盧鈞雄　段煉　王若倫　易俊波

518000,廣州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院

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人乳頭瘤病毒HPV33型E6E7蛋白的表達及多克隆抗體的制備

盧鈞雄段煉王若倫易俊波

518000,廣州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院

【摘要】目的表達人乳頭瘤HPV33型病毒癌蛋白E6E7，并免疫小鼠制備抗體。方法從HPV33型基因組中擴增出E6 E7的基因片段，通過基因測序加以證實；將其克隆至原核表達載體pET28a中，在大腸埃希菌中經(jīng)IPTG誘導表達,經(jīng)HIS親核層析對重組蛋白進行純化，收集重組蛋白免疫的小鼠陽性血清，經(jīng)ProteinA/G親核層析柱純化得到多克隆抗體,同時將E6 E7克隆至真核表達載體pCDNA3.1/His C中，轉染293細胞，分別采用免疫熒光法和Western Blot檢測抗體的特異性。結果用得到高純度的重組蛋白E6、E7 制備的多克隆抗體，具有良好的特異性。結論這種高純度重組E6、E7蛋白和抗體有望用于HPV33型人乳頭瘤疾病的臨床檢測及發(fā)生機制的研究。

【主題詞】宮頸腫瘤；人乳頭瘤HPV33；E6 E7蛋白，多克隆抗體

Fund programs: National Natural Science Foundation of China(81403031)

人乳頭瘤病毒(Human Papilloma Virus, HPV)感染是宮頸癌發(fā)生的最重要的原因之一，它們在生殖腫瘤的病因?qū)W中起著關鍵作用[1]。HPV是一類無包膜的DNA 病毒，通過感染上皮組織細胞，引起上皮組織的良惡性增生，HPV分為高危型HPV(如HPV16/18/31/33/58)和低危型(如HPV6/11)[2],其中高危型HPV感染是宮頸癌發(fā)生的主要誘因[3]，受到HPV感染，就可能會發(fā)展為宮頸癌前病變，在癌變的過程中被認為癌基因的E6、E7蛋白又是誘發(fā)腫瘤的關鍵因素[4-6]。

HPV病毒在殼體內(nèi)以環(huán)狀雙鏈DNA存在，全長約為8 kb,其中E6、E7基因序列相當保守，E6編碼大約150個氨基酸，E7蛋白由98個氨基酸組成。E6、E7基因在HPV整合狀態(tài)時，總是保留完整，也就是說它們是病毒誘導細胞轉化所必需的癌蛋白，其功能分別通過干擾宿主細胞的關鍵調(diào)控蛋白，如p53和pRB促進永生化。E6蛋白的表達，與p53的相互作用，是造成被感染細胞染色體不穩(wěn)定性的原因，E7蛋白則降解滅活視網(wǎng)膜母細胞瘤抑制蛋白(pRB)[7]，導致惡性腫瘤發(fā)生。

我們克隆到HPV33型E6、E7基因，表達重組蛋白，得到多克隆抗體，經(jīng)檢測，多克隆抗體具有高度的特異性。

1材料與方法

1.1病毒、菌株和質(zhì)粒HPV33型病毒組織液由深圳市慢性病防治院贈送，本研究室保存；宿主菌Rosetta、DH5α、表達載體pET28a、pCDNA3.1/His C由本實驗室保存。

1.2試劑各種限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、脫氧核苷三磷酸(dNTP)、Ex Taq DNA聚合酶、BamHⅠ及EcoRⅠ購于大連寶生物公司；DNA抽提試劑盒及DNA凝膠回收試劑盒購于德國Qiagen公司；DNA標志物DL 2 000、十二烷基硫酸鈉(SDS-Na)、Tris堿、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)及氨芐青霉素系上海生工生物工程公司產(chǎn)品；蛋白質(zhì)標志物購于美國Biorad公司。

1.3擴增E6 /E7 基因片段采用病毒基因組DNA提取試劑盒從HPV33型病毒組織液中提取HPV33病毒DNA，貯存于-20℃。設計一對引物擴增E6基因片段克隆入表達載體pET28a及pCDNA3.1/His C中， P1: 5’-AGCGGATCCTTTCAAGACACTGAGGAA-3’;P2: 5’-ATCGAATTCCAGTGCAGTTTCTCTACG-3’;

上游引入BamHⅠ酶切位點,下游引入EcoRⅠ酶切位點;設計一對引物擴增E7基因片段克隆入表達載體pET28a及pCDNA3.1/His C中， P3: 5’-AGTGGATCCAGAGGACACAAGCCAACG-3’;P4: 5’-CATGAATTCTTGTTGTGCACAGGTAGG-3’;上游引入BamHⅠ酶切位點,下游引入EcoRⅠ酶切位點。

1.4序列分析特異性PCR產(chǎn)物純化后與pM18-T載體進行連接，將連接產(chǎn)物轉化到大腸埃希菌DH5α，挑取單克隆菌落培養(yǎng)，鑒定后進行DNA測序分析。

1.5重組表達質(zhì)粒的構建分別用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切目的基因片段的PCR產(chǎn)物和表達載體pET28a及pCDNA3.1/His C，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，回收，分別轉化大腸埃希菌DH5α，挑取單克降菌落，PCR鑒定成功后提取質(zhì)粒，經(jīng)BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切進一步鑒定質(zhì)粒pET28a-HPV33-E6、 pET28a-HPV33-E7及pCDNA3.1/His C-HPV33-E6、pCDNA3.1/His C-HPV33-E7。

1.6E6 /E7重組蛋白的表達將獲得的陽性克隆質(zhì)粒pET28a-HPV33-E6、pET28a-HPV33-E7轉化到表達宿主菌Rosetta中，挑菌培養(yǎng)誘導表達，離心收集菌體，裂解后，取上清進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析。

1.7表達蛋白的純化以搖瓶發(fā)酵pET28a-HPV33-E6/Rosetta和pET28a-HPV33-E7/Rosetta，離心收集1升菌體，超聲破碎，離心取上清以經(jīng)HIS親核層析對重組蛋白進行純化，SDS-PAGE電泳檢測純度。

1.8小鼠多抗制備及純化分別取50 μg E6/E7純蛋白免疫小鼠，每種蛋白各免疫三只小鼠，免疫結束后以眼球取血法收集小鼠血清，小鼠血清用protein A柱進行純化，最后將抗體加入50%后貯存于-20℃中。

1.9E6 /E7在真核細胞中表達平鋪293細胞于六孔板中至細胞密度達到80%，無血清DMEM培養(yǎng)基清洗細胞，每孔中再加入無血清DMEM培養(yǎng)基1.5 ml,取pCDNA3.1/His C-E6、pCDNA3.1/His C-E7質(zhì)粒轉細胞，48 h后收集細胞，細胞裂解液裂解，收集蛋白，貯存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.10多克隆抗體的特異性檢測分別取pCDNA3.1/His C-E6、pCDNA3.1/His C-E7質(zhì)粒轉染的293細胞蛋白液20 μl，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳后，轉印蛋白至硝酸纖維素膜(NC膜)上，分別對應加入制備的HPV33 E6/E7小鼠多抗,室溫搖2 h后置于4 ℃過夜，TBST洗滌3次，以1∶40000比例加入羊抗鼠二抗(標記HRP)(購于吉泰公司)，室溫作用1 h，TBST洗滌3次，ECL顯色。

1.11多克隆抗體與目標蛋白E6E7的細胞免疫學實驗培養(yǎng)293細胞，平鋪置有蓋玻片的24孔板中，待細胞濃度達到70%時，轉染真核表達質(zhì)粒pCDNA3.1/His C-HPV33-E6、pCDNA3.1/His C-HPV33-E7，24 h冰甲醇固定， PBSA穿膜，PBS清洗后每孔加入重組抗體反應液(1∶500)200 μl，室溫靜止反應1 h，PBS清洗后每孔加入鼠抗羊兩種熒光(Rhodamine,FITC)二抗反應液(1∶500)200 μl，避光室溫反應1 h后，PBS反復清洗，加入200 μl DAPI反應液靜止5 min，純水反復沖洗，取出玻片壓片，置于共聚焦顯微鏡上觀察。

2結果

2.1E6/E7基因的擴增取PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,結果顯示，分別擴增出特異的目的DNA片段，大小分別約440 bp和300 bp, 與預期的大小基本一致，初步證實PCR產(chǎn)物為目的基因片段，并且經(jīng)測序證實為正確的E6/E7基因。

2.2表達質(zhì)粒的構建與鑒定將構建成功的重組質(zhì)粒pET28a-HPV33-E6 和pET28a-HPV33-E7及pCDNA3.1/His C-HPV33-E6和pCDNA3.1/His C-HPV33-E7分別用相對應的酶進行雙酶切，結果均切出與預期大小一致的基因片段(圖1)。

1, pET28a-HPV33-E6質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ/ EcoRⅠ酶切;2,pCDNA3.1/His C-HPV33-E6質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ/EcoRⅠ酶切；3, pET28a-HPV33-E7質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ/ EcoRⅠ酶切;4， pCDNA3.1/His C-HPV33-E7質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ/EcoRⅠ酶切鑒定圖1　重組質(zhì)粒的酶切鑒定1, pET28a-HPV33-E6 plasmid digested with BamHⅠand EcoRⅠ；2 ,pCDNA3.1/His C-HPV33-E6 plasmid digested with BamHⅠand EcoRⅠ；3 ,pET28a-HPV33-E7 plasmid digested with BamHⅠand EcoRⅠ；4, pCDNA3.1/His C-HPV33-E7 plasmid digested with BamHⅠand EcoRⅠFig.1　Identification of recombinant plasmids by restrictive enzyme digestion

2.3HPV33 E6/E7蛋白的原核表達及純化含有表達質(zhì)粒pET28a-HPV33-E6 和pET28a-HPV33-E7重組菌的裂解液經(jīng)SDS-PAGE分離、染色后,發(fā)現(xiàn)經(jīng)誘導的pET28a-HPV33-E6 和pET28a-HPV33-E7重組菌在約Mr20000、Mr14000處各出現(xiàn)1條明顯新生蛋白帶，而未經(jīng)誘導的pET28a-HPV33-E6 和pET28a-HPV33-E7重組菌及空菌Rosetta在Mr處均沒有蛋白帶(圖2A)，可斷定此處 Mr20000、Mr14000蛋白帶為pET28a-HPV33-E6 和pET28a-HPV33-E7重組菌的表達帶。以搖瓶發(fā)酵菌體，收集10克濕菌，以破碎緩沖液懸浮，經(jīng)過超聲破碎(3s/3s，500 W，15 min)，離心，上清經(jīng)HIS親核層析穿出，洗脫得到純品(圖2B)。

2A　重組菌經(jīng)IPTG誘導表達 1. pET28a-HPV33-E7; 2. pET28a-HPV33-E6;2B　重組蛋白的純化 1. E6;2. E7圖2　重組HPV33 E6 E7蛋白的電泳及純化圖譜2A:1, pET28a-HPV33-E7 transformants with IPTG induction； 2, pET28a-HPV33-E6 transformants with IPTG induction； M, Protein molecular weight marker； 2B: 1,Purified pET28a-HPV33-E6 protein；2,Purified pET28a-HPV33-E7 protein；M, Protein molecular weight markerFig.2　SDS-PAGE of recombinants HPV33 E6 E7 proteins

2.4動物免疫及多抗的制備以E6/E7純蛋白免疫小鼠制備多抗，經(jīng)與E6/E7純蛋白免疫印跡，均能夠產(chǎn)生抗體反應(圖3)。

1：pCDNA3.1/His C-HPV33-E7細胞裂解液與E7抗體的Weston-Blot圖；2,3,4：pCDNA3.1/His C-HPV33-E6細胞裂解液與E6抗體的Weston-Blot圖3　HPV33E6/ E7抗體的免疫印跡1：Lysis buffer of pCDNA3.1/His C-HPV33-E7 with E7 antibody;2,3,4：Lysis buffer of pCDNA3.1/His C-HPV33-E6 with E6 antibodyM Protein molecular weight markerFig.3　Western Blot of HPV33 E6/ E7 antibodies

2.5抗體的細胞免疫學結果結果顯示，在細胞表面均能觀察到二抗的紅色和綠色熒光，說明制備的抗體能夠和E7蛋白有效結合。

1,pCDNA3.1/His C-HPV33-E7-293細胞與抗體E7反應后通過紅熒光鼠二抗顯色圖;2,pCDNA3.1/His C-HPV33-E7-293細胞與抗體E7反應后通過綠熒光鼠二抗顯色圖;3,pCDNA3.1/His C-HPV33-E7-293細胞核染色圖;4,照片疊加圖(1，2，3合并圖)圖4　HPV E7抗體的細胞免疫學結果1, pCDNA3.1/His C-HPV33-E7-293 with E7 antibody by using goat anti-mouse IgG-Rhodamine as secondary antibody; 2, pCDNA3.1/His C-HPV33-E7-293 with E7 antibody by using goat anti-mouse IgG-FITC as secondary antibody;3, DAPI; 4, MERGEFig.4　Immunological result of HPV E7 antibody

3討論

HPV病毒感染中，HPV16型檢出率最高， HPV33型的檢出率位居第二，并且在感染HPV33型的病例中還伴隨著混合感染，所以對HPV病毒的研究必需采用聯(lián)合檢測和治療。對HPV病毒各亞型要進一步深入研究和探討，目前對HPV病毒的檢測采用三種方法，第一種方法是對HPV抗原的檢測，第二種方法是HPV抗體的檢測，第三種方法則是HPV-DNA檢測，單一的檢測方法準確率都達不到80%,但HPV抗原/抗體與HPV-DNA的聯(lián)合檢測則檢出準確率達94.8%[8]。我們針對抗原抗體的研究入手[9]，將HPV33的癌蛋白E6E7作為研究對象，從臨床檢測作為出發(fā)點來研究HPV33型在疾病中的應用。

我們從病毒樣本中克隆到HPV33 E6 E7基因，裝入到原核表達載體中并成功在大腸埃希菌中表達，通過純化得到純蛋白，通過免疫小鼠制備抗體，通過對抗體的檢測，我們采用兩種方法，一種是通過常規(guī)的Westen-Blot方法，發(fā)現(xiàn)E7抗體特異性和靈敏度均非常好，E6抗體靈敏度比較特異性方面差一些，我們將進一步改進。針對E7抗體我們進一步用另一種方法來檢定，即通過細胞免疫學的方法在細胞水平上檢測，我們將目標蛋白E7分泌表達在細胞膜上[10]，用制備的E7抗體進行反應，再通過兩種熒光二抗顯色，在共聚焦顯微鏡下可以清楚觀察到熒光，我們制備的抗體可以應用于宮頸癌疾病的理論研究及臨床治療。

4參考文獻

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通信作者：易俊波， Email: myspacebo@hotmail.com

DOI：10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.01.021

基金項目：國家自然科學基金項目(81403031)

(收稿日期：2015-11-17)

Preparation of the polyclonal antibody of human papillomavirus type HPV33 for E6E7

LuJunxiong,DuanLian,WangRuolun,YiJunbo

TheSecondAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity，Guangzhou518000,ChinaCorrespondingauthor:YiJunbo,Email:myspacebo@hotmail.com

【Abstract】ObjectiveTo clone and efficiently express E6E7 proteins of human papilloma virus HPV33 in E.coli. The recombinant proteins were purified and immunized to mice, and polyclonal antibodies were purified. MethodsE6 and E7 genes of HPV33 were amplified by PCR using HPV33 human papilloma virus as template,and were sub-cloned into pET28a and pCDNA3.1 / His C vectors. The recombinant plasmids pET28a-HPV33 E6 and pET28a-HPV33 E7 were transformed into Escherichia coli BL21 (DE3) strain．We purified the recombinant proteins and immunized mice for preparing antibodies, and the polyclonal antibodies were purified. Moreover the plasmids pCDNA3.1 / His C-HPV33 E6 and pCDNA3.1 / His C-HPV33 E7 were transfected into 293 cells.The cells were used in immunofluorescence and Western-Blot to detect antibody specificity. ResultsThe recombinant proteins were successfully obtained, and the polyclonal antibody was prepared, which had good specificity. ConclusionThe recombinant proteins and antibodies may be used in the clinical detection and pathogenesis research of HPV33 type human papilloma disease.

【Key words】Cervix neoplasms； Human papillomavirus type 33(HPV33)；E6,E7 proteins；Polyclonal antibody