羅園園，吳雪楠，劉文娟，柴漢魁，姚　俊

(北京科技大學(xué)土木與環(huán)境工程學(xué)院，北京 100083)

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鎘累積效應(yīng)對(duì)土壤微生物活性的影響

羅園園，吳雪楠，劉文娟，柴漢魁，姚俊

(北京科技大學(xué)土木與環(huán)境工程學(xué)院，北京 100083)

摘要：重金屬累積效應(yīng)是目前重金屬污染土壤的主要形式，研究重金屬多次污染對(duì)土壤微生物活性的影響是急需解決的科學(xué)問題。研究了外源鎘的累積效應(yīng)對(duì)土壤FDA水解酶活性和微生物能量代謝活性的影響。結(jié)果表明，在鎘總量相同時(shí)，隨著鎘加入次數(shù)的增多，低濃度(2.0 mg·kg-1)鎘對(duì)FDA水解酶活性的促進(jìn)作用變大，高濃度(20.0 mg·kg-1、40.0 mg·kg-1)鎘的抑制作用變小，微生物生長速率常數(shù)k變大；鎘以少量多次的方式加入土壤，微生物受到反復(fù)刺激后生長速率變快，F(xiàn)DA水解酶活性升高。

關(guān)鍵詞：鎘；累積效應(yīng)；土壤微生物；FDA水解酶；能量代謝

土壤是支撐生產(chǎn)活動(dòng)、調(diào)節(jié)營養(yǎng)流動(dòng)、維持陸地生態(tài)系統(tǒng)良好運(yùn)轉(zhuǎn)的主要場(chǎng)所[1]，其中土壤微生物發(fā)揮著重要作用。但人類活動(dòng)如采礦、冶煉、化石燃料燃燒、施肥等使大量農(nóng)田土壤受到重金屬污染[2]。土壤中重金屬累積會(huì)影響土壤微生物活性[3]。鎘被認(rèn)為是環(huán)境中毒害最大的痕量重金屬元素之一[4]，也因其對(duì)土壤微生物的顯著毒性效應(yīng)成為目前研究最多的重金屬之一。

土壤酶是土壤中十分活躍的有機(jī)組分[5]，對(duì)土壤中的多種生物化學(xué)反應(yīng)過程起調(diào)控作用[6]，是土壤微生物代謝過程的主要媒介[7]。土壤酶的種類有很多，F(xiàn)DA水解酶是其中一種，能夠簡單準(zhǔn)確地反映土壤總體微生物活性[8]，可用作短期評(píng)估土壤微生物變化的有效工具[9]。微量熱法是近年發(fā)展起來的一種研究生物熱力學(xué)與生物動(dòng)力學(xué)的重要結(jié)構(gòu)生物學(xué)方法[10]。研究發(fā)現(xiàn)，微量熱法和土壤呼吸強(qiáng)度、土壤微生物生物量、微生物數(shù)量及土壤酶活性有很高的相關(guān)性[11]，可作為評(píng)價(jià)土壤微生物活性的有效手段。

目前，關(guān)于添加外源重金屬對(duì)土壤微生物活性影響的研究較多，多數(shù)停留在一次加入重金屬后測(cè)定土壤微生物活性變化情況。但實(shí)際環(huán)境中重金屬不是一次進(jìn)入環(huán)境中，而是逐步、連續(xù)、多次被排放到環(huán)境，在此期間土壤微生物會(huì)經(jīng)歷一個(gè)反復(fù)受重金屬刺激的過程，活性發(fā)生變化。Tortella等[12]研究發(fā)現(xiàn)，重復(fù)向土壤施加有害物質(zhì)造成的影響或許與一次加入有所不同。李晶等[13]通過比較土壤微生物對(duì)一次干擾和二次干擾的不同響應(yīng)來研究土壤生態(tài)系統(tǒng)功能穩(wěn)定性。Tobor-Kaplon等[14]通過測(cè)定細(xì)菌生長速率和土壤呼吸情況驗(yàn)證了劇烈擾動(dòng)過的系統(tǒng)再次經(jīng)受外界脅迫的能力會(huì)明顯下降的假說，但Philippot等[15]卻指出，第一次干擾反而增加了微生物對(duì)抗二次干擾的能力。多項(xiàng)研究結(jié)果表明，多次向土壤施加污染物質(zhì)會(huì)影響土壤微生物活性和微生物群落結(jié)構(gòu)[16-20]。

作者研究了鎘濃度對(duì)土壤微生物活性的影響及相同濃度鎘以不同添加次數(shù)進(jìn)入土壤后對(duì)FDA水解酶、微生物能量代謝的影響，探究鎘累積效應(yīng)對(duì)土壤微生物活性的較長期影響，擬為研究鎘對(duì)土壤環(huán)境的影響提供參考。

1實(shí)驗(yàn)

1.1土樣

土樣采自北京科技大學(xué)校園。采樣深度為0～20 cm，去除表層被草根和顆粒覆蓋的土壤，風(fēng)干后過100目篩，保存于4 ℃冰箱中備用。土樣的理化性質(zhì)：pH=7.57，有機(jī)質(zhì)0.73%，速效磷60.0 mg·kg-1，速效鉀120 mg·kg-1，全氮65.0 mg·kg-1。

1.2試劑與儀器

氯化鎘，分析純，天津光復(fù)科技發(fā)展有限公司。

UV-1800型紫外可見分光光度計(jì)，日本島津公司；TAMⅢ型十二通道微量量熱儀，美國TA儀器公司。

1.3方法

取土樣培養(yǎng)于塑料杯中，每份40 g，向其中加入鎘，使土樣中鎘濃度分別為2.0 mg·kg-1、20.0 mg·kg-1、40.0 mg·kg-1。鎘加入方式分3種：(1)第1 d一次性加入；(2)第1 d、3 d將鎘分2次加入，每次加入總劑量的1/2；(3)第1 d、3 d、5 d將鎘分3次加入，每次加入總劑量的1/3。設(shè)置空白對(duì)照組。共10份土樣，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，控制含水率在12%左右。分別在第1 d、7 d、14 d、21 d、28 d測(cè)定土樣的FDA水解酶活性，并取第28 d的土樣測(cè)定微生物能量代謝活性。

1.4測(cè)定方法

1.4.1FDA水解酶活性測(cè)定

采用熒光素比色法[5]。每次測(cè)定重復(fù)3次。

1.4.2微生物能量代謝活性測(cè)定

取1 g土樣于4 mL安瓿瓶中，加入200 μL含有5 mg葡萄糖和5 mg硫酸銨的營養(yǎng)液，將安瓿瓶置于微量量熱儀中，記錄土壤微生物的熱功率-時(shí)間曲線。

2結(jié)果與討論

2.1鎘對(duì)FDA水解酶活性的影響

2.1.1鎘濃度與培養(yǎng)時(shí)間對(duì)FDA水解酶活性的影響(圖1)

圖1　鎘濃度與培養(yǎng)時(shí)間對(duì)FDA水解酶活性的影響Fig.1　Effects of Cd concentration and culture time on FDA hydrolase activity

從圖1可以看出，在14 d內(nèi)，低濃度(2.0 mg·kg-1)鎘對(duì)FDA水解酶活性有促進(jìn)作用；隨培養(yǎng)時(shí)間的延長，高濃度(20.0 mg·kg-1、40.0 mg·kg-1)鎘對(duì)FDA水解酶活性起先促進(jìn)后抑制的作用。這與重金屬和酶的結(jié)合機(jī)理有關(guān)[21],重金屬與酶的結(jié)合隨時(shí)間變化導(dǎo)致了酶活性也隨時(shí)間而改變。

2.1.2鎘累積效應(yīng)對(duì)FDA水解酶活性的影響(圖2)

從圖2可以看出，濃度為2.0 mg·kg-1的鎘分批加入土壤中，第7 d、14 d、28 d時(shí)，隨著加入次數(shù)的增多，對(duì)FDA水解酶活性的促進(jìn)作用增大，且分3次加入的FDA水解酶活性最高；濃度為20.0 mg·kg-1的鎘分批加入土壤中，第14 d時(shí)，隨著加入次數(shù)的增多，對(duì)FDA水解酶的抑制作用變小，分3次加入的FDA水解酶活性最高；濃度為40.0 mg·kg-1的鎘在第14 d、21 d、28 d對(duì)FDA水解酶抑制作用也是隨加入次數(shù)的增多而變小。表明，F(xiàn)DA水解酶活性與鎘每次加入量有關(guān)?？偭恳欢〞r(shí)，鎘每次加入量與累積加入次數(shù)成反比，低濃度鎘對(duì)FDA水解酶活性有促進(jìn)作用。鎘進(jìn)入土壤后會(huì)影響土壤微生物生物量，土壤微生物生物量與重金屬量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系[22]，土壤酶活性與土壤微生物生物量呈正相關(guān)關(guān)系[23]。因此，隨著加入次數(shù)的增多，鎘每次加入量越少，F(xiàn)DA水解酶活性越高。這與Li等[7]研究發(fā)現(xiàn)FDA水解酶活性與土壤中鎘總量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系的結(jié)果吻合。

圖2鎘累積效應(yīng)對(duì)FDA水解酶活性的影響

Fig.2Influence of Cd cumulative effect on FDA hydrolase activity

FDA水解酶活性與土壤受鎘干擾的頻次有關(guān)。某些微生物對(duì)外源鎘的累積加入產(chǎn)生一定的耐受性，累積增多，土壤中微生物抗干擾能力增強(qiáng)，即一次干擾增強(qiáng)了微生物應(yīng)對(duì)二次干擾的能力，導(dǎo)致酶活性較高。相關(guān)研究也驗(yàn)證了這一點(diǎn)，Burges等[24]通過向土樣中分3次加入等量鎘發(fā)現(xiàn)，葡萄糖苷酶活性隨加入次數(shù)的增多而升高，第2次加入鎘后真菌基因數(shù)量較第一次加入后減少，但第3次加入后數(shù)量增多，推測(cè)原因?yàn)橥寥乐械恼婢鷮?duì)鎘進(jìn)入土壤的頻次較敏感，土壤酶活性和生物量與重金屬侵染的頻次有關(guān)。Heuer等[25]向土壤中分3次加入含有磺胺嘧啶的肥料，研究表明，土壤中含抗性基因的微生物反復(fù)受到磺胺嘧啶的刺激后累積增多。本研究中，總量相同的鎘進(jìn)入土壤后，加入次數(shù)增多，一些微生物受到刺激后生長較快，累積增多，引起酶活性升高。

鎘濃度為2.0 mg·kg-1時(shí)第21 d、鎘濃度為20.0 mg·kg-1時(shí)第7 d、21 d、28 d及鎘濃度為40.0 mg·kg-1時(shí)第7 d的FDA水解酶活性并未嚴(yán)格呈現(xiàn)出隨加入次數(shù)的增多而升高的趨勢(shì)，可能是因?yàn)?，微生物群落受到重金屬反?fù)刺激后會(huì)發(fā)生不穩(wěn)定變化。Ding等[26]研究發(fā)現(xiàn)，向土壤中分3次加入磺胺嘧啶較一次加入時(shí)土壤中微生物群落的不穩(wěn)定性提高，彈性降低。也可能是由于濃度接近的鎘對(duì)FDA水解酶活性的影響很小而造成的誤差。但鎘分次加入均比一次加入對(duì)FDA水解酶活性的促進(jìn)作用大、抑制作用小。

2.2鎘對(duì)土壤微生物代謝活性的影響

2.2.1鎘濃度與培養(yǎng)時(shí)間對(duì)土壤微生物微量熱曲線的影響(圖3)

圖3　鎘濃度與培養(yǎng)時(shí)間對(duì)土壤微生物微量熱曲線的影響Fig.3　Effects of Cd concentration and culture time on microcalorimetric curves of soil microbacteria

由圖3中峰高(最大熱功率Pmax)、出峰時(shí)間(最大熱功率時(shí)間tmax)可知，低濃度(2.0 mg·kg-1)鎘對(duì)微生物能量代謝有促進(jìn)作用，高濃度(20.0 mg·kg-1、40.0 mg·kg-1)鎘有抑制作用。

2.2.2鎘累積效應(yīng)對(duì)土壤微生物微量熱曲線的影響(圖4)

由圖4可以看出，總量相同的鎘分次加入土壤后對(duì)土壤微生物能量代謝活性的影響是不同的。

2.3鎘累積效應(yīng)對(duì)生長速率常數(shù)的影響

生長速率常數(shù)(k)是反映微生物化學(xué)應(yīng)力和微生物呼吸的重要參數(shù)[27]，可通過對(duì)微量熱曲線中對(duì)數(shù)期部分的lnPt和t的數(shù)據(jù)按式(1)計(jì)算得到(表1)。

lnPt=lnP0+kt

(1)

式中：t是對(duì)數(shù)期的某一時(shí)刻；P0是微生物所有細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)期時(shí)的初始總放熱功率；Pt是t時(shí)刻的總放熱功率。

由表1可知，(1)Pmax與加入次數(shù)未呈現(xiàn)較好的相關(guān)關(guān)系。低濃度(2.0 mg·kg-1)鎘影響下的土壤Pmax隨著鎘加入次數(shù)的增多而減小，較高濃度(20.0 mg·kg-1)鎘影響下的土壤Pmax先增大后減小，而高濃度(40.0 mg·kg-1)鎘影響下的土壤Pmax呈先減小

圖4鎘累積效應(yīng)對(duì)土壤微生物微量熱曲線的影響

Fig.4Influence of Cd cumulative effect on microcalorimetric curves of soil microbacteria

表1

鎘污染第28 d土壤微生物熱力學(xué)參數(shù)

Tab.1

Calorimetric parameters of soil microbacteria polluted by Cd in the 28th day

后增大的趨勢(shì)。(2)Qtotal與加入次數(shù)也未呈現(xiàn)較好的相關(guān)關(guān)系。這是因?yàn)?，Pmax和Qtotal與土壤受污染的程度有關(guān)。較小程度污染會(huì)刺激微生物生長，放熱量增大；但較大程度污染會(huì)造成微生物為抵抗外來污染物質(zhì)消耗更多能量，放出更大熱量。土壤微生物的應(yīng)對(duì)污染的復(fù)雜機(jī)制導(dǎo)致Pmax和Qtotal未能與鎘的干擾次數(shù)顯示較好相關(guān)性。(3)鎘分次加入的土壤生長速率常數(shù)較一次加入的大。

土壤是復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，對(duì)外界侵害有較強(qiáng)的抵抗力。當(dāng)受到重金屬的反復(fù)污染后，為減少背景損傷，部分土壤微生物可通過增強(qiáng)其生物膜進(jìn)行修復(fù)，同時(shí)增強(qiáng)代謝活性[28]；重金屬作為一種強(qiáng)選擇壓力使能對(duì)其產(chǎn)生抗性的微生物群落增多，土壤生態(tài)系統(tǒng)獲得了對(duì)抗脅迫的能力，微生物恢復(fù)生長較快。

3結(jié)論

研究了外源鎘的累積效應(yīng)對(duì)土壤FDA水解酶活性和微生物能量代謝活性的影響。結(jié)果表明，低濃度鎘對(duì)FDA水解酶活性、微生物能量代謝活性呈促進(jìn)作用，高濃度鎘總體表現(xiàn)抑制作用。隨著累積干擾次數(shù)的增多，總量相同的鎘對(duì)FDA水解酶活性的促進(jìn)作用增大，抑制作用變小，微生物的生長速率常數(shù)變大。

由于多次干擾對(duì)土壤生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生的影響較為復(fù)雜，因此還需更加深入研究微生物的響應(yīng)機(jī)制。重復(fù)干擾對(duì)土壤微生物活性及土壤生態(tài)系統(tǒng)的長遠(yuǎn)影響還不清楚，有待深入研究。

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基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(4143000452)，環(huán)保部環(huán)保公益項(xiàng)目(201409042)

收稿日期：2016-03-08

作者簡介：羅園園(1991-)，女，河北衡水人，碩士研究生，研究方向：土壤環(huán)境毒理學(xué)，E-mail：996373788@qq.com；通訊作者：姚俊，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail：yaojun@ustb.edu.cn。

doi：10.3969/j.issn.1672-5425.2016.07.006

中圖分類號(hào)：X 53

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1672-5425(2016)07-0023-05

Cumulative Effect of Cd on Soil Microbial Activity

LUO Yuan-yuan,WU Xue-lan,LIU Wen-juan,CHAI Han-kui,YAO Jun

(SchoolofCivil&EnvironmentalEngineering,UniversityofScience&TechnologyBeijing,Beijing100083,China)

Abstract：Nowadays,the cumulative effect of heavy metals on soil is the main form of heavy metal pollution.The impact of repeated heavy metal pollution on soil microbial activity is a scientific problem needed to be solved urgently.The influences of Cd cumulative effect on soil FDA hydrolase activity and microbial energy metabolism activity were studied.Results showed that with the increase of adding times,the low concentration (2.0 mg·kg-1) of Cd activation on FDA hydrolase increased and the high concentration(20.0 mg·kg-1and 40.0 mg·kg-1) of Cd inhibition decreased and the microbial growth rate constant (k) increased.The microbial growth rate accelerated and the FDA hydrolase activity increased under repeated stimulation when Cd was added into the soil more than once.

Keywords：Cd;cumulative effect;soil microbacterium;FDA hydrolase;energy metabolism

羅園園，吳雪楠，劉文娟，等.鎘累積效應(yīng)對(duì)土壤微生物活性的影響[J].化學(xué)與生物工程，2016，33(7)：23-27.