林風(fēng)武，張　川，梁飛海,程坤鵬，張　強，趙　巖

(1.吉林大學(xué)第三醫(yī)院 胸外科，長春130031； 2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 小兒外科，長春130000;3.吉林大學(xué)第四醫(yī)院 胸外科，長春130000；4.吉林大學(xué)第二醫(yī)院 內(nèi)分泌科，長春130000)

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慢性胃液吸入對大鼠移植肺損傷及機制的研究

林風(fēng)武1，張川2，梁飛海1,程坤鵬3，張強3，趙巖4*

(1.吉林大學(xué)第三醫(yī)院 胸外科，長春130031； 2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 小兒外科，長春130000;3.吉林大學(xué)第四醫(yī)院 胸外科，長春130000；4.吉林大學(xué)第二醫(yī)院 內(nèi)分泌科，長春130000)

肺移植是治療終末期肺病的最有效手段。但肺移植術(shù)后1、3、5年生存率分別為72%、56%及43%，落后于其它實體器官移植成活率[1]。食管胃返流疾病(Gastroesophageal Diseas,GERD)是影響肺移植術(shù)后生存率的一個因素。研究表明，移植肺與胃液的接觸與間質(zhì)性肺炎、慢性支氣管炎及哮喘等呼吸道疾病有關(guān)[2-4]。肺移植術(shù)后存在食管胃返流的病人發(fā)生肺功能障礙及急性排斥反應(yīng)的幾率增加，在抗返流手術(shù)后以上情況得到改善[5-8]。

目前胃液影響移植肺功能的具體機制仍不明確。比如胃液中起作用的是胃酸還是胃蛋白酶，胃液接觸是否和免疫排斥有協(xié)同作用等等。因此，本研究通過建立動物肺移植模型，模擬食管胃返流疾病小劑量反復(fù)胃液灌注，來進一步研究胃液對移植肺臟的損傷及其機理。

1材料與方法

1.1實驗動物

2012年1月至2013年12月期間共納入大鼠30只，隨機分配為兩組進行大鼠的左肺移植模型，A組為同系異體移植，B組為異系異體移植。

1.2實驗材料

1.2.1實驗手術(shù)器械持針器×1把、線剪×1把、組織剪×1把、紋氏鉗×4把、血管鉗×2把、顯微器械×1套(直頭顯微鉗、直頭顯微持針器、顯微彎剪、顯微直剪、眼科鑷子、無創(chuàng)血管夾)。

1.2.2主要試劑材料水合氯醛、阿托品注射液、肝素鈉注射液、青霉素、慶大霉素、生理鹽水、碘伏、酒精、靜脈留置針、2號慕絲線、5-0 poly可吸收線、8-0雙針醫(yī)用錦綸單絲線、注射器、無菌過濾器、醫(yī)用紗布、醫(yī)用脫脂棉球、無菌手套、無菌口罩、標(biāo)準(zhǔn)刻度尺等。

1.2.3主要儀器動物呼吸機、雙極電凝高頻電刀、手術(shù)放大鏡、冷光照明燈、制冰機、冰箱、超凈工作臺、恒溫循環(huán)水浴箱、倒置相差顯微鏡等。

1.2.4套管的制作套管由兩部分組成，包括套管體和套管柄，套管體1.5 mm-2.0 mm，套管柄1.0 mm。套管體的外表面通過微血管鉗鉗夾數(shù)次或剪出一個小裂痕以防止結(jié)扎后脫落，套管體下端可剪成鋸齒狀以防止脫落。肺動脈套管、肺靜脈套管和支氣管套管分別用18G、16G、14G靜脈留置針制作[9]。

1.3大鼠左肺肺移植模型建立

1.3.1麻醉術(shù)前禁食12 h，禁水6 h。2%異氟醚吸入麻醉后腹腔內(nèi)注射戊巴比妥(50 mg/kg ),約3-5 min大鼠意識喪失，呼吸平穩(wěn)，全身肌肉松弛。麻醉成功后固定四肢、頭部于操作臺面，胸腹部備皮。提起鼠舌，蚊式鉗伸入口腔內(nèi)上抬鼠舌根，暴露聲門，14G套管針改制的氣管插管插入大鼠氣管內(nèi)，接呼吸機。觀察大鼠是否呼吸平穩(wěn)、胸廓起伏有致，以確保氣管插管位置正確。容量模式控制呼吸，頻率80-100次/分，潮氣量10 ml/kg，氧濃度20%

1.3.2供體肺的切取消毒后采用胸腹正中入路，肋緣下切斷腹部入腹腔，提起劍突，沿胸壁內(nèi)側(cè)剪開膈肌進入胸腔。氣管插管的正確位置保證了機械通氣的有效性和入胸后大鼠的生命體征平穩(wěn)。暴露下腔靜脈并夾閉，剪開左心耳，18G套管針刺入下腔靜脈，緩慢注入肝素鹽水，直到肺臟變?yōu)樯n白顏色。游離結(jié)扎氣管，保持肺臟在半膨脹狀態(tài)，剪斷氣管，提起氣管，游離氣管食管間組織，然后離斷下肺韌帶、胸主動脈及下腔靜脈等結(jié)構(gòu)，取出心肺聯(lián)合體。

心肺聯(lián)合體放置于盛有少量冰鹽水的培養(yǎng)皿中，游離左側(cè)肺門，由肺靜脈開始，繼而肺動脈、支氣管。于左肺靜脈根部聯(lián)通少部分心房一起剪下，在支氣管上方游離左肺動脈并于左肺動脈剪斷；游離出左主支氣管，于其根部夾閉后離斷。采用外翻式套管技術(shù)完成肺動、靜脈及支氣管的套管操作：18G套管針改制的套管用于肺動脈，16G套管、14G套管分別用于肺靜脈和支氣管的套管操作。將相應(yīng)結(jié)構(gòu)穿過相應(yīng)套管并外翻，5-0絲線結(jié)扎穩(wěn)妥固定。

1.3.3受體肺臟切除及左肺移植受體麻醉、插管和機械通氣均同供體手術(shù)。剃毛消毒，左第4肋間入胸，以棉簽小心細致地將左肺撥至術(shù)野操作區(qū)，小文件夾子夾住左肺外緣將左肺拉出，寬膠布固定。肺門區(qū)暴露清楚，充分暴露游離支氣管、肺動脈、肺靜脈。盡量游離血管至最大長度，這樣就方便了接下來移植肺血管支氣管的套管插入。取出供體肺，緊鄰受體左肺置于受體胸腔上方。近心端橫行剪開左肺靜脈前壁，達管周1/3，生理鹽水沖洗管腔，顯微鑷子提起剪開處血管緣，顯微鑷子夾持供體左肺靜脈外翻包繞的套管，將其置入受體左肺靜脈內(nèi)。將之前已預(yù)留在受體左肺靜脈上得5-0絲線結(jié)成的外科結(jié)收緊，妥善將供體套管固定在受體左肺靜脈中，從而完成左肺靜脈的套管式吻合。應(yīng)用同樣操作完成左支氣管及左肺動脈的套管吻合。剪除受體左肺，按肺靜脈、肺動脈、支氣管的順序開放血管夾，恢復(fù)潮氣量，左肺還納入胸腔內(nèi)，留置引流，麻醉蘇醒后，帶自主呼吸頻率達到90次/分后拔除氣管插管。

1.3.4術(shù)后護理單籠喂養(yǎng)，自主飲水進食，觀察大鼠活動狀態(tài)，肌肉注射青霉素預(yù)防感染。

1.4試驗的分組

按以上方法陸續(xù)制作移植模型并按如下條件分組，然后小劑量胃液及中性胃液分別按實驗要求灌注：

A1組(4例)：同系異體移植鼠鹽水組( F344或WKY同系異體左肺移植)

A2組(5例)：同系異體移植鼠胃液灌流組( F344或WKY同系異體左肺移植)，

A3組(6例)：同系異體移植鼠中性胃液灌流組( F344或WKY同系異體左肺移植)，

B1組(4例)：異系異體移植鼠鹽水組(WKY移植至F344)

B2組(5例)：異系異體移植鼠胃液灌流組(WKY移植至F344)

B3組(6例)：異系異體移植鼠中性胃液灌流組(WKY移植至F344)

胃液及滴定至中性胃液對大鼠左肺移植模型灌注：吸入麻醉后氣管插管(16號軟套管)，左側(cè)臥位，由氣管插管內(nèi)深入一細膠管，由此管緩慢注入胃液等相應(yīng)液體。灌注開始時間為移植1周后，每周1次，每次劑量0.3 ml/kg體重，共12次，最后一次灌流后1周處死動物，進行標(biāo)本檢測。

1.5行移植肺大體觀測、肺功能及組織學(xué)檢查、免疫細胞檢測。

1．5．1標(biāo)本采集：大鼠麻醉機械通氣后，按供體肺切除方法操作，肋弓下剪開膈肌，暴露胸腔內(nèi)結(jié)構(gòu)，阻斷左、右上腔靜脈及下腔靜脈，由下腔靜脈緩慢低壓灌注生理鹽水，剪取心肺組織聯(lián)合體。

1.5.2觀察移植肺顏色、大小，并于切取后立即氣管插管于20 mmH2O壓力下通氣，測試肺臟膨脹百分度。觀察移植肺的大小、色澤、柔軟度及肺膨脹程度。剪取組織塊進行移植肺的HE染色及Masson染色觀察單核細胞等炎細胞浸潤，肺泡組織受損情況。

1.5.3觀察標(biāo)本的纖維化程度，鏡下肺纖維化程度分級標(biāo)準(zhǔn)參見相關(guān)文獻[10]。

1.5.4免疫組化檢測免疫細胞CD68及CD8。了解移植物局部免疫反應(yīng)情況。通過抗大鼠 CD68 和CD8單克隆抗體進行免疫組化分析?？勾笫驝D 68 識別長度為100 kd的單鏈糖蛋白，該單鏈糖蛋白主要表達在骨髓細胞的溶酶體膜上?？勾笫?CD8 識別大鼠的CD8 細胞表面抗原，在T淋巴細胞、大多數(shù)胸腺細胞和自然殺傷細胞表達。

1.6統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)分析通過SPSS version 20.0軟件完成。

2結(jié)果

2.1移植肺的外觀和 HE染色、Masson染色

A1組大鼠移植肺外觀色澤紅潤，肺組織彈性良好，肺組織切片鏡下見輕微單核細胞浸潤，未見明顯炎細胞；A2組大鼠移植肺外觀色澤較灰暗，肺組織膨脹較差，切片鏡下見大量單核細胞浸潤，彌漫散在炎細胞；A3組大鼠移植肺外觀色澤較紅潤，肺組織彈性較好肺組織切片鏡下見中度單核細胞浸潤，可見散在炎細胞。B1組大鼠移植肺外觀色澤紅潤，肺組織彈性良好，肺組織切片鏡下見輕微單核細胞浸潤，未見明顯炎細胞；B2組大鼠移植肺外觀色澤較灰暗，肺組織膨脹較差，切片鏡下見大量單核細胞浸潤，彌漫散在炎細胞；B3組大鼠移植肺外觀色澤較紅潤，肺組織彈性較好，肺組織切片鏡下見中度單核細胞浸潤，可見散在炎細胞。

2.2肺纖維化程度評分

兩組大鼠中的亞組分析中，胃液組及中和胃液組大鼠的肺纖維程度評分均較鹽水組評分高(P<0.05)。胃液組大鼠纖維程度評分高于中和胃液組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。B組各亞組大鼠纖維化評分均高于A組大鼠相應(yīng)各亞組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

表1　Comparison between Two groups and subgroups

*Asterisk indicates both gastric juice subgroup score and neutralized gastric juice subgroup score are respectively higher significantly than normal saline subgroup accordingly.

2.3通過抗大鼠 CD68 和CD8單克隆抗體進行免疫組化分析抗大鼠CD 68 識別長度為100 kd的單鏈糖蛋白，該單鏈糖蛋白主要表達在骨髓細胞的溶酶體膜上?？勾笫?CD8 識別大鼠的CD8 細胞表面抗原，在T淋巴細胞、大多數(shù)胸腺細胞和自然殺傷細胞表達。同系大鼠左肺移植在免疫組化分析中僅見到少量 CD68+或CD8+細胞，A1、A2和A3之間CD68+或CD8+細胞無明顯差別，提示與是否存在胃液返流無明顯關(guān)系。同時，免疫組化分析觀察到在異系大鼠左肺移植中存在顯著差別的CD8+和CD68+細胞表達，提示異系大鼠的免疫排斥反應(yīng)對移植肺的存活質(zhì)量存在顯著影響，并且胃液返流與大鼠免疫排斥之間存在協(xié)同作用。

3討論

肺移植是治療終末期肺病的最有效手段。但肺移植術(shù)后生存率落后于其它實體器官移植成活率。如何減少肺移植術(shù)后并發(fā)癥，提高肺移植預(yù)后一直是研究的重點，其中胃液返流在肺移植術(shù)后并發(fā)癥的作用方面引起了許多學(xué)者的注意[10，11]。

本實驗所用的大鼠左肺移植的改良模型，可以增加實驗效率及準(zhǔn)確率。對于有些以大型動物為模型的實驗單位，可以大大縮減成本，增加受試對象，提高實驗準(zhǔn)確度及可信度。而且該動物模型僅需一人就可以操作，減少了進行大動物實驗的人員負擔(dān)。大鼠左肺移植模型為國外正在應(yīng)用的肺移植模型[7]，通過套管式顯微吻合技術(shù)，減少了傳統(tǒng)吻合操作扭轉(zhuǎn)、漏針滲血、血栓生成等可能，簡化了操作，增加了模型成功率，同時也使增加受試對象及增加組別，使實驗更趨慎密合理。同系異體移植模型及異系異體模型同期灌注，每天各做一個模型，同時手術(shù)，同時灌注，結(jié)束灌注后同時標(biāo)本檢測。容易掌握好實驗條件的相同性，盡量避免了實驗條件差別造成的影響，對于確認(rèn)或排除免疫因素的影響更為準(zhǔn)確。

本研究誘導(dǎo)出胃液對大鼠移植肺的損傷并且明確了胃液對大鼠移植肺損傷的機理。即胃液及中和胃液(胃蛋白酶)對移植肺組織存在明顯的損害，并且含胃酸及胃蛋白酶的胃液對移植肺組織的損傷更為嚴(yán)重。通過免疫組化分析發(fā)現(xiàn)異系大鼠的免疫排斥反應(yīng)對移植肺的存活質(zhì)量存在顯著影響，與國外的一些研究結(jié)果一致[7]。為肺移植術(shù)后食管胃返流治療進一步提供依據(jù)，我國是人口大國，終末期肺病患者眾多，肺移植是唯一挽救他們的手段。隨著經(jīng)濟水平提升，接受肺移植的患者逐漸增多。肺移植術(shù)后肺功能的改善是肺移植發(fā)展的重要保障。對于有些剛剛接受肺移植這樣大手術(shù)創(chuàng)傷的病人，術(shù)后實行抗返流手術(shù)風(fēng)險很高，不能耐受抗返流手術(shù)的病人可嘗試抑酸和抑制胃蛋白的治療。同時也有可能減輕免疫反應(yīng)，有望減輕肺移植術(shù)后免疫抑制藥物應(yīng)用，從而減少經(jīng)濟負擔(dān)。

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*通訊作者

文章編號：1007-4287(2016)07-1061-03

作者簡介：林風(fēng)武(1973-)，男，副教授，研究方向：胸部疾病微創(chuàng)治療及肺移植的臨床、基礎(chǔ)研究。

(收稿日期：2015-05-18)