趙娜　劉金霞　孫殿興

050082 石家莊，中國人民解放軍白求恩國際和平醫(yī)院全軍肝病診治中心(趙娜、孫殿興)； 067000，承德醫(yī)學院病原生物學實驗中心(劉金霞)

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·技術(shù)方法·

反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)檢測甲型H1N1流感病毒的建立

趙娜劉金霞孫殿興

050082 石家莊，中國人民解放軍白求恩國際和平醫(yī)院全軍肝病診治中心(趙娜、孫殿興)； 067000，承德醫(yī)學院病原生物學實驗中心(劉金霞)

【摘要】目的 通過應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(RT-LAMP)對甲型H1N1流感病毒進行基因檢測，建立一種快速、簡便的可視化核酸檢測技術(shù)。 方法 先針對甲型H1N1流感病毒HA基因區(qū)段，設(shè)計2對RT-LAMP引物。通過檢測不同病毒評估引物的特異性，通過檢測倍比稀釋的臨床樣本確定RT-LAMP的靈敏度。用羥基萘酚藍(HNB)染料對產(chǎn)物進行可視化檢測，同時用凝膠電泳進行結(jié)果驗證。最后用RT-LAMP檢測臨床樣本，使用卡方檢驗比較與TaqMan PCR的一致性。 結(jié)果RT-LAMP的引物特異性好，可準確地使甲型H1N1流感病毒擴增。通過對稀釋模板的檢測，得出RT-LAMP的靈敏度為2.5×103拷貝/ml。RT-LAMP擴增結(jié)果可通過HNB可視化判定，與凝膠電泳的效果相當。對RT-LAMP和TaqMan PCR的顯著性差異經(jīng)統(tǒng)計學評價，可知二者一致性較好(P>0.05)。結(jié)論本研究實現(xiàn)了可視化檢測甲型H1N1流感病毒，具有更好的靈敏性，該技術(shù)在基層醫(yī)療機構(gòu)有一定的實用價值。

【主題詞】甲型H1N1流感病毒；反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(RT-LAMP)；可視化

Fund program: Medicine and Hygiene Research Foundation of the Whole Army (CBJ 14C010)

甲型H1N1流感病毒(簡稱甲流)為單股負鏈RNA病毒,屬于正粘病毒科,主要通過呼吸道傳播，傳播快，感染率高。人感染甲流后的早期癥狀與普通流感相似，包括發(fā)熱、咳嗽、喉痛、頭痛、全身肌肉痛、鼻塞流涕等[1]。2009年開始，甲流在全球范圍內(nèi)大規(guī)模流行，雖然目前大規(guī)模流行已經(jīng)結(jié)束，但為下個流行期做好準備，因此有必要使用一種較為簡便的檢測方法，便于在基層醫(yī)療機構(gòu)監(jiān)測人群中的感染狀況。

目前，檢測流感病毒的方法主要采用熒光定量PCR檢測呼吸道標本(鼻/咽拭子、口腔含漱液、痰等)，但是該技術(shù)操作繁瑣、對實驗環(huán)境和操作人員要求高，不適用于在基層醫(yī)療機構(gòu)應(yīng)用。反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification，RT-LAMP)技術(shù)做為等溫核酸擴增技術(shù)的典型代表，已被廣泛應(yīng)用于各種病毒的檢測。其特點是在恒溫(約65℃)條件下，利用針對靶序列的六段區(qū)域設(shè)計4條特異引物，在1 h內(nèi)能將數(shù)個拷貝的RNA高效擴增到109～1010倍。該技術(shù)尤其適合推廣到高端實驗設(shè)備缺乏的基層醫(yī)療機構(gòu)[2]。本研究使用RT-LAMP技術(shù)初步建立了甲流病毒的可視化檢測方法，該方法具有在基層醫(yī)療機構(gòu)的實用價值和推廣前景。

表1　RT-LAMP引物序列

1材料與方法

1.1主要試劑病毒RNA提取試劑盒(QIAamp Viral RNAMini Kits)購自德國Qiagen公司，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶購自Vazyme公司，BstDNA聚合酶購自美國NEB公司，重組核糖核酸酶抑制劑購自TBZInvitrogen公司，羥基萘酚藍(HNB)染料購自TBZSigma公司。

1.2模板來源收集2014年11月至2015年年初到本醫(yī)院就診的疑似甲流患者鼻咽分泌物，將咽拭子在稀釋液中充分攪拌、擠壓，使鼻咽分泌物充分溶于稀釋液中待檢。按照病毒核酸提取試劑盒操作說明提取RNA，提取物送檢驗科進行TaqMan PCR檢測(使用美國CDC TaqMan PCR方法檢測甲型H1N1流感病毒的引物和探針[3])，選擇定量結(jié)果在1×103～1×106拷貝/ml的陽性樣本55例(1×105～1×106拷貝/ml有樣本18例，1×104～1×105拷貝/ml有樣本16例，1×103～1×104拷貝/ml有樣本21例)。另收集10例健康人鼻咽分泌物樣本并按照上述方法進行檢測(陰性)。甲流患者和健康人另經(jīng)血常規(guī)和血生化等檢查以確證TaqMan PCR結(jié)果。用來驗證特異性的病毒：甲型H3N2流感病毒、甲型H5N1流感病毒、甲型H7N9流感病毒、乙型流感病毒和副流感病毒均為標準株。所有樣本提取物置于-80℃冰箱保存。

1.3引物設(shè)計NCBI網(wǎng)站下載甲流病毒HA基因區(qū)段，使用Clustal X軟件進行序列對比，選取相對保守區(qū)域，使用Primer Explorer V4軟件設(shè)計4條RT-LAMP引物(參考序列Genbank號：KU242680)。引物序列見表1，表中F3和B3為外引物，F(xiàn)IP和BIP為內(nèi)引物。所有引物委托上海生工公司合成。

1.4反應(yīng)體系和結(jié)果判定 25 μl體系包括：內(nèi)引物(FIP和BIP)各1.6 μmol/L，外引物(F3和B3)各0.2 μmol/L，甜菜堿0.8 M，MgSO46 mmol/L，dNTPs各1.4 mmol/L，RNA模板1 μl，BstDNA聚合酶8 U、10×反應(yīng)緩沖液2.5 μl，AMV 100 U，RNA酶抑制劑20 U，120 μmol/L HNB 1 μl，同時用雙蒸水(ddH2O)補足至25 μl。將反應(yīng)管(0.5 mL EP管)置于65℃水浴箱內(nèi)反應(yīng)約60 min。反應(yīng)完成后用肉眼觀察羥基萘酚藍(HNB)的指示效果，陽性反應(yīng)使體系呈天藍色，陰性反應(yīng)使體系保持紫色。同時取5 μl擴增產(chǎn)物在凝膠中電泳約40 min，然后置于凝膠成像系統(tǒng)下查看圖像以驗證HNB的指示效果。

1.5特異性實驗應(yīng)用RT-LAMP方法同時對甲流病毒的H1N1亞型、H3N2亞型、H5N1亞型、H7N9亞型、乙型流感病毒和副流感病毒進行擴增以驗證引物的特異性，其中H1N1亞型重復(fù)擴增3次。

1.6靈敏度實驗為了進一步確定RT-LAMP的檢測靈敏度，選取TaqMan PCR定量結(jié)果約為2×104拷貝/ml的樣本進行一系列稀釋(稀釋后分別為1.00×104拷貝/ml、5.00×103拷貝/ml、2.5×103拷貝/ml、1.25×103拷貝/ml和1×103拷貝/ml)后，分別用RT-LAMP擴增。將擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳，根據(jù)紫外光下可見最高稀釋度的電泳帶確定擴增結(jié)果，同時用HNB進行結(jié)果對照，實驗重復(fù)3次。

1.7統(tǒng)計學方法對55例臨床陽性和10例陰性樣本進行RT-LAMP擴增，和TaqMan PCR結(jié)果進行比較。應(yīng)用SPSS 17.0軟件進行卡方檢驗，P<0.05為顯著性差異，具有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

A.RT-LAMP產(chǎn)物電泳結(jié)果；B.HNB可視化檢測。1～3：甲型H1N1流感病毒；4：甲型H3N2流感病毒；5：甲型H5N1流感病毒、6：甲型H7N9流感病毒；7：乙型流感病毒；8：副流感病毒；N：雙蒸水陰性對照；M：1kb DNA marker圖1　RT-LAMP檢測甲流的特異性A. Electrophoresis pattern of RT-LAMP；B.Visualized detection by HNB.1-3:type A H1N1 influenza virus;4: type A H3N2 influenza virus;4:type A H5N1 influenza virus;6:type A H7N9 influenza virus;7:type B influenza virus,8:parainfluenza; N: negative control using ddH2O;M: 1kb DNA markerFig.1　Specificity of RT-LAMP for detection of type A H1N1 influenza virus

2.1特異性實驗分別對甲流病毒和非相關(guān)病毒進行RT-LAMP擴增后，電泳實驗結(jié)果如圖1A所示，泳帶1～3表示甲流病毒被擴增后，出現(xiàn)特征性的梯狀條帶；泳帶4～8所示的對照病毒未見被擴增。本研究說明RT-LAMP引物的特異性較好，不受非特異模板的干擾。從擴增原理上解釋，是只有這4條針對靶序列6個區(qū)域的特異引物同時識別靶序列才啟動擴增，6個區(qū)域中任何區(qū)域與引物不匹配均不能完成擴增。

HNB染色效果如圖1B所示，各管的排列順序和圖1A一致。通過比較，可知兩種產(chǎn)物檢測方法的效果相當，而通過肉眼觀察更加簡單方便。

2.2靈敏度實驗RT-LAMP對一系列稀釋樣本的靈敏度實驗結(jié)果如圖2所示。由圖2A可知，1～4泳帶均發(fā)生擴增，到第4泳帶以后沒有發(fā)生擴增，可確定RT-LAMP的靈敏度為2.5×103拷貝/ml；染色效果如圖2B，圖中各管的排列順序和上圖一致，陽性反應(yīng)均可見顏色改變，但不同稀釋度樣本的擴增產(chǎn)物的染色深淺差異不大。

A.RT-LAMP電泳結(jié)果；B.HNB可視化檢測。1：病毒含量為2×104拷貝/ml；2：病毒含量為1×104拷貝/ml；3：病毒含量為5×103拷貝/ml；4：病毒含量為2.5×103拷貝/ml；5：病毒含量為1.25×103 拷貝/ml；6：病毒含量為1×103拷貝/ml；N：雙蒸水陰性對照；M：1kb DNA marker圖2　RT-LAMP檢測甲流的靈敏度A.Electrophoresis pattern of RT-LAMP；B.Visualized detection by HNB.1: lanes of virus containing 2×104copies/ml; 2: lanes of virus containing 1×104copies/ml; 3:lanes of virus containing 5×103copies/ml; 4: lanes of virus containing 2.5×103copies/ml; 5: lanes of virus containing 1.25×103 copies/ml; 6:lanes of virus containing 1×103copies/ml;N: negative control using ddH2O;M: 1kb DNA markerFig.2　Sensitivity of RT-LAMP for detection of type A H1N1 influenza virus

2.3臨床樣本的檢測用RT-LAMP法對55例臨床陽性和10例陰性樣本進行檢測，結(jié)果病毒含量在104拷貝/ml以上的34例樣本用RT-LAMP也檢測為陽性，而用RT-LAMP只測出病毒含量在104拷貝/ml以下的樣本17例，未檢出的4例樣本病毒含量均低于3×103拷貝/ml，RT-LAMP的檢測靈敏度為92.73%。另10例臨床陰性樣本用RT-LAMP也均檢測為陰性，RT-LAMP的特異性為100%。

將RT-LAMP和TaqMan PCR的結(jié)果進行配對卡方檢驗，P>0.05(P=0.125)，這說明雖然RT-LAMP比TaqMan PCR的靈敏度低，但是這兩種方法沒有顯著性差異。

3討論

由于RT-LAMP在可操作性、檢測時間、設(shè)備要求等方面比其他檢測技術(shù)具有更大的優(yōu)勢，所以國內(nèi)外研究者也曾報道過利用該技術(shù)檢測甲流病毒。然而，我們發(fā)現(xiàn)這些研究均存在些許不足：例如程思佳[33]等利用擴增副產(chǎn)物焦磷酸鎂沉淀形成的濁度和熒光染料SYBR Green I進行結(jié)果判定，對于微量擴增產(chǎn)物，利用肉眼判定濁度的方法主觀性太強；而SYBR Green I屬于核酸結(jié)合染料，因抑制擴增反應(yīng)，所以要反應(yīng)后開蓋添加，這樣做的結(jié)果是很容易造成核酸氣溶膠污染，而且SYBR Green I 的指示效果比電泳檢測的靈敏度低[4]。Lee等[5]所用的RT-LAMP技術(shù)雖然檢測快速(20 min)，但是靈敏度較低，56例陽性樣本中只檢出46例陽性。

本研究所用的RT-LAMP技術(shù)相當于是在前人研究基礎(chǔ)上的一種改進：(1)所用的HNB的指示原理是通過指示體系中的金屬離子濃度的變化從而間接指示擴增結(jié)果，所以不抑制擴增，可以在反應(yīng)前加入，而且配制簡單[6]。(2)所用的RT-LAMP技術(shù)的靈敏度比類似文獻報道的高[3, 5，7]，更有利于進行疾病的輔助診斷和流行病學調(diào)查。(3)由于反應(yīng)在等溫條件下進行，所以不需昂貴設(shè)備，僅用一臺水浴箱即完成檢測，設(shè)備簡單。

然而，該RT-LAMP技術(shù)仍然存在不足之處：首先，本研究限于研究時間有限，所得樣本的規(guī)模較小，無法避免小概率事件發(fā)生；第二，實驗中發(fā)現(xiàn)HNB染料指示的從陰性(紫色)到陽性(天藍色)的顏色改變有時并不很明顯；第三，雖然使用HNB不開蓋可防止污染，但是一旦發(fā)生氣溶膠污染，將很難消除。因此，可以通過擴大臨床樣本量，使用特殊眼鏡或儀器對HNB的顏色改變輔助判定，采用分區(qū)操作、試劑分裝等方法補足RT-LAMP的不足。隨著該技術(shù)的不斷改進，必將出現(xiàn)從樣本處理到結(jié)果判讀一體化、自動化的便攜式儀器和配套試劑，使RT-LAMP技術(shù)成為傳染病的診斷和流行病學調(diào)查的常規(guī)檢測工具。

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通信作者：孫殿興，Email：sundianxing@hotmail.com; 劉金霞，Email：1158210524@qq.com

DOI：10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.01.018

基金項目：全軍醫(yī)藥衛(wèi)生科研基金項目(CBJ 14C010)

(收稿日期：2015-12-14)

Establishment of reverse transcriptase Loop-mediated isothermal amplification technique for detection of type A H1N1 influenza virus

ZhaoNa，LiuJinxia，SunDianxing

BethuneInternationalPeaceHospital,Shijiazhuang050082,China(ZhaoN，SunDX);ChengdeMedicalUniversity,Chengde067000,China(LiuJX)Correspondingauthor:SunDianxing,Email：sundianxing@hotmail.com;LiuJinxia,Email：1158210524@qq.com

【Abstract】Objective To establish a rapid，simple and visualized nucleotide detection technique for type A influenza H1N1 virus using reverse transcriptase loop-mediated isothermal amplification(RT-LAMP) Methods Two pairs of RT-LAMP primers were designed in accordance with the HA gene of type A H1N1 influenza virus. Then, the specificity of the primers was evaluated by detection of different viruses, and the sensitivity was confirmed by testing multiple proportional diluent clinical samples. Hydroxynaphthol blue(HNB) was used for visualized detection, at the same time, gel electrophoresis was used for verification. At last, clinical samples were detected by RT-LAMP, the consistency of RT-LAMP and TaqMan PCR methods was compared by chi-square test. ResultsThe 4 primers of RT-LAMP have good specificity, which can identify type A H1N1 influenza virus accurately. The sensitivity of RT-LAMP was 2.5×103copies/ml by detection of diluent samples. The products of RT-LAMP could be detected by HNB visually, and the results is consistent with gel electrophoresis methods. After evaluation of statistical difference of RT-LAMP and TaqMan PCR, we find no significant difference with the two methods(P>0.05). ConclusionOur study has realized visually detection of type A H1N1 influenza virus by RT-LAMP with better sensitivity, which has some practical value in the primary care hospitals.

【Key words】Type A influenza H1N1 virus; Reverse transcriptase loop-mediated isothermal amplification(RT-LAMP); Visualization