陳　璇，劉　松，馮　岳，堵國成*，陳　堅

（1.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫214122）

常壓室溫等離子誘變選育L-天冬酰胺酶高產(chǎn)重組菌

陳璇1，2，劉松1，2，馮岳1，2，堵國成1，2*，陳堅1，2

（1.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫214122）

以Bacillus subtilis WB600為宿主，構(gòu)建了能分泌表達L-ASNase的重組菌，并通過常壓室溫等離子體誘變進一步提高了重組菌的產(chǎn)酶量。重組Bacillus subtilis WB600（pMA5-wapA-ansZ）發(fā)酵30 h，胞外酶活達到37.2 U/mL，表明L-ASNase在信號肽wapA介導(dǎo)下能分泌至胞外。在功率120 W、氣流量10 L/min、誘變時間40 s的誘變操作條件下，對重組菌進行了等離子體誘變。突變株的酶活最高達48.4 U/mL，較誘變前提高30%。上述結(jié)果表明，常壓室溫等離子體誘變能有效提高重組菌產(chǎn)L-ASNase的酶活.研究結(jié)果為L-ASNase的工業(yè)化生產(chǎn)提供了高效的生產(chǎn)菌株。

L-天冬酰胺酶；枯草芽孢桿菌；異源表達；常壓室溫等離子體誘變

L-ASNase（Asparaginase，EC3.5.1.1），是一種酰胺基水解酶，能催化天冬酰胺水解生成天冬氨酸和氨。在臨床上，L-ASNase常與其他藥物聯(lián)合用于治療急性淋巴細胞白血病（ALL）及某些淋巴瘤與肥大細胞瘤等癌癥［1-4］。此外，L-ASNase能有效分解致癌物質(zhì)丙烯酰的前體天冬酰胺，使之成為歐美國家在食品安領(lǐng)域中近期關(guān)注的熱點酶種之一。Jia等［5］人的研究中，添加L-ASNase處理的土豆切片高溫油炸后丙烯酰胺的含量減少了82%。Kukurova等［6］人在小麥面粉中添加L-ASNase，丙烯酰胺的含量減少了90%。因此，實現(xiàn)L-ASNase的高效生產(chǎn)是國內(nèi)外研究的熱點。

ASNase廣泛存在于微生物中，包括歐文氏桿菌（Erwinia carotovora），產(chǎn)氣腸桿菌（Enterobacter aerogenes），嗜熱細菌（Thermus thermophilus），灰色鏈霉菌（Streptomycesgriseus），大腸桿菌（Escherichia coli），綠膿假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）等［7-10］。Baskar等［11］運用響應(yīng)面法優(yōu)化野生菌Enterobacter aerogenes的L-ASNase發(fā)酵，酶活為19.13 U/mL。關(guān)于L-ASNase重組表達研究亦有 報 道 。來源于 Streptomyces和Flammulina velutipes的L-ASNase在E.coli中表達后，酶活分別達到23.02 U/mL和16 U/mL［12-13］。Gilbert等人［14］在Escherichia coli和 Erwinia Carotovor表達了來源于Erwinia chrysanthemi的L-ASNase，酶活提高至49 U/mL?？傮w而言，微生物發(fā)酵法產(chǎn)L-ASNase的產(chǎn)量較低，且重組表達的宿主僅限于非食品安全的大腸桿菌。

以氦氣為氣源的大氣壓射頻輝光放電等離子體能引起DNA分子的斷裂，研究者基于此開發(fā)了常壓室溫等離子體（Atmospheric and Room Tempera-ture Plasma，ARTP）誘變育種儀［15］。相較于紫外誘變等傳統(tǒng)誘變技術(shù)，ARTP誘變具有諸多優(yōu)點：離子體的溫度低，活性離子的濃度高且種類多樣，操作簡單，成本低，對環(huán)境無污染，誘變速度快（數(shù)分鐘以內(nèi)），突變率高，突變庫容量大等［16］。ARTP誘變已經(jīng)成功地用于谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶［17］、丁醇［18］、脂肪酶［19］、油脂［20］等產(chǎn)品高產(chǎn)菌株的誘變育種，已逐漸成為一種微生物快速進化育種的重要平臺技術(shù)。

作者將來源于B.subtilis 168 L-ASNase表達于食品安全的B.subtilis WB600，并通過ARTP誘變系統(tǒng)對重組菌進行誘變，獲得了L-ASNase高產(chǎn)突變株。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株與質(zhì)粒大腸桿菌 Escherichia coli JM109，B.subtilis 168，B.subtilis WB600以及質(zhì)粒pMA5-wapA（在pMA5質(zhì)粒的NdeI-BamHI序列之間插入wapA信號肽）：均為作者所在實驗室保存。

1.1.2酶、試劑、引物和DNA序列測定限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶、PrimeSTAR HS DNA聚合酶、小片段DNA回收試劑盒以及瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒：TaKaRa公司；氨芐青霉素、硫酸卡那霉素、質(zhì)粒提取試劑盒：生工生物工程（上海）股份有限公司；引物合成和DNA測序也由該公司完成。蛋白質(zhì)Marker和SDS-PAGE凝膠配制試劑盒：Fermentas公司和碧云天公司；L-天冬酰胺：Sigma公司；蛋白胨、酵母粉：OXID公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3培養(yǎng)基大腸桿菌的培養(yǎng)以及 B.subtilis WB600種子培養(yǎng)用LB培養(yǎng)基（g/L）：酵母浸出粉5，蛋白胨10，NaCl 10；固體培養(yǎng)基添加2 g/dL的瓊脂。Bacillus subtilis WB600發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：蔗糖35，蛋白胨15，尿素0.8，玉米漿12，K2HPO42.612，KH2PO42.041，MgSO4·7H2O 1.845，NaCl 3，L-天冬酰胺1；pH 7，氨芐青霉素100 μg/mL，硫酸卡那霉素50 μg/mL。

1.2方法

1.2.1重組菌的構(gòu)建根據(jù)GenBank提供的Bacillus subtilis 168的L-ASNase的基因序列ansZ，設(shè)計引物G19F和G19R，引物具體見表1。PCR擴增條件為：98℃3 min；98℃30 s；50℃30 s；72℃70 s；30個循環(huán)；72℃延伸5 min。將擴增得到的ansZ基因片段與pMD18-T-simple連接，轉(zhuǎn)化E.coli感受態(tài)細胞JM109。涂布平板，37℃培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒。用和BamH I和EcoR I分別雙酶切pMD18-T-simple/ansZ和pMA5-wapA，再用TaKaRa DNA Ligation Kit中的連接酶連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMA5-wapA-ansZ。連接過夜后轉(zhuǎn)化E.coli感受態(tài)細胞JM109，通過菌落PCR驗證篩選陽性克隆。挑選陽性克隆于含100 μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒進行酶切驗證及測序鑒定。采用化學(xué)轉(zhuǎn)化法［21］轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒pMA5-wapA-ansZ至B.subtilis WB600，在含有50 μg/mL卡那霉素（Km）平板上挑選陽性克隆。菌落PCR并酶切驗證，構(gòu)建成功的重組菌于-80℃甘油管保藏。

表1　　引物序列Table 1　Sequences of primers

1.2.2重組菌的表達在37℃、200 r/min下，用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)B.subtilis WB600（pMA5-wapA-ansZ）10 h，然后轉(zhuǎn)接于B.subtilis WB600發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵30 h后檢測胞外酶活。

1.2.3ARTP誘變方法利用清華大學(xué)與思清源公司研發(fā)的常壓室溫等離子體育種機（ARTP）對重組菌液進行誘變。在誘變功率、工作氣流量及等離子體發(fā)射源與樣品載片距離一定的條件下，誘變的可操作參數(shù)為處理時間。為了得到最佳誘變條件，首先需要得到重組菌的致死率曲線，操作條件見表2。誘變處理后的樣品稀釋涂布平板，用CFU方法計算致死率。

表2　B.subtilis WB600（pMA5-wapA-ansZ）的ARTP誘變條件Table 2　ARTP operating conditions of B.subtilis WB600 （pMA5-wapA-ansZ）

1）初篩：將經(jīng)過ARTP誘變后的種子懸浮液稀釋涂布于篩選平板上，于37℃培養(yǎng)12 h。將平板上的單菌落接種于含有種子培養(yǎng)基的96淺孔培養(yǎng)板中，于37℃培養(yǎng)10 h，然后轉(zhuǎn)接于裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的96深孔培養(yǎng)板中。將96深孔培養(yǎng)板放在96孔搖床上培養(yǎng)30 h后測定酶活，酶活高于原始菌株10%以上的記為正突變株。

2）復(fù)篩：將初篩所得的菌株接種于液體種子培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min培養(yǎng)10 h。然后將種子轉(zhuǎn)接到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，接種體積分?jǐn)?shù)3%，37℃、200 r/min培養(yǎng)2 d，取發(fā)酵上清液測定酶活。

1.2.4遺傳穩(wěn)定性分析為了分析突變株的遺傳穩(wěn)定性，在固體平板上進行5次傳代培養(yǎng)，對每代菌株進行發(fā)酵，然后測定其L-ASNase活性。

1.2.5L-ASNase酶活測定采用奈氏試劑法［22］測定ASNase的酶活。反應(yīng)分兩步進行。1）酶解反應(yīng)：1 mL磷酸鹽緩沖液（10 mmol/L，pH 7.5）、300 μL酶液、100 μL底物，37℃反應(yīng)30 min后加入100 μL三氯乙酸終止反應(yīng)?；靹蚝?2 000 r/min離心2 min；2）顯色反應(yīng)：第一步酶解反應(yīng)液200 μL，3.3 mL去離子水，500 μL奈氏試劑，混勻后于436 nm處測定吸光值。

酶活性單位定義：每分鐘水解L-天冬酰胺生成1 μmol氨所需要的酶量定義為L-ASNase活力單位（U/mL）。

標(biāo)準(zhǔn)曲線用（NH4）2SO4測定：配制18 mmol/L的（NH4）2SO4的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別加入0、50、100、150、200、250、300、350、400 μL，用去離子水補至 400 μL，然后加入1 mL磷酸鹽緩沖液 （10 mmol/L，pH 7.5），37℃反應(yīng)30 min后加入100 μL三氯乙酸終止反應(yīng)?；靹蚝笥?2 000 r/min離心2 min，然后進行顯色反應(yīng)。

1.2.6菌體生物量的測定利用分光光度計檢測經(jīng)適當(dāng)稀釋的菌液在600 nm波長處的吸光度值，即OD600。

1.2.7蔗糖質(zhì)量濃度的測定采用蒽酮-濃硫酸法測定發(fā)酵液中蔗糖的質(zhì)量濃度，見文獻［23］。

2結(jié)果與討論

2.1重組菌的構(gòu)建與表達

以合成的B.subtilis 168基因組為模板，利用引物G19F和G19R擴增L-ASNase基因，所得PCR產(chǎn)物大小為1071bp，見圖1-3。將該基因片段連接至表達載體pMA5-wapA的wapA信號肽下游，得到重組載體pMA5-wapA-ansZ，見圖2-3。測序驗證后，將pMA5-wapA-ansZ轉(zhuǎn)化B.subtilis WB600，得到重組菌B.subtilis WB600（pMA5-wapA-ansZ）。

圖1PCR產(chǎn)物電泳Fig.1　Electrophoretic analysis of PCR products

圖2　　質(zhì)粒雙酶切電泳Fig.2　Electrophoretic analysis of double digested products

圖3 重組表達質(zhì)粒pMA5-wapA-ansZ的構(gòu)建Fig.3　Construction of pMA5-wapA-ansZ

重組菌B.subtilis于37℃發(fā)酵30 h，取發(fā)酵上清液進行酶活及SDS-PAGE分析。在重組菌的發(fā)酵上清液中，可見相對分子質(zhì)量約38 000的蛋白質(zhì)條帶，與L-ASNase的理論相對分子質(zhì)量一致，見圖4。而對照的發(fā)酵上清液則未見此條帶，表明LASNase在B.subtilis WB600中成功實現(xiàn)了分泌表達。經(jīng)酶活分析，重組表達的L-ASNase能分泌至胞外，且胞外酶活達37.2 U/mL。

圖4SDS-PAGE分析L-ASNase的分泌表達Fig.4　SDS-PAGE analysis of the secretory expression of L-ASNase

2.2ARTP誘變致死率曲線的測定

王立言等［24］前期研究發(fā)現(xiàn)，等離子體對微生物細胞壁和細胞膜以及蛋白質(zhì)都具有顯著影響。等離子體中含有的大量的高能自由基團和活性離子，能破壞細胞結(jié)構(gòu)，不斷擊穿微生物導(dǎo)致其死亡。同時在形成等離子體的過程中，伴隨產(chǎn)生的部分紫外線也能引起細菌的死亡。而只有少數(shù)經(jīng)過ARTP處理后的微生物通過自身的修復(fù)系統(tǒng)存活下來，并在這一過程中發(fā)生基因突變。因此選擇合適的誘變操作條件有利于快速有效的篩選突變株。

如圖5所示，隨著處理時間的增加，B.subtilis WB600（pMA5-wapA-ansZ）菌體的致死率不斷提高，處理10 s致死率就達到了89.2%，20 s致死率接近 100%。但是處理 30 s發(fā)現(xiàn)致死率下降為70.6%。出現(xiàn)這一現(xiàn)象的原因可能是由于菌體經(jīng)一定量的等離子體處理后激發(fā)了菌體自身的修復(fù)作用，當(dāng)修復(fù)作用強于等離子體的破壞作用時，菌體的致死率會有所下降。但隨著等離子體注入的時間的增加，等離子體對菌體的破壞作用大于其修復(fù)作用時，菌體致死率上升。可以看到等離子體處理40 s時，致死率達99%以上。處理時間大于40 s后，菌體全部死亡。以酶活高出對照10%為正突變株，B.subtilis WB600（pMA5-wapA-ansZ）誘變40 s的正突變率達26%，因此將本研究的誘變時間定為40s。

圖5　B.subtilis WB600（pMA5-wapA-ansZ）的誘變致死率曲線Fig.5　Mutation of the lethal rate of the B.subtilis WB600 （pMA5-wapA-ansZ）with the ARTP treatment

2.3突變菌株的篩選

以初篩酶活提高10%作為正突變株，正突變率達26%。然后在搖瓶上進行復(fù)篩，并對突變株進行編號。復(fù)篩的結(jié)果見圖6。篩選到一株正向突變株HG-10，酶活為48.4 U/mL，是出發(fā)菌株酶活的1.3倍。

圖6　B.subtilis WB600（pMA5-wapA-ansZ）（HG）及突變株的酶活分析Fig.6　L-ASNase activity analysis of 15 mutants and B.subtilis WB600（pMA5-wapA-ansZ）（HG）

2.4突變株發(fā)酵特性分析

為了進一步了解重組菌與突變株的生長發(fā)酵情況，對它們的生長、蔗糖消耗以及產(chǎn)酶情況進行了研究。如圖7所示，重組菌B.subtilis WB600 （pMA5-wapA-ansZ）和突變菌株HG-10對糖的利用情況比較一致。前期0～6 h，菌體生長較緩慢，耗糖比較少，幾乎不產(chǎn)酶。6～18 h，菌體生長進入對數(shù)期，由于菌體大量增殖，發(fā)酵培養(yǎng)液中蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)急劇下降，此時產(chǎn)酶速率增大。突變菌株HG-10的生長較原始重組菌快。18 h后菌體生長進入穩(wěn)定期，產(chǎn)酶量繼續(xù)上升。對于絕大多數(shù)胞外酶來說，酶的合成與菌體的生長呈大致平行的關(guān)系，生長停止時，酶產(chǎn)量達到最大，繼續(xù)培養(yǎng)酶的產(chǎn)量可能會下降［25］。原始重組菌的穩(wěn)定期較短，菌體衰亡較快。而突變株HG-10穩(wěn)定期比較長，菌體衰亡的較慢，這可能是HG-10酶活提高的原因。

圖7　B.subtilis WB600（pMA5-wapA-ansZ）（HG）和突變株HG-10發(fā)酵曲線Fig.7　Growth，sucrose comsuption and enzyme production curve of mutant HG-10 and B.subtilis WB600（pMA5-wapA-ansZ）

2.5突變株遺傳穩(wěn)定性分析

按照1.2.4的方法，對突變株HG-10生產(chǎn)LASNase的遺傳穩(wěn)定性進行了考察，見圖8。酶活分析結(jié)果表明，連續(xù)傳代5次，突變株酶活范圍在43.8～46.5 U/mL，每代酶活變化幅度較小。以上結(jié)果說明突變株HG-10具有較好的遺傳穩(wěn)定性，與本研究結(jié)果類似，野生菌經(jīng)等離子誘變后得到的突變株的遺傳穩(wěn)定性較高。夏書琴等［17］考察了產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的野生菌茂源鏈輪絲菌（Streptoverticillium mobaraense）經(jīng)等離子體誘變后的遺傳穩(wěn)定性，3個突變株酶活水平下降幅度均小于10%。金麗華等［20］研究發(fā)現(xiàn)，圓紅冬孢酵母（Rhodosporidium toruloides）突變體的增殖速度和產(chǎn)油脂量都保持穩(wěn)定。

圖8　　突變株HG-10的遺傳穩(wěn)定性分析Fig.8　Analysis of genetic stability for mutant HG-10

3結(jié)語

作者以B.subtilis WB600為宿主，構(gòu)建了一株高效分泌 L-ASNase重組菌 B.subtilis WB600 （pMA5-wapA-ansZ），胞外酶活達到37.2 U/mL。通過ARTP誘變技術(shù)獲了B.subtilis WB600（pMA5-wapA-ansZ）的突變株，胞外酶活提高至48.4 U/mL，較誘變前提高30%，且突變株具有較高的遺傳穩(wěn)定性。上述結(jié)果表明，通過以食品安全的B.subtilis構(gòu)建產(chǎn)L-ASNase重組菌并進行ARTP誘變，是獲得L-ASNase高產(chǎn)菌有效方法，為L-ASNase發(fā)酵生產(chǎn)提供了高產(chǎn)菌株。此外，對重組菌進行物理誘變的策略也為其它產(chǎn)酶重組菌的優(yōu)化提供了有益參考。

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Screening of High L-Asparaginase Activity Mutants of Recombinant Bacteria WB600 by Atmospheric and Room Temperature Plasmas Mutation System

CHEN Xuan1，2，LIU Song1，2，F(xiàn)ENG Yue1，2，DU Guocheng1，2*，CHEN Jian1，2
（1.Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

L-asparaginase（L-ASNase）can catalyze the deamidation of L-asparagine（a precursor of toxic acrylamide）to L-aspartic acid and ammonia，and it is thus an important food enzyme.This study used Bacillus subtilis WB600 as the expression host，successfully realizing the secretory expression of L-ASNase.By using the atmospheric and room temperature plasmas（ARTP）mutation system，the titer of the recombinant L-ASNase was improved further.After 30 h fermentation，extracellular enzyme activity of recombinant B.subtilis WB600（pMA5-wapA-ansZ）reached 37.2 U/mL.This result suggested that L-ASNase can secrete to the medium mediated by a signal peptide of wapA.When treated with the ARTP at power input 120 W and gas flow rate 10 L/min for 40 s，a mutant of B.subtilis WB600（pMA5-wapA-ansZ）with a activity of 48.4 U/mL was obtained，the activity value was increased by 30%.These results suggested that ARTP mutation system can be used to improve the production of L-ASNase of recombinant strains.This study provided a good L-ASNase producing strain to fermentation production at an industrial scale.

L-asparaginase，Bacillussubtilis，heterologousexpression，atmosphericandroom temperature plasmas mutation

Q 814

A

1673—1689（2016）05—0485—07

2014-11-10

國家863計劃項目（2011AA100905）；國家973計劃項目（2012CB720806）。
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堵國成（1965—），男，江蘇常州人，工學(xué)博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事代謝工程、發(fā)酵過程優(yōu)化與控制等方面的研究。E-mail：gcdu@jiangnan.edu.cn