王　瑩

(遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院 輸血科,遼寧 沈陽110032)

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疑難ABO血型標本的表型與相應等位基因的檢測

王瑩

(遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院 輸血科,遼寧 沈陽110032)

摘要：目的探討分析疑難ABO血型標本與其等位基因的檢測，為臨床遇到的疑難ABO血型標本提供可靠的血型鑒定方法。方法選取2013年8月到2014年8月期間在筆者就職醫(yī)院各科室送檢的臨床病人血液樣本9例，首先按照常規(guī)血型檢測技術進行ABO血型血清學試驗，確定ABO正反定型，再采用鹽酸胍/蛋白酶K裂解提取法對ETDA抗凝處理后的靜脈外周血進行DNA提取，再使用聚合酶鏈反應- 序列特異性引物法( PCR- SSP)對9例血樣進行ABO 血型基因分型檢測。結果9例臨床病人血清學表型為：AxB 2例、AB亞1例、A亞B亞1例，Ax 2例，B亞3例，9例患者基因型分別為為：A/B 4例,A/O 2例,B/O 3例,通過PCR-SSP檢測所得基因型與血清學表型結果相一致。結論利用聚合酶鏈反應- 序列特異性引物法( PCR- SSP)對血清學方法鑒定ABO血型結果為正反不定型的疑難血型標本進行基因型檢測，能準確地確定患者的血型抗原，為臨床疑難ABO血型患者制定安全有效的用血方案提供保障。

關鍵詞：疑難ABO血型標本； 等位基因；聚合酶鏈反應- 序列特異性引物法

(ChinJLabDiagn,2016,20:1113)

自1900年奧地利維也納大學的Dr.Landsteiner提出ABO血型系統(tǒng)以來，ABO血型系統(tǒng)一直是臨床用血時起至關重要的血型系統(tǒng)，由于ABO血型系統(tǒng)具有多種亞型包括Aw型、A3型、Ael型、ABx型、AwB型、AxB型、A3B型等，又或者機體存在疾病干擾了血型表型，自身抗體導致紅細胞致敏及RhD變異出現(xiàn)弱D和極弱D的情況，在這些情況下常規(guī)的血清學檢測往往對這些發(fā)生抗原抗體不規(guī)則反應的疑難ABO血型標本無法做出準確鑒別，無法制定用血計劃對臨床患者的用血造成了不便。近年來DNA分子檢測技術的不斷發(fā)展為準確鑒別這些疑難ABO血型標本亞型提供了新的可能[1,2]。筆者通過穩(wěn)定的PCR-SSP技術對筆者所在醫(yī)院各科室送檢的疑難 ABO 血型標本進行了ABO基因型測定，解決了9例疑難ABO血型標本的鑒定，現(xiàn)報告如下。

1資料與方法

1.1一般資料

選取2013年8月到2014年8月期間筆者就職醫(yī)院各科室送檢的臨床病人血液樣本9例，均采用EDTA-K2抗凝。

1.2研究方法1.2.1常規(guī)血清學技術檢測血樣血清學分型所有血樣檢測所用的抗A抗體、抗A1抗體、抗B抗體、抗AB抗體及抗H抗體均為同一家公司制備，用于檢測的ABO試劑則由筆者所在醫(yī)院自行制備。

1.2.2DNA提取將所選的9例患者經(jīng)EDTA-K2抗凝的全血5mL按照鹽酸胍/蛋白酶K裂解提取法進行目的基因提取，最終得到300 μl左右的DNA。

1.2.3PCR擴增①設計引物，按照ABO核苷酸序列設計特異性引物，以HGH作為內對照基因，HGH5G-GCCTTCCCAACCATTCCCTTA-3C,5C-TCACGGATTTCTGTTGTGTTTC-3C；其余序列分別為：(1)Mix-15i-AGGAAGGATGTCCTCGTGGTA-3G，5G-GCCCACGTGGTCGCGGAAC-3C(2)Mix-25i-GGAAGGATGTGCTCGTGGTGA-3G，5G-CCCCGAAGAACCCCCCCAG-3C(3)Mix-35i- GGAAGGATGTGCTCGTGGTGA-3G，5G-GCCCACGTGGTCGCGGATC-3C(4)Mix-45i- AGGAAGGATGTCCTCGTGGTA-3G，5G-G-

CCCACGTGGTCGCGGATC-3C(5)Mix-55i-GGAAGGATGTGCTCGTGGTGA-3G，5G-CCCC-

GAAGAACGCCCCCAT-3C(6)Mix-65i-GGAAG-

GATGTGCTCGTGGTGA-3G，5G-TGCTTCCGTAGAAGCTGGG-3G，均為美國G&T公司試劑盒內所配。②PCR擴增，在熱啟動技術下將體積為1 μl的提取的目的基因，1 μl的美國Promega公司所購的Taq Polymerase即DNA聚合酶，以及由特異性引物、dNTPs，緩沖液和內對照引物混合而成的7 μl SIGMA公司所產(chǎn)的HLA基因分型引物，共計總體積為9 μl的PCR反應物在95℃進行5 min的預熱后，于95℃下變性30s，60℃下退火30 s，72℃下進行1.5 min的延伸，上述操作過程循環(huán)進行30次，完成后在72℃下延伸5 min,最后降溫到4℃。

1.2.4利用凝膠電泳進行PCR產(chǎn)物分析對PCR最后所得產(chǎn)物進行凝膠電泳，均采用由同種緩沖液制備的2%瓊脂糖凝膠，進行EB染色后在100 V電壓下進行20 min的電泳，并于紫外線燈下拍照記錄電泳結果。

1.2.5電泳結果判定記錄的電泳結果中有特異性擴增產(chǎn)物的為陽性反應，其ABO基因型的判定如圖1。

1為O基因電泳圖譜，2為B基因電泳圖譜，3為A201基因電泳圖譜，4為A基因電泳圖譜

2結果

2.19例臨床病人血清學表型結果

9例臨床病人血清學表型為：AxB 2例、AB亞1例、A亞B亞1例，Ax 2例，B亞3例，詳見表1。

表1　9例臨床病人血清學表型結果

2.29例患者基因型及PCR結果

9例患者基因型分別為為：A/B 4例,A/O 2例,B/O 3例,通過PCR-SSP檢測所得基因型與血清學表型結果相一致，詳見表2。

表2　9例患者基因型及PCR結果

3討論

在人類紅細胞的表面存在多種抗原，這些同種異型抗原分類組合即血型系統(tǒng)，已知的血型系統(tǒng)有80余種血型系統(tǒng)，包括ABO型血型系統(tǒng)，MNS血型系統(tǒng)，P血型系統(tǒng) ，Rh血型系統(tǒng)，Lutheran血型系統(tǒng)，Kell血型系統(tǒng)，Lewis血型系統(tǒng)， Duffy血型系統(tǒng)，Kidd血型系統(tǒng)， Hh/孟買血型系等，這些系統(tǒng)都獨立遺傳存在，控制所有血型系統(tǒng)遺傳的遺傳基因位于同一染色體上[3]。其中在臨床中最重要的血型系統(tǒng)為ABO系統(tǒng)和Rh系統(tǒng)，ABO系統(tǒng)同樣具有多種表型和亞型，ABO遺傳基因位于9q34.1-9q34． 2位點，同源性極高，僅有單個堿基或幾個堿基替換，為高度保守的核苷酸序列，其分子基礎為高度同源的糖原在半乳糖轉移酶的作用下與H前體的半乳糖相連所形成。有研究表明血清學ABO亞型的鑒定具有一定的不可靠性,我國目前ABO系統(tǒng)亞型多有報道，但這些報告往往缺乏核苷酸突變的實驗結果，并且血清學檢測受單克隆抗體的不同、實驗所選擇的試劑特異性差別、抗原基因改變、各實驗室檢測條件的不同、甚至操作者操作不同的影響[4,5]，筆者建議對這些抗原抗體不規(guī)則反應的血液標本應進一步進行基因定型檢測，以實驗結果作為亞型診斷的可靠依據(jù)，對實驗資質較差的單位應將此類血液樣本送往區(qū)域或國家級別的參比實驗室進行進一步的確認，以防誤診，這是因為抗-A、抗-B及抗-AB抗體天然就在人體血清內存在，因此哪怕只輸入僅僅幾毫升的血型不相配血液就能引起嚴重的溶血反應甚至引起患者死亡的嚴重后果[6]。因此在臨床實踐中，確定ABO血型定型至關重要，本研究采用穩(wěn)定的PCR-SSP法，操作簡便快捷，且對ABO血型亞型鑒定準確，可排除因自身抗體或不規(guī)則抗體導致的誤差也能排除由于白血病、骨髓異常增生綜合征等腫瘤導致的ABO血型亞型改變，也不受細菌和血紅蛋白紊亂等原因造成的假凝集現(xiàn)象的干擾，對標本要求低不局限于血液，所有有核細胞均可作為實驗樣本包括皮膚毛囊、血跡血痕、羊水、組織塊、精斑等均可作為樣本經(jīng)過PCR擴增取得合格的實驗結果，同時PCR-SSP技術的標本易于取材、保存和運輸，在不同的實驗室用進行的實驗其結果具有可比性，能彌補常規(guī)血清學檢測的不足，區(qū)別于常規(guī)血清學檢測只能鑒定血液樣本的表型，PCR-SSP技術能準確鑒定血型亞型及雜合子與純合子，對于難以鑒定的亞型和產(chǎn)前胎兒血型診斷等具有重要意義，其對取材的廣泛性也使之能在法醫(yī)鑒定、遺傳鑒定等領悟內發(fā)揮作用[7,8]。

本研究結果表明[9,10]，經(jīng)過血清學檢測9例臨床病人血清學表型為：AxB 2例、AB亞1例、A亞B亞1例，Ax 2例，B亞3例，使用實驗室穩(wěn)定的PCR-SSP技術檢測9例患者基因型分別為為：A/B 4例，A/O 2例，B/O 3例，通過PCR-SSP檢測所得基因型與血清學表型結果完全一致。

參考文獻：

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文章編號：1007-4287(2016)07-1113-03

中圖分類號：R446.11

文獻標識碼：A

(收稿日期：2015-04-28)

Difficulty of ABO blood group specimen phenotype and gene detection

WANGYing.

(TheHospitalAffiliatedtoLiaoningUniversityofTCM,Shenyang110032,China)

Abstract:ObjectiveTo study the analysis of difficult specimens of ABO blood group and its allele detection,for clinical encounter difficulty provide reliable blood specimens of ABO blood group identification method.MethodsSelected during August 2013 to August 2014 working in the hospital each department makes clinical patient blood samples from 9 cases,first of all,according to the conventional blood detection techniques for ABO serological test,determine ABO positive and negative stereotypes,again using guanidine hydrochloride/proteinase K cracking after extraction of ETDA anticoagulant treatment of peripheral vein for DNA extraction,then using the method of polymerase chain reaction sequence specific primers (PCR SSP) ABO blood group 9 cases of blood sample genotyping detection.Results9 cases of clinical serological phenotype for patients:AxB in 2 cases,AB,and 1 case,and A and B,and 1 case,Ax in 2 cases,B,and 3 cases,9 cases of patients with genotype,respectively is:A/B 4 cases,2 cases of A/O,B/O 3 cases,measured by PCR - SSP genotype is consistent with the results of serological phenotype.ConclusionUsing the method of polymerase chain reaction sequence specific primers (PCR SSP) ABO blood group identification results of serological method for positive and negative don't finalize the design difficulty of blood specimens tested genotypes,to accurately determine the patient's blood group antigen,for clinical patients with complicated ABO blood group provide guarantee for safe and effective blood scheme.

Key words:difficult specimens of ABO blood group;Allele.The method of polymerase chain reaction sequence specific primers