衛(wèi)杏利 胡治平

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沙鼠腦缺血再灌注損傷后Hsp22和c-fos的表達變化

衛(wèi)杏利 胡治平

目的 探討沙鼠腦缺血再灌注損傷后腦組織中Hsp22和c-fos的表達變化及相應的保護機制。方法 健康雄性蒙古沙鼠制作腦缺血再灌注模型，缺血10 min，再灌注6 h、1、3、7 d。采用HE染色、免疫組織化學染色法觀察腦組織的病理變化，Hsp22和c-fos的表達情況。結(jié)果 (1)HE染色：腦缺血再灌注組根據(jù)時間點的不同可見膠質(zhì)細胞增生、肥大,細胞間質(zhì)和細胞水腫，神經(jīng)元壞死；(2)免疫組化:缺血再灌注損傷后Hsp22的表達上調(diào)，于第3 d達到高峰，與對照組比較有顯著差異(p<0.05)，第7 d開始下降但仍高于正常組和假手術(shù)組；c-fos在腦缺血再灌注后表達明顯增高，于第1 d達到高峰，與對照組比較有顯著差異(p<0.05)，隨后逐漸減少。結(jié)論 沙鼠腦缺血再灌注后腦組織Hsp22及c-fos表達上調(diào)，推測Hsp22可能通過抑制c-fos的活性而起到凋亡負性調(diào)節(jié)的作用。

腦缺血再灌注 Hsp22 c-fos 蒙古沙鼠

熱休克蛋白(Heat Shock Proteins,HSPs)是從細菌到哺乳動物中廣泛存在一類熱應急蛋白質(zhì)。腦組織缺血再灌注后會出現(xiàn)熱休克蛋白等基因表達的動態(tài)變化，進而發(fā)揮相應的功能。人類的Hsp22屬于sHsp亞家族成員，關(guān)于Hsp22對缺血性心肌的保護作用已經(jīng)有較多的報道，Hsp22對缺血后腦組織的保護機制還不清楚。c-fos基因是參與細胞最早功能活動的基因，被認為是研究中樞神經(jīng)系統(tǒng)最有代表性的即刻早期基因[1]。c-fos過度表達與神經(jīng)元凋亡有必然聯(lián)系，且參與細胞凋亡過程，但其具體機制尚未完全明了。Hsp22在腦缺血組織中與c-fos的表達關(guān)系尚未見報道。

1 材料與方法

1.1 動物分組 健康雄性蒙古沙鼠30只，9月齡，體重(90±10)克，由浙江省醫(yī)科院動物實驗室提供。隨機分為正常對照組、假手術(shù)組、腦缺血再灌注組。正常對照組,n=5，不予任何處理即斷頭處死沙鼠;假手術(shù)組,n=5，分離雙側(cè)頸總動脈,不予夾閉,處死;缺血再灌注組(I/R)，n=20,分為I/R后6 h(I/R6h組)、1(I/R1d組)、3(I/R3d組)及7 d(I/R7d組)4組,每組n=5。

1.2 腦缺血再灌注動物模型的建立[2]將健康雄性蒙古沙鼠用3%戊巴比妥以30 mg/kg體重的劑量腹腔注射進行麻醉，固定沙鼠，消毒，頸正中切開皮膚1.5 cm，鈍性分離皮下組織，分離暴露雙側(cè)頸總動脈，微血管夾夾閉雙側(cè)頸總動脈10 min后松夾再灌注恢復血流,最后縫合皮膚,消毒；并分別于再灌注6 h、1、3、7 d后斷頭處死沙鼠。

1.3 主要試劑 抗Hsp22兔多克隆抗體，抗c-fos兔多克隆抗體，SP免疫組織化學試劑盒及DAB顯色試劑盒由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供。

1.4 病理變化的觀察 采用相鄰切片作常規(guī)HE染色，用光學顯微鏡觀察腦組織的病理變化，估計缺血再灌注后不同時間的腦損傷程度。

1.5 免疫組織化學染色 具體步驟:常規(guī)應用二甲苯脫蠟，梯度酒精脫蠟至水；以3%H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶，微波修復抗原，血清封閉，滴加一抗[Hsp22兔抗鼠多克隆抗體IgG(1∶200)；c-fos兔抗鼠多克隆抗體IgG(1∶100)]，4 ℃濕盒過夜,次日PBS洗滌，再滴加生物素化抗兔IgG(二抗)，PBS洗滌，棕色DAB顯色，蘇木素復染，酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。免疫組化對照用隨試劑提供的陽性對照片作陽性對照,陰性對照采用替代法，用PBS代替一抗，其余步驟與上述操作相同。取各組沙鼠切面水平相似的連續(xù)腦組織切片，所有切片分析均在同一強度、同一放大倍數(shù)下進行，每個指標采用陽性細胞計數(shù)法。在40×10倍的光鏡視野下觀察免疫反應，以細胞漿著棕褐色為陽性，每張切片隨機選取前腦皮層區(qū)域8個不重疊400倍視野分別對切片的Hsp22、c-fos免疫陽性細胞進行計數(shù)，取均數(shù)作為各時間點該指標的陽性細胞數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 病理觀察 正常對照組和假手術(shù)組腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)沒有明顯的變化，隨著缺血再灌注的時間延長，可見膠質(zhì)細胞增生明顯, 神經(jīng)元壞死程度加重。

2.2 免疫組化染色 Hsp22在大腦皮質(zhì)的神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞中均有表達,陽性反應為細胞漿出現(xiàn)棕褐色細顆粒。Hsp22在正常對照組及假手術(shù)組腦組織神經(jīng)細胞中呈弱陽性表達，2組之間沒有顯著性差異(p>0.05)。I/R6h組可見Hsp22表達開始明顯升高,I/R3 d達高峰，I/R7 d表達減少(表1)。

表1 各組Hsp22和c-fos表達水平比較,陽性細胞數(shù)/每400倍視野)

注：表示與假手術(shù)組、正常對照組比較，*P<0.05;與C6 h組比較，ΔP<0.05；與C1 d組比較，▲P<0.05；與C3 d組比較，#P<0.05

c-fos在大腦皮質(zhì)的神經(jīng)元及膠質(zhì)細胞中表達，以胞核表達為主，部分可見胞核、胞漿均有表達或胞漿表達。c-fos在正常對照組及假手術(shù)組腦組織神經(jīng)細胞中呈極弱陽性表達，偶可見陽性細胞。I/R6 h組c-fos的表達開始增加，I/R1 d達高峰，I/R3 d，I/R7 d表達逐漸減少(表1)。

Hsp22和c-fos在各組沙鼠前腦神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞內(nèi)均有表達，隨著Hsp22的表達逐漸達到高峰，相應的出現(xiàn)c-fos表達迅速下調(diào)(圖1～3)。

圖1 缺血再灌注后Hsp22和c?fos表達變化

圖2 Hsp22的免疫組化表達水平

圖3 c?fos的免疫組化表達水平

3 討 論

熱休克蛋白是組織受應激后表達的一類蛋白，它的表達可以增強機體對有害應激的耐受能力。根據(jù)分子量、結(jié)構(gòu)、性質(zhì)特點可以分為Hsp100，Hsp90，Hsp70，Hsp60和小熱休克蛋白(sHsp)。人類的Hsp22是一種分子量是21.6KDa小熱休克蛋白也被稱作HspB8、H11激酶和E2IG1，由位于12q24.23的基因編碼，屬于sHsp亞家族成員,以單體的形式存在[3]。Hsp22蛋白廣泛存在于哺乳動物的很多組織中，在肌肉、胎盤、心臟和腦組織中高度表達。Hsp22具有絲/蘇氨酸激酶活性,是一種磷蛋白。在體外Hsp22主要被蛋白激酶C和P44MAPK磷酸化。Hsp22不僅有分子伴侶的作用還有激酶活性、促凋亡或抗凋亡的作用[4]，在延長生物體的壽命、抗缺血再灌注損傷[5]、腫瘤和神經(jīng)系統(tǒng)疾病等很多方面發(fā)揮著重要作用。

本實驗采用沙鼠前腦缺血再灌注模型，發(fā)現(xiàn)在I/R6h 和I/R1dHsp22的表達開始迅速增加，I/R3d Hsp22表達增加達到高峰，I/R7dHsp22表達減少。I/R6h到I/R3d Hsp22表達逐漸上調(diào)達到高峰，隨后下調(diào)，而病理結(jié)果顯示I/R6h到I/R7d腦組織損傷逐漸加重，可能的原因是在缺血再灌注應激下機體產(chǎn)生大量應激因子，上調(diào)了HSF的表達從而誘導了Hsp22表達增高。I/R3d后，機體對缺血性刺激可能逐漸適應，應激因子減少，因而導致Hsp22表達下調(diào)。在缺血再灌注應激下，細胞基因水平的反應性上調(diào)，使Hsp22的表達增強，從而發(fā)揮分子伴侶的作用和激酶的作用。Hsp22對缺血再灌注后的腦組織起到保護作用的機制可能有(1)Hsp22通過分子伴侶作用可以發(fā)現(xiàn)錯誤折疊的蛋白質(zhì)，并通過重新折疊或者降解的作用防止變異蛋白聚集，維持線粒體結(jié)構(gòu)和功能的完整性[6]；(2)穩(wěn)定細胞骨架，保證細胞膜的完整性。Hsp22可以保護肌動蛋白的穩(wěn)定,增加微管的完整,避免中間絲的異常聚合。研究發(fā)現(xiàn)當Hsp22變異時會使軸突骨架破壞和軸突運輸功能發(fā)生障礙[7]；(3)抑制細胞凋亡，挽救受損的神經(jīng)細胞。

在原癌基因家族中有一類能被第二信使所誘導的原癌基因，被稱為“即刻早期基因” (immediately earlygenes，IEGs)，又稱快速反應基因。IEGs 家族中具有代表性且研究較為深入的主要是 c-fos 和 c-jun 家族，其中以 c-fos 轉(zhuǎn)錄、激活最快，活性最高。正常情況下 c-fos在神經(jīng)元中僅是低水平的表達，而在腦缺血、缺氧等病理情況下卻被快速地誘導高表達[8]，其產(chǎn)物Fos蛋白由胞質(zhì)轉(zhuǎn)入核內(nèi)，與c-jun 基因的產(chǎn)物Jun蛋白形成Fos-Jun異源二聚體，作用于DNA的特殊序列，調(diào)節(jié)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮第三信使的作用，進而干預細胞核的修復，導致細胞凋亡[9]。c-fos 表達產(chǎn)物(c-fos mRNA 和c-fos 蛋白)常作為細胞對缺血反應的敏感標志物，近年來其與腦外傷、癲癇、腦血管病等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的關(guān)系研究越來越多。Zheng 等[10]運用彌漫性腦損傷模型觀察c-fos表達的變化，結(jié)果顯示腦損傷后c-fos表達即開始增加，隨后降低但與對照組比較仍維持在較高水平,說明 c-fos表達在腦損傷后隨時間發(fā)生變化。毛曉霞等[11]以四血管阻斷法建立全腦缺血再灌注損傷模型，發(fā)現(xiàn)藥物干預降低c-fos與c-jun表達后凋亡神經(jīng)細胞明顯減少。這些研究提示腦損傷后抑制c-fos基因的高表達有利于減少腦卒中后神經(jīng)元的凋亡。

本實驗用沙鼠前腦腦缺血再灌注模型，發(fā)現(xiàn)I/R6h c-fos的表達開始少量增加，I/R1d c-fos表達迅速增強，并且達到高峰, I/R3d和I/R7d c-fos表達逐漸下降。結(jié)合病理HE染色，缺血再灌注6h是腦缺血病變的超急性期，這時腦組織變化不明顯，腦損傷程度較輕，I/R1d腦組織輕度水腫，腦損傷程度加重，I/R3d和I/R7d腦組織損傷進一步加重。這與神經(jīng)元凋亡表達時間基本一致，因此c-fos表達變化的時間和腦損傷變化的時間也保持一致，提示c-fos參與了缺血后神經(jīng)元的損傷過程，推測腦缺血再灌注后c-fos介導了神經(jīng)細胞的凋亡。腦缺血再灌注后c-fos表達上調(diào)的可能機制是①興奮性氨基酸(excita-tive amino acid，EAA)所激發(fā)的[12]；②腦缺血再灌注時細胞內(nèi)Ca2+超載(Ca2+-overload)，可誘導c-fos表達[13]；③腦缺血再灌注時產(chǎn)生的大量氧自由基的作用；④NO能誘導c-fos基因表達，引起細胞的凋亡。 腦缺血再灌注時缺血腦組織的NO含量明顯升高，可達基線水平的100倍[14]。總之，腦缺血再灌注時興奮性氨基酸、鈣超載、自由基及NO的增多共同參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)中c-fos的表達過程，誘導細胞凋亡的發(fā)生。c-fos因腦缺血再灌注在中樞神經(jīng)系統(tǒng)誘導轉(zhuǎn)錄后其編碼產(chǎn)物Fos隨即與同時被誘導轉(zhuǎn)錄、編碼的c-jun核磷蛋白Jun結(jié)合形成AP-1復合物，后者有可能再通過作用并影響靶基因的轉(zhuǎn)錄而參與腦缺血再灌注后的繼發(fā)性損害，從而促進神經(jīng)細胞凋亡[15]。也就是說，c-fos是把短時外界傷害性刺激信號轉(zhuǎn)變?yōu)殚L時程病理變化的關(guān)鍵性調(diào)控因素。缺血再灌注3 d和7 d c-fos表達逐漸下降，結(jié)合病理，此刻腦組織損傷卻逐步加重。本研究推測可能原因是機體在接受缺血再灌注等應激后啟動的自身保護性機制在逐漸加強，一些保護性因子在一定程度上抑制了c-fos的活化，抑制了c-fos基因的表達，從而抑制c-fos介導的凋亡。

目前國內(nèi)外還沒有關(guān)于Hsp22和c-fos在腦缺血再灌注模型中的表達關(guān)系及其作用機制的報道。本研究采用沙鼠前腦缺血再灌注模型，在相同條件下同步檢測Hsp22、c-fos的表達變化，在I/R1d后隨著Hsp22的緩慢上調(diào)，c-fos開始迅速下調(diào)，提示可能由于Hsp22的腦保護作用抑制了c-fos的活性，從而抑制神經(jīng)細胞的凋亡，挽救受損的神經(jīng)細胞，可能的機制是：一方面，Hsp22通過抑制Ca2 +外流，減少氧自由基的生成等，抑制c-fos基因的表達，減少神經(jīng)元損傷；另一方面，Hsp22的激酶作用可以激活相關(guān)的信號傳導通路[16]，使抗調(diào)亡蛋白Bcl-2穩(wěn)定、Bag-1上調(diào)，進而抑制c-fos 基因的表達?？傊?，c-fos作為第三信使進一步誘導相關(guān)保護基因如Hsp22等的轉(zhuǎn)錄表達，隨著Hsp22的表達增多，抑制c-fos 基因的表達，阻止細胞開始自殺途徑，最終達到對缺血再灌注腦組織的保護作用。

腦缺血-再灌注損傷的病理機制非常復雜, 涉及興奮性氨基酸毒性、細胞內(nèi)鈣負荷超載、自由基損傷、炎癥反應及局部免疫反應等許多方面, 其中腦缺血后腦組織局部神經(jīng)細胞過度凋亡是造成再灌注損傷的主要原因之一。Hsp22和c-fos的相互作用機制還需要進一步研究。

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(2016-04-15收稿 2016-05-13修回)

046000 山西省長治醫(yī)學院附屬和平醫(yī)院老年病科(衛(wèi)杏利)；中南大學湘雅二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(胡治平)

R743

A

1007-0478(2016)06-0449-04

10.3969/j.issn.1007-0478.2016.06.016