錢　琤,司　宇,徐貴霞,葉　辛,谷明莉,任傳路,吳天勤*,鄧安梅*

(1.解放軍第100醫(yī)院，江蘇 蘇州215007；2.第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院，上海200433)

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原發(fā)性免疫性血小板減少癥患者外周血IL-23p19基因表達(dá)及意義

錢琤1,司宇2,徐貴霞2,葉辛2,谷明莉2,任傳路1,吳天勤1*,鄧安梅2*

(1.解放軍第100醫(yī)院，江蘇 蘇州215007；2.第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院，上海200433)

摘要：目的研究IL-23p19在原發(fā)性免疫性血小板減少癥(Primary immune thrombocytopenia，ITP)患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中的表達(dá)及意義。方法采用實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)檢測(cè)了55例ITP和35例健康對(duì)照外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中IL-23p19基因表達(dá)量，分析ITP患者IL-23p19基因表達(dá)與疾病分期、血小板數(shù)及細(xì)胞因子的相關(guān)性。結(jié)果ITP患者外周血PBMC 中IL-23p19基因表達(dá)較健康對(duì)照明顯增高，且慢性ITP和難治性ITP IL-23p19基因表達(dá)均高于新診斷期，難治性ITP高于持續(xù)性ITP；ITP患者IL-23p19表達(dá)與PLT呈負(fù)相關(guān)，與IL-17水平呈正相關(guān)，與IFN-γ、IL-4、IL-10無相關(guān)性。結(jié)論IL-23p19基因在ITP中表達(dá)升高，IL-23表達(dá)異常與ITP發(fā)病密切相關(guān)。

關(guān)鍵詞：原發(fā)性免疫性血小板減少癥；白介素23 p19；自身免疫性疾病

(ChinJLabDiagn,2016,20:1068)

原發(fā)免疫性血小板減少癥(primary immune thrombocytopenia，ITP)是一種以血小板減少為特點(diǎn)的獲得性自身免疫性疾病，以出血為主要臨床表現(xiàn)。其經(jīng)典機(jī)制認(rèn)為是由于自身抗體致敏的血小板被單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)過度破壞所致。近年來研究發(fā)現(xiàn)，除體液免疫外，細(xì)胞免疫在ITP的發(fā)病中亦起著重要作用。ITP患者出現(xiàn)Th1細(xì)胞極化，Th17細(xì)胞增加，某些相關(guān)的細(xì)胞免疫效應(yīng)分子的表達(dá)也出現(xiàn)異常[1]。

IL-23作為IL-12 細(xì)胞因子家族的新成員，由IL-23p19 和 IL12p40 組成異源二聚體分子。IL-23具有十分復(fù)雜的生物學(xué)功能，在抗感染免疫、抗腫瘤免疫以及自身免疫病的發(fā)病中發(fā)揮著重要的作用[2]。本研究用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)ITP患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)IL-23p19基因的表達(dá)情況，并分析在疾病不同時(shí)期IL-23p19表達(dá)情況與血小板計(jì)數(shù)及細(xì)胞因子表達(dá)的相關(guān)性，以期為臨床診斷及治療提供新的線索。

1對(duì)象與方法

1.1對(duì)象2013年-2014年間在我院就診ITP 患者共55例，其中男性25例，女性30例，平均年齡35歲(16-60)歲，包括16例新診斷的ITP、12例持續(xù)性ITP、20例慢性ITP、7例難治性ITP患者，診斷標(biāo)準(zhǔn)參照成人原發(fā)免疫性血小板減少癥診治的中國專家共識(shí)(修訂版)[3]。35例正常體檢志愿者為健康對(duì)照組。本研究經(jīng)過倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2血樣標(biāo)本的采集與PBMC的分離采集空腹靜脈血5 ml，置于枸櫞酸鈉抗凝劑的無菌試管中。采用密度梯度離心法分離PBMC(sigma)。

1.3RNA抽提與反轉(zhuǎn)錄采用Trizol法抽提細(xì)胞總RNA，將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，-20℃冰箱備用。細(xì)胞總RNA 抽提試劑盒Invitrogen公司及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒Applied Biosystems公司。

1.4定量PCR采用Taqman探針技術(shù)以18s rRNA 為內(nèi)參將逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。IL-23p19引物序列為：上游5′- CAGCTTCATGCCTCCCTACTG -3′下游5′AGGCTTGGAATCTGCTGAGTCT-3’, 探針FAM-AACTCCTGCAGCCTGA-MGB；內(nèi)參18s RNA 上游5′- ACATCCAAGGAAGGCAGCAG -3′;下游5′-TTCGTCACTACCTCCCCGG-3′;FAM-CGCGCAAATTACCCACTCCCGA-TAMRA。 PCR反應(yīng)條件為：50℃ 2 min,95℃ 10 min隨后95℃ 15 S，60℃ 1 min循環(huán)45次。讀取每個(gè)定量PCR反應(yīng)的閾循環(huán)(CT)值后，將定量PCR結(jié)果以2-ΔΔCT表示。ΔΔCT =[ΔCT (患者) ]-[ΔCT(對(duì)照) ],ΔCT = [CT(靶基因)]-[CT(管家基因)] 。

1.5臨床實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的檢測(cè)采用Sysmex XN-1000全血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測(cè)定血小板(PLT)計(jì)數(shù)。

1.6血清細(xì)胞因子的檢測(cè)IL-17、IFN-γ、IL-4、IL-10和濃度測(cè)定根據(jù)ELISA試劑盒操作說明進(jìn)行測(cè)定。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用graphpad prism5.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,兩組之間比較采用Student’s t檢驗(yàn)，多組資料的比較采用方差分析檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Pearson法，以P<0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1ITP患者PBMC中IL-23p19表達(dá)

結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，ITP患者中PBMC IL-23 p19 mRNA表達(dá)量顯著增高(fold= 8.32，t=13.36，P<0.0001)， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖1A。

2.2ITP患者PBMC中IL-23p19mRNA分期表達(dá)結(jié)果

不同分期的ITP患者IL-23p19基因表達(dá)有差異(P<0.05)，相對(duì)表達(dá)量分別為新診斷6.50±2.60 ；持續(xù)性7.033±2.54；慢性9.58±2.86；難治性11.11±3.56，見圖1B。與新診斷ITP相比，慢性ITP和難治性ITP IL-23p19基因表達(dá)均升高(新診斷ITP vs 慢性ITP，q=4.616，P<0.05) 新診斷ITP vs 難治性ITP，q=5.120，P<0.01)；與持續(xù)性ITP相比，難治性ITP表達(dá)升高(q=4.319，P<0.05)。

A． ITP與正常健康對(duì)照組IL-23mRNA表達(dá) *P<0.001與健康對(duì)照比較；B． ITP不同分期IL-23mRNA表達(dá) *P<0.05，與新診斷ITP比較；**P<0.05，與持續(xù)性ITP比較

圖1不同組別外周血單個(gè)核細(xì)胞IL-23mRNA表達(dá)

2.3ITP患者外周血PBMC中IL-23p19表達(dá)與PLT及細(xì)胞因子的相關(guān)性分析

ITP患者PBMC 中IL-23p19與PLT呈負(fù)相關(guān)(r=-0.4070，P<0.01)，見圖2A；與血清IL-17呈正相關(guān)(r=0.446 3，P<0.01)，見圖2B，IL-23p19 mRNA的表達(dá)量與IFN-γ、IL-4、IL-10等不相關(guān)。

A IL-23p19mRNA表達(dá)與血小板計(jì)數(shù)的相關(guān)性分析B IL-23p19mRNA表達(dá)與的血清IL-17表達(dá)相關(guān)性分析

3討論

ITP是一種常見的出血性自身免疫性疾病，以血清中出現(xiàn)抗血小板抗體為特征，臨床上出現(xiàn)由于免疫功能異常紊亂導(dǎo)致的出血癥狀。近年研究表明，細(xì)胞免疫功能異常在疾病致病過程中發(fā)揮重要作用，包括B細(xì)胞、 T細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞免疫功能異常，而其中T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)在ITP的發(fā)病過程中起到至關(guān)重要的作用[4]。

IL-23是異二聚體分子，除了與IL-12共用一個(gè)亞基p40外，自己還有獨(dú)特的亞基IL-23p19。內(nèi)皮細(xì)胞和 B細(xì)胞、T細(xì)胞、MΦ和DC都能表達(dá)p19 mRNA[5]。盡管IL-23與IL12的結(jié)構(gòu)類似，但功能并不完全相同，IL-12主要是促使Th0向Th1分化，而IL-23主要作用于記憶T細(xì)胞，促進(jìn)其分化。研究發(fā)現(xiàn)在自身免疫性疾病模型EAE和RA中IL12 促進(jìn)了幼稚T細(xì)胞的分化，而IL-23是在最后階段介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵效應(yīng)因子[6]。IL-23表達(dá)增多參與多種自身免疫性疾病，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[7]、多發(fā)性硬化[8]、炎癥性腸病[9]等。本研究檢測(cè)了ITP 患者及健康對(duì)照組外周血PBMC IL-23p19mRNA的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與正常對(duì)照組相比，ITP患者PBMC中IL-23 p19mRNA表達(dá)量顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明IL-23p19的表達(dá)增高與ITP的發(fā)病密切相關(guān)。我們進(jìn)一步研究了不同疾病分期IL-23p19mRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)慢性期和難治性表達(dá)均高于新診斷期，難治性ITP高于持續(xù)性ITP，表明IL-23p19 mRNA表達(dá)水平在疾病早期低表達(dá)，隨著疾病的進(jìn)一步發(fā)展，進(jìn)入到疾病后期明顯升高，分析原因可能是由于ITP后期以炎癥反應(yīng)為主，高表達(dá)的IL-23p19主要在疾病的后期促炎癥反應(yīng)中發(fā)揮效應(yīng)。

患者外周血PLT計(jì)數(shù)，可以在一定程度上反映出ITP的嚴(yán)重程度和疾病的進(jìn)展?fàn)顩r，本研究發(fā)現(xiàn)IL-23p19基因表達(dá)與PLT計(jì)數(shù)呈負(fù)相關(guān)，表明IL-23p19可以成為評(píng)價(jià)疾病嚴(yán)重程度的潛在指標(biāo)之一。本研究還發(fā)現(xiàn)，IL-23p19與IL-17表達(dá)具有相關(guān)性，這可能是由于IL-23通過與IL-23R結(jié)合，促進(jìn)IL-23R細(xì)胞內(nèi)酪氨酸殘基磷酸化，導(dǎo)致STAT3磷酸化，進(jìn)入細(xì)胞核，促進(jìn)T細(xì)胞活化為Th17細(xì)胞，從而釋放IL-17，導(dǎo)致血清IL-17表達(dá)增高。

本實(shí)驗(yàn)建立了IL-23p19基因表達(dá)的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法，首次從分子水平證實(shí)了IL-23p19基因在ITP患者中的表達(dá)增高，提示IL-23p19與ITP的發(fā)生發(fā)展存在一定相關(guān)性，IL-23p19基因表達(dá)為ITP的臨床診斷及治療提供了新的思路。

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基金項(xiàng)目：國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973)項(xiàng)目(2013CB531606)；國家自然科學(xué)基金(81471605，81401358)；南京軍區(qū)重點(diǎn)基金項(xiàng)目(15ZD009)；南京軍區(qū)面上項(xiàng)目(14MS026)

*通訊作者

文章編號(hào)：1007-4287(2016)07-1068-04

中圖分類號(hào)：Q786

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

作者簡(jiǎn)介：錢琤(1978-)，女，醫(yī)學(xué)博士，主治醫(yī)師，主要從事自身免疫病及機(jī)制研究。司宇(1990-)，女，在讀研究生，主要從事自身免疫病研究，為共同第一作者。

(收稿日期：2015-03-26)

Expression of IL-23p19 in perpheral blood of patients with primary immune thrombocytopenia

QIANCheng1,SIYu2,XUGui-xia2,etal.

(1.DepartmentofLaboratoryMedicine,No.100HospitalofPLA,JiangsuSuzhou215007,China;2.LaboratoryDiagnostics,ShanghaiChanghaiHospital,Shanghai200433,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the expression of IL-23p19 in perpheral blood of patients with primary immune thrombocytopenia (ITP) and its clinical significance.MethodsThe real-time quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction ( RT-PCR) was used to determine the expression of IL-23p19 mRNA in the peripheral blood of 55 ITP patients and 35 healthy controls . The correlations between the expression of IL-23p19mRNA and the staging,platelet counts,serum cytokine concentrations of ITP patients were analyzed statistically.ResultsThe IL-23p19 mRNA level in PBMC of ITP was significantly higher than those in healty controls. Afterwards, higher levels of IL-23mRNA were found in patients with chronic ITP and refractory ITP than in patients with newly diagnosed ITP. Compared to persistent ITP, refractory ITP patients had increased IL-23p19mRNA levels.The IL-23p19 mRNA level in ITP patients were negatively correlated with the platelet counts, positively correlated with IL-17 in ITP patients,and there was no association with IFN-γ, IL-4 and IL-10. ConclusionThe IL-23p19 gene expression of PBMC in ITP patients is significantly elevated, indicating that IL-23 play an important role in the pathogenesis of ITP.

Key words:primary immune thrombocytopenia，refractory;IL-23p19;Autoimmue diseases