張全華　李桂霞　白潔　張曉霞　崔莉　頡玉勝

(蘭州軍區(qū)總醫(yī)院安寧分院，1.檢驗科；2.皮膚科，甘肅 蘭州 730070)

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皮膚結(jié)核實驗室檢測方法的比較研究*

張全華1李桂霞1白潔1張曉霞1崔莉1頡玉勝2

(蘭州軍區(qū)總醫(yī)院安寧分院，1.檢驗科；2.皮膚科，甘肅 蘭州 730070)

【摘要】目的比較和分析涂片抗酸染色法(AFS)、γ-干擾素(IFN-γ)釋放試驗(TB-IGRA)、實時熒光定量PCR(qRT-PCR)、TB-IGRA聯(lián)合基因芯片法(TB-IGRA-GC，GC基因芯片法檢測分枝桿菌菌種及耐藥基因)在皮膚結(jié)核實驗室診斷中的性能，篩選較為準確診斷皮膚結(jié)核的實驗室方法。方法以34例皮膚結(jié)核病患者為陽性對照組，16例非皮膚結(jié)核住院患者為陰性對照組。比較AFS、TB-IGRA、qRT-PCR及TB-IGRA-GC檢測皮膚結(jié)核的敏感性及菌種鑒定和耐藥基因檢測，并進行統(tǒng)計學(xué)分析和評價。 結(jié)果TB-IGRA-GC與TB-IGRA法檢測皮膚結(jié)核的敏感性均為88.2%，qRT-PCR法與AFS法的敏感性分別為82.4%和23.5%，TB-IGRA-GC 、TB-IGRA、qRT-PCR與AFS在靈敏度上相比均有顯著差異(P<0.05)。TB-IGRA-GC在50例標本中共檢測出結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群30例，非結(jié)核分枝桿菌1例(金色分枝桿菌)。30例結(jié)核分枝桿菌陽性標本耐藥基因檢測顯示有3例發(fā)生耐藥基因突變，其中2例為利福平耐藥，1例為異煙肼耐藥，沒有檢測到多重耐藥菌株。結(jié)論TB-IGRA-GC在皮膚結(jié)核診斷上具有簡便快速、靈敏度高、特異性好的優(yōu)點，同時能進行分枝桿菌菌種鑒定和耐藥基因檢測，更有利于皮膚結(jié)核的發(fā)現(xiàn)、防控以及準確治療，可作為臨床皮膚結(jié)核實驗室診斷的常規(guī)標準方法。

【關(guān)鍵詞】皮膚結(jié)核；實驗室檢測；TB-IGRA-GC；基因芯片；耐藥基因檢測

皮膚結(jié)核是由結(jié)核桿菌引起的肺外部慢性皮膚病，臨床表現(xiàn)具有多樣性，癥狀不典型，臨床誤診、漏診率高[1]。當(dāng)前我國皮膚結(jié)核的發(fā)病率處于回升趨勢，同時在疑似結(jié)核病的臨床病例中，非結(jié)核分枝桿菌感染所占比例較高(11.1%)，而非結(jié)核分枝桿菌對結(jié)核病一線藥物異煙肼和利福平等的不敏感率達83.7%，且結(jié)核分枝桿菌耐藥性呈逐年上升趨勢[2]，盡早確診皮膚結(jié)核病及菌種和耐藥基因，對防控和治療皮膚結(jié)核病尤為關(guān)鍵[3]。目前，臨床實驗室用于結(jié)核病診斷的方法有細菌培養(yǎng)法、抗結(jié)核抗體檢測法(PPD)、抗酸染色涂片法及分子生物學(xué)檢測法等[4]。痰菌培養(yǎng)是實驗室檢測結(jié)核分枝桿菌的金標準，但需耗時數(shù)周，這在很大程度上耽誤了疾病的治療，不利于結(jié)核病的防控；抗結(jié)核抗體檢測法雖相對快速，但常出現(xiàn)假陽性和假陰性；抗酸染色涂片法簡單、快速，但靈敏度差[5]。開發(fā)新的診斷結(jié)核病方法是世界衛(wèi)生組織遏制結(jié)核病全球計劃(2006～2015)的一部分[4]，同時每年有近10億美元花費在結(jié)核病診斷上[6]。近年來，隨著分子生物學(xué)檢測技術(shù)在結(jié)核分枝桿菌診斷中的應(yīng)用，除克服了傳統(tǒng)方法的諸多不足外，還能更快速、敏感、特異地鑒定結(jié)核分枝桿菌[7，9]。本文將TB-IGRA-GC、干擾素酶聯(lián)免疫法(TB-IGRA)、qRT-PCR法、抗酸染色涂片法用于皮膚結(jié)核患者的診斷中，并對4種方法的性能及優(yōu)缺點進行比較，以選取實驗室檢測皮膚結(jié)核的最佳方法。

1資料與方法

1.1一般資料選取2013年2月～2014年12月期間我院臨床確診為皮膚結(jié)核的患者34例為陽性對照組，男12例，女22例。14～40歲8例(23.53%)；40～60歲20例(58.82%)，60歲以上6例(17.65%)。其中面部尋常狼瘡22例，8例初始誤診為濕疹、皮炎；顏面栗粒性狼瘡4例，2例初始誤診為濕疹、皮炎；結(jié)核性紅斑2例；左下腳丘疹壞死、皮膚性結(jié)核2例；下肢皮膚結(jié)核2例；皮膚結(jié)核2例，初始誤診率為29.41%。選取同期非皮膚結(jié)核住院患者16例為陰性對照組。標本類型有靜脈血和創(chuàng)面分泌物。

1.2方法

1.2.1儀器與試劑主要儀器：XSP-36雙目生物顯微鏡(江西鳳凰光學(xué)公司)，Allegra X-15R臺式冷凍離心機(美國貝克曼庫爾特公司)，iMark多功能酶標儀(美國Bio-Rad公司)，CFX96 TouchTM熒光定量 PCR 檢測系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)，LuxScan10K-B微陣列芯片掃描儀(北京博奧公司)等。試劑：抗酸桿菌染色液(珠海貝索生物技術(shù)公司)，結(jié)核感染T細胞檢測試劑盒(北京萬泰生物公司)，結(jié)核分支桿菌核酸擴增熒光檢測試劑盒(達安基因公司)，晶芯分枝桿菌菌種鑒定試劑盒、晶芯結(jié)核分枝桿菌耐藥基因檢測試劑盒(北京博奧生物公司)等。

1.2.2AFS檢測收集患者創(chuàng)面分泌物，121℃高壓滅菌15min，待冷卻后，取0.2 ml于體積為1.5ml的無菌EP管中，加水至1.0ml，12 000rpm離心10min，取沉淀物涂片，后按抗酸桿菌染色液試劑盒說明書操作，以油鏡視野中觀察到抗酸桿菌為陽性。

1.2.3TB-IGRA檢測采集患者肝素抗凝靜脈血5ml，在2h內(nèi)各分裝1ml到N、T、P 3個培養(yǎng)管中，37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)22h ± 2h，以3000r/min 離心10min，吸取上清，ELISA按照結(jié)核感染T細胞檢測試劑盒說明書操作。

1.2.4qRT-PCR檢測蘸取患者創(chuàng)面處分泌物于1.5ml EP管中，加入250μl結(jié)核桿菌DNA提取液，封口膜封口，振蕩混勻，95℃加熱20min，12000rpm離心10min，上清轉(zhuǎn)移至新的1.5ml EP管中。按照結(jié)核分支桿菌核酸擴增熒光檢測試劑盒進行基因檢測操作。

1.2.5基因芯片檢測將方法1.2.4提取的上清液按照晶芯分枝桿菌菌種鑒定試劑盒、晶芯結(jié)核分枝桿菌耐藥基因檢測試劑盒說明書分別進行菌種鑒定、耐藥基因檢測。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。用t檢驗和2檢驗比較TB-IGRA-GC與TB-IGRA、qRT-PCR、AFS法在皮膚結(jié)核實驗室診斷上的差異，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1IFN-γ檢測陽性對照組血漿IFN-γ水平顯著高于陰性對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1　兩組患者IFN-γ檢測結(jié)果比較

注：與陰性對照組比較，①P<0.05

2.24種檢測方法敏感性比較TB-IGRA-GC與常規(guī)的TB-IGRA、 qRT-PCR法在皮膚結(jié)核分枝桿菌檢測中，其敏感性接近，均為88.2%，但TB-IGRA-GC檢測的特異性為100%，說明TB-IGRA-GC法在皮膚結(jié)核分枝桿菌檢測中敏感性優(yōu)于其它方法，見表2。

2.34種方法對結(jié)核分枝桿菌菌種和耐藥基因檢測TB-IGRA-GC法對兩組50例標本進行檢測，結(jié)果顯示，30例為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群陽性，非結(jié)核分枝桿菌1例(金色分枝桿菌)，見圖1。30例結(jié)核分枝桿菌陽性標本耐藥基因檢測顯示有3例發(fā)生耐藥基因突變，其中2例為利福平耐藥，1例為異煙肼耐藥，沒有檢測到多重耐藥菌株(見圖2)。TB-IGRA、qRT-PCR、AFS法均不能進行非結(jié)核分枝桿菌菌種鑒定和耐藥基因檢測，見表3。

表2　4種方法對兩組50例患者敏感性比較

注：與AFS檢查比較，① P<0.05

圖1TB-IGRA-GC法結(jié)核分枝桿菌菌種檢測

Figure 1Strains detection of mycobacterium tuberculosis by TB-IGRA-GC

注：a.基因芯片檢測顯示為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群陽性；b.基因芯片檢測顯示為金色分枝桿菌

圖2TB-IGRA-GC法結(jié)核分枝桿菌耐藥基因檢測

Figure 2Resistance genes detection of mycobacterium tuberculosis by TB-IGRA-GC

注：a.基因芯片檢測顯示為利福平耐藥；b.基因芯片檢測顯示為異煙肼耐藥

表34種檢查方法對兩組50例患者標本的菌種和耐藥基因檢測(n)

Table 3Detecting of strains and resistance genes in 50 clinical cases by 4 methods

方法結(jié)核分枝桿菌非結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥異煙肼耐藥TB-IGRA-GC檢查30121TB-IGRA檢查31000qRT-PCR檢查30000AFS檢查12000

3討論

皮膚結(jié)核是一種由結(jié)核分枝桿菌引起的慢性皮膚病，致病原因是人體自身免疫力下降時，結(jié)核桿菌通經(jīng)血液和淋巴回流途徑感染皮膚所引起。該病臨床表現(xiàn)隱襲(發(fā)病過程緩慢，往往一年到數(shù)年之久)、不典型(皮膚結(jié)核早期一般無自覺癥狀，有些患者僅僅在感染后才伴有局部疼痛、搔癢等臨床表現(xiàn))、多樣性(根據(jù)結(jié)核桿菌毒性、數(shù)量和機體免疫力以及侵入途徑不同，其臨床表現(xiàn)癥狀也不同，主要的表現(xiàn)癥狀為丘疹、斑塊、膿皰、伴感染的結(jié)節(jié)潰瘍或孢子絲菌病樣皮損，可波及大片皮膚損壞、鼻耳口唇眼瞼等處形成瘢痕甚至毀容等)、易誤診(與多種皮膚疾病相似)。近年來我國皮膚結(jié)核的發(fā)病率處于上升趨勢，由非結(jié)核分枝桿菌 (NTM) 與結(jié)核分枝桿菌 (TB) 所引發(fā)的疾病臨床表現(xiàn)十分相似，而治療方案又不相同，且結(jié)核桿菌的耐藥程度每年呈上升趨勢，為了提高對皮膚結(jié)核病的診斷、治療和疫情防控，篩選出準確有效的實驗室診斷皮膚結(jié)核的方法顯得尤為重要。

實驗室診斷皮膚結(jié)核病的檢測方法是防患和治療該病的基礎(chǔ)。常見的結(jié)核分枝桿菌診斷方法有結(jié)核桿菌微生物培養(yǎng)方法、結(jié)核菌素皮膚試驗、抗酸染色鏡檢方法等。痰菌培養(yǎng)作為結(jié)核桿菌判定的金標準，但因其耗時長(需8周左右)、P2級以下實驗室不允許做、培養(yǎng)基不固定(常用的培養(yǎng)基有L?wenstein-Jensen培養(yǎng)基、Middlebrook 7H10或7H11半合成培養(yǎng)基、BACTEC 460、BACTEC MGIT 960等)等方面的局限，使其應(yīng)用范圍大大受限[10,11]。結(jié)核菌素皮膚試驗法是用5個單位的結(jié)核菌素(0.1 ml)進行皮內(nèi)注射，在48～72小時內(nèi)，局部有超過5mm的硬結(jié)即為陽性。此法最為常見，但其靈敏度不穩(wěn)定為33%～96%；特異性為62.5%[12]。同時，2個月以下的嬰兒、孕婦、糖尿病患者、腎衰竭、免疫受損患者會出現(xiàn)假陰性；艾滋病患者、1年以內(nèi)接種過疫苗并感染了非典型結(jié)核分枝桿菌的兒童、長期在結(jié)核桿菌環(huán)境中生活的人會顯示出假陽性反應(yīng)。較低的敏感性、特異性及假陰性和假陽性結(jié)果使該方法不能準確診斷皮膚結(jié)核，從而耽誤了治療皮膚結(jié)核的最佳時間，給患者帶來了更大的痛苦?？顾崛旧科ㄒ云洳僮骱啽?、價格低廉而被廣泛應(yīng)用于皮膚結(jié)核實驗室診斷。它是基于結(jié)核分枝桿菌厚厚的脂肪壁能被染色，包括萋-泥染色法(Ziehl-Neelsen staining)、金永染色法(Kinyoun staining)和金胺-羅丹明熒光染色法(auramine-rhodamine fluorochrome staining)，其中萋-泥染色法是最常用的。但每毫升需超過104菌量才能被確定為陽性，同時諾卡氏菌、棒狀桿菌、非結(jié)核分枝桿菌也能被染色，這影響 降低了該方法的檢出率和準確性[3]。面對上述方法存在的各種弊端及現(xiàn)實情況的需求，選擇一種快速、敏感、特異、適合于實驗室診斷皮膚結(jié)核的方法迫在眉睫。

近年來，由于TB-IGRA、qRT-PCR法在結(jié)核病和分枝桿菌檢測中快速、敏感、高效等特點，使其初步應(yīng)用在皮膚結(jié)核的實驗室診斷中。與以往的常規(guī)方法相比，TB-IGRA通過檢測結(jié)核分枝桿菌特異性重組抗原刺激感染者的特異性T淋巴細胞釋放的IFN-γ，此法操作簡便、靈敏度高，同時能檢出潛伏性皮膚結(jié)核，排除卡介苗及其他致病性非結(jié)核分枝桿菌的干擾，降低假陽性率[13]。qRT-PCR是一種在DNA擴增反應(yīng)中，以熒光化學(xué)物質(zhì)實時測每次聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法，此法操作快速、靈敏度高[14]。但上述兩種方法均不能對結(jié)核桿菌進行菌種和耐藥基因檢測。

本文利用TB-IGRA-GC、TB-IGRA、qRT-PCR、AFS法分別對50例患者進行皮膚結(jié)核檢測，結(jié)果顯示：AFS操作簡單、快速，實驗室準入門檻低，但敏感性僅為23.5%，與肖作漢等[15]報道結(jié)果一致；TB-IGRA檢測血漿中的IFN-γ，間接反映人體中結(jié)核分枝桿菌感染情況，其對結(jié)核病的準確性達88.2%，同時結(jié)核患者的IFN-γ水平明顯高于非結(jié)核病患者，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；qRT-PCR的敏感性為82.4%，與AFS相比，qRT-PCR的敏感性顯著高于AFS，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但它不能進行潛伏性皮膚結(jié)核檢測，同時上述三種方法均不能進行菌種和耐藥基因檢測。而TB-IGRA-GC法，對TB-IGRA判定為陽性的患者再進行基因芯片法分枝桿菌菌種鑒定和耐藥基因檢測，在保證較高的確診率時，同時還能在感染早期快速、準確地對分枝桿菌進行菌種和耐藥基因檢測，對疾病的診斷、準確治療和控制具有重要意義。

4結(jié)論

研究結(jié)果顯示，采用TB-IGRA-GC與TB-IGRA、PCR、AFS進行皮膚結(jié)核檢測比較，從臨床上驗證了TB-IGRA聯(lián)合基因芯片法在皮膚結(jié)核檢出率、菌種鑒定以及耐藥基因檢測方面明顯優(yōu)于其它檢查方法、可將其作為皮膚結(jié)核在實驗室診斷的常規(guī)標準方法。

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基金項目：蘭州軍區(qū)科研面上項目(LZP2012035)

通訊作者：白潔，E-mail：262717254@qq.com

【中圖分類號】R 529.4

【文獻標志碼】A

doi：10.3969/j.issn.1672-3511.2016.07.029

(收稿日期：2015-09-11；編輯：陳舟貴)

The comparative study of laboratory detection methods on cutaneous tuberculosis

ZHANG Quanhua1,LI Guixia1,BAI Jie1,et al

(1.Department of Clinical Laboratory,Anning Branch Hospital,General Hospital of Lanzhou Military Area Command,Lanzhou 730070,China; 2.Department of Dermatology,Anning Branch Hospital, General Hospital of Lanzhou Military Area Command,Lanzhou 730070,China)

【Abstract】ObjectiveTo analyze and compare the laboratory detection methods of cutaneous tuberculosis,including smear acid-fast stain (AFS),interferon-gamma release assay (TB-IGRA),real-time quantitative polymerase chain reaction (qRT-PCR),TB-IGRA combined with gene chip (TB-IGRA-GC,GC identification of mycobacterium and detection of drug-resistant genes by gene chip) and discuss their clinic efficacy,and select the most reasonable laboratory diagnosis method for cutaneous tuberculosis.Methods34 cutaneous tuberculosis patients were used as positive control.16 noncutaneous tuberculosis patients were used as negative control.Collecting the information about the sensitivity and identification of mycobacterium and the drug-resistant genes detecting of AFS,TB-IGRA,qRT-PCR,TB-IGRA-GC,and then statistically analyzed and compared the results of the four groups.ResultsThe results showed that the sensitivity of TB-IGRA-GC and TB-IGRA for the detection of cutaneous tuberculosis were both 88.2%,But qRT-PCR and AFS were 82.4% and 23.5%.There were significant differences between AFS and other methods (P<0.05).Among the 50 cases,TB-IGRA-GC found that 30 cases were mycobacterium tuberculosis complex.1 case was nontuberculous mycobacteris (Mycobacteria aurum).30 Mycobacterium positive samples showed drug-resistant genes.3 cases showed drug-resistant genes mutation.2 cases were rifampicin.1 case was isoniazid.The multiple resistant strains were not detected.ConclusionCompared with AFS,TB-IGRA,qRT-PCR and TB-IGRA-GC are the most convenient,rapid,sensitive and specificity laboratory method for diagnosing cutaneous tuberculosis.Meanwhile,they can identify the mycobacterium strains and detect drug resistance gene.This is conducive to detect,prevent and treat cutaneous tuberculosis.

【Key words】Cutaneous tuberculosis; Laboratory detection; TB-IGRA-GC; Gene chip; Drug-resistant genes detecting