酶反應(yīng)，沸水浴5 min，取出后加水定容至25 mL，測定540 nm處吸光度。

酶活單位定義：以每分鐘生成1 μg葡萄糖所需的酶量定義為一個(gè)酶活單位(U)。酶活(U·mL-1)按下式計(jì)算：

式中：m為葡萄糖質(zhì)量，mg；n為粗酶液稀釋倍數(shù)；t為反應(yīng)時(shí)間，min；V為反應(yīng)液中酶液加入量，mL。

在酶解溫度分別為25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃及pH值分別為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5的條件下考察菌株SAISA10所產(chǎn)纖維素酶的最適酶解條件。

另外，分別在35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃條件下將酶反應(yīng)體系保溫2 h，測定不同溫度下粗酶液的酶活保存率；分別在pH值為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5的緩沖液中，在最適溫度下將酶反應(yīng)體系保溫12 h，測定不同pH值中粗酶液的酶活保存率。篩選菌株SAISA10所產(chǎn)纖維素酶的最佳穩(wěn)定條件。

2結(jié)果與討論

2.1纖維素酶高產(chǎn)菌的篩選

從蘑菇培養(yǎng)基質(zhì)中分離出637株真菌菌株，初步篩選出6株水解圈較為顯著的菌株，其水解圈直徑(D)與菌落直徑(d)的比值(D/d)見表1。

表16株水解圈顯著菌株的D/d值

Tab.1D/dValue of six strains with significant hydrolytic zone

菌株編號A10C5F1G3G11H9D/d1.58±0.0351.37±0.0871.37±0.0421.44±0.0211.27±0.0311.48±0.221

由表1可知，菌株A10、G3、H9降解纖維素的效果較好，對菌株A10、G3、H9進(jìn)行Cx酶活及FPA酶活測定(表2)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌株A10所產(chǎn)2種酶的酶活均高于菌株G3和H9，將其命名為SAISA10。

2.2纖維素酶高產(chǎn)菌的鑒定

菌株SAISA10的菌落生長較快，呈扁平圓形，肉色，表面有少量黏液，邊緣分布細(xì)柔的菌絲(圖1a)，菌株分生孢子光滑透明，孢子梗稀缺，產(chǎn)孢細(xì)胞直接著生于菌絲細(xì)胞上，大量孢子聚集呈微弱紅色(圖1b、1c)。

表2篩選獲得菌株所產(chǎn)纖維素酶的酶活/(U·mL-1)

Tab.2Activity of cellulase produced by the screened strains/(U·mL-1)

菌株A10G3H9Cx酶活26.578±0.23021.067±0.35122.101±0.265FPA酶活9.558±0.2897.491±0.0888.295±0.230

圖1　菌株SAISA10的形態(tài)Fig.1　Morphology of strain SAISA10

菌株SAISA10的ITS序列全長為616 bp(圖2)，堿基序列如圖3所示。

將菌株SAISA10的ITS序列進(jìn)行BLAST比對，結(jié)合菌株的形態(tài)學(xué)分析，鑒定該菌為肉座菌目(Hypocrealessp.)。

2.3纖維素酶高產(chǎn)菌的產(chǎn)酶條件優(yōu)化

2.3.1發(fā)酵時(shí)間對菌株產(chǎn)酶的影響(圖4)

圖2菌株SAISA10的電泳圖譜

Fig.2Electrophorogram of strain SAISA10

圖3　菌株SAISA10的ITS序列分析Fig.3　ITS Sequence analysis of strain SAISA10

圖4　發(fā)酵時(shí)間對菌株SAISA10產(chǎn)酶的影響Fig.4　Effect of fermentation time on enzyme-producing of strain SAISA10

由圖4可知，發(fā)酵初期，Cx酶活及FPA酶活均呈上升趨勢；第3 d后，酶活開始下降，菌體也開始出現(xiàn)自溶現(xiàn)象。因此，該菌株發(fā)酵時(shí)間以3 d較為適宜。

2.3.2發(fā)酵溫度對菌株產(chǎn)酶的影響

溫度對微生物生長發(fā)育及生理活動(dòng)的影響非常顯著，左右著微生物代謝與產(chǎn)物合成的方向。溫度過低時(shí)，微生物生長發(fā)育緩慢，代謝活動(dòng)受到抑制；溫度過高時(shí)，不僅對微生物發(fā)酵和產(chǎn)酶產(chǎn)生不利影響，嚴(yán)重時(shí)還會導(dǎo)致微生物死亡。發(fā)酵溫度對菌株SAISA10產(chǎn)酶的影響如圖5所示。

圖5　發(fā)酵溫度對菌株SAISA10產(chǎn)酶的影響Fig.5　Effect of fermentation temperature on enzyme-producing of strain SAISA10

由圖5可知，菌株SAISA10的FPA酶活隨發(fā)酵溫度的升高出現(xiàn)先上升后下降的趨勢，但變化不大；而Cx酶活在35 ℃以下時(shí)受到抑制，酶活偏低，40 ℃時(shí)酶活達(dá)到最高，發(fā)酵溫度超過40 ℃后，酶活迅速下降。因此，該菌株發(fā)酵溫度以40 ℃較為適宜。

2.3.3pH值對菌株產(chǎn)酶的影響

pH值對微生物的生長發(fā)育有著顯著影響。最適pH值條件下的微生物生長代謝旺盛、增殖迅速，有利于菌株的發(fā)酵產(chǎn)酶；高于或低于最適pH值時(shí)，都可能嚴(yán)重影響微生物的生長發(fā)育，甚至造成微生物死亡。pH值對菌株SAISA10產(chǎn)酶的影響如圖6所示。

圖6　pH值對菌株SAISA10產(chǎn)酶的影響Fig.6　Effect of pH value on enzyme-producing of strain SAISA10

由圖6可知，當(dāng)pH值為4時(shí)，菌株SAISA10所產(chǎn)2種酶的酶活最高，表明該菌株所產(chǎn)纖維素酶為嗜酸性酶。

2.3.4碳源和氮源對菌株產(chǎn)酶的影響

碳源和氮源是微生物生長及代謝所必需的核苷酸、維生素、礦物質(zhì)元素等重要營養(yǎng)成分的合成原料，對微生物的生長代謝有著至關(guān)重要的作用。在菌株SAISA10的培養(yǎng)過程中，以CMC-Na作為碳源對于菌體來說較易吸收，但其含量的增加會使發(fā)酵液變得黏稠，導(dǎo)致通氣量降低；以麩皮作為碳源對于菌體而言較難利用，但麩皮能夠使發(fā)酵培養(yǎng)基變得松散，從而影響菌體發(fā)酵產(chǎn)酶。本實(shí)驗(yàn)將CMC-Na和麩皮同時(shí)作為菌株SAISA10的培養(yǎng)碳源，并考察了2種碳源的比例對菌株產(chǎn)酶的影響(圖7a)，結(jié)果表明，當(dāng)CMC-Na與麩皮的含量都為0.5 g·(100 mL)-1，即二者質(zhì)量比為1∶1時(shí)，菌株SAISA10發(fā)酵產(chǎn)酶達(dá)到最佳，酶活達(dá)到最高。

無機(jī)氮源(NH4)2SO4對菌株產(chǎn)酶的影響如圖7b所示。當(dāng)培養(yǎng)基中(NH4)2SO4含量低于0.8 g·(100 mL)-1時(shí)，培養(yǎng)基中氮源不足，從而影響營養(yǎng)成分的合成，使發(fā)酵產(chǎn)酶過程不夠充分；但當(dāng)(NH4)2SO4含量高于0.8 g·(100 mL)-1時(shí)，氮源過剩，對菌株的發(fā)酵產(chǎn)酶反而有抑制作用。

圖7　碳源(a)、氮源(b)對菌株SAISA10產(chǎn)酶的影響Fig.7　Effects of carbon source(a) and nitrogen source(b) on enzyme-producing of strain SAISA10

2.4菌株SAISA10所產(chǎn)纖維素酶的酶學(xué)性質(zhì)

2.4.1最適酶解溫度

酶作為生物催化劑都有其最適的酶解溫度。分別在不同溫度下加入粗酶液進(jìn)行酶解反應(yīng)，考察酶解溫度對酶解效率的影響，結(jié)果見圖8。

圖8　酶解溫度對酶解效率的影響Fig.8　Effect of enzymatic hydrolysis temperature on enzymatic hydrolysis efficiency

由圖8可以看出，菌株SAISA10所產(chǎn)纖維素酶在溫度為45～55 ℃時(shí)，酶活最高，酶解效率較高。

2.4.2最適酶解pH值

分別向pH值為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5的緩沖液配制的底物溶液中加入粗酶液進(jìn)行酶解反應(yīng)，考察pH值對酶解效率的影響，結(jié)果見圖9。

由圖9可看出，菌株SAISA10所產(chǎn)纖維素酶在pH值為4.0時(shí)，酶活最高，酶解效率最高，表明該纖維素酶具有嗜酸特性。

圖9　酶解pH值對酶解效率的影響Fig.9　Effect of pH value on enzymatic hydrolysis efficiency

2.4.3 酶穩(wěn)定性

為了考察菌株SAISA10所產(chǎn)纖維素酶的穩(wěn)定性，從SAISA10培養(yǎng)液中進(jìn)行粗酶提取，并將粗酶液分別在35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃，pH值為4.0的條件下保溫2 h，測定纖維素酶活力殘留率；另外，將粗酶液保存在40 ℃，pH值分別為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5的磷酸緩沖液中12 h后測定纖維素酶活力殘留率，結(jié)果見圖10。

圖10a顯示粗酶中纖維素酶活力在40 ℃下保溫2 h后酶活力殘留率最高，達(dá)90%。圖10b顯示粗酶液的纖維素酶活力在pH值為4.5的磷酸緩沖液中酶活力殘留率最高，約為70%。

3結(jié)論

對蘑菇培養(yǎng)基質(zhì)產(chǎn)纖維素酶菌株進(jìn)行了篩選、鑒定、產(chǎn)酶條件優(yōu)化及酶學(xué)性質(zhì)的初步研究，分離出纖維素酶高產(chǎn)菌株SAISA10，并通過形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)鑒定，確認(rèn)該菌株為Hypocrealessp.，其發(fā)酵產(chǎn)酶的最佳條件為：發(fā)酵時(shí)間3 d、發(fā)酵溫度40 ℃、pH值4.0、羧甲基纖維素鈉與麩皮的比例為1∶1(g∶g)、氮源含量為0.8 g·(100 mL)-1。菌株所產(chǎn)纖維素酶的最適酶解條件為：溫度45～55 ℃、 pH值4.0；最佳穩(wěn)定條件為：溫度40 ℃、pH值4.5。

圖10　溫度(a)和pH值(b)對粗酶活力穩(wěn)定性的影響Fig.10　Effects of temperature (a)and pH value(b)on the crude enzyme stability

篩選獲得的纖維素酶具有較好的耐熱性和穩(wěn)定性，產(chǎn)酶活力很高，該酶是一種嗜酸酶，非常適合產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。

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基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31401637)，湖南省戰(zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)關(guān)鍵共性技術(shù)導(dǎo)向類項(xiàng)目(2015GK1017)，湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)東方科技學(xué)院大學(xué)生研究性學(xué)習(xí)和創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計(jì)劃項(xiàng)目(DFCXY201308)

收稿日期：2016-03-02

作者簡介：田云(1979-)，男，湖南益陽人，教授，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)；通訊作者：周海燕，副研究員，E-mail：284971991@qq.com。

doi：10.3969/j.issn.1672-5425.2016.07.008

中圖分類號：Q 939.9

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1672-5425(2016)07-0034-06

Screening,Identification and Enzyme-Producing Study of A High Cellulase-producing Strain

TIAN Yun1,3,CAO Lin-you1,2,3,ZHOU Geng1,3,DENG Cheng-gang1,2,3,CHEN Shuai1,2,3,LU Xiang-yang1,3,ZHOU Hai-yan3

(1.HunanAgriculturalBioengineeringResearchInstitute,Changsha410128,China;2.CollegeofOrientScience&Technology,HunanAgriculturalUniversity,Changsha410128,China;3.CollegeofBioscienceandBiotechnology,HunanAgriculturalUniversity,Changsha410128,China)

Abstract：A high cellulase-producing strain was screened from the mushroom cultivation matrix,and named as SAISA10.It was identified as Hypocreales sp. by morphological observation and DNA sequence identification.Results showed that,the optimum fermentation conditions for strain SAISA10 were as follows:fermentation time of 3 d,fermentation temperature of 40 ℃,pH value of 4.0,the mass ratio of sodium carboxymethyl cellulose and bran of 1∶1(g∶g),(NH4)2SO4 content of 0.8 g·(100 mL)-1.The preliminary research results of enzymatic properties showed that,the optimum enzymatic hydrolysis conditions were as follows:temperature of 45～55 ℃,pH value of 4.0,and the optimum stable conditions were as follows:temperature of 40 ℃,pH value of 4.5.The strain SAISA10 is a high cellulase-producing strain with high activity and stability at high temperature or low pH value,which has high exploration potential.

Keywords：cellulase;fungus;screening;identification;fermentation condition;Hypocreales sp.

田云，曹林友，周賡，等.一株纖維素酶高產(chǎn)菌的篩選、鑒定與產(chǎn)酶研究[J].化學(xué)與生物工程，2016，33(7)：34-39.