冷云偉，徐　巖

（1.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.中國礦業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 徐州221008）

采用BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化醬油固態(tài)釀造條件

冷云偉1，2，徐巖1*

（1.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.中國礦業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 徐州221008）

醬油是一種中國傳統(tǒng)發(fā)酵調(diào)味品。醬油的生產(chǎn)機理主要利用米曲霉所產(chǎn)的蛋白酶分解原料蛋白質(zhì)為氨基酸，通過后期發(fā)酵增香，經(jīng)淋油、滅菌、勾調(diào)而成。作者研究了米曲霉產(chǎn)蛋白酶在不同溫度、pH、鹽分條件下的特性，并且利用BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)對蛋白酶最佳作用條件進行了優(yōu)化。結(jié)果表明：最佳作用條件為42℃，pH 7.0，鹽度為0°Bé。以該結(jié)果為基礎(chǔ)，進行規(guī)模化實驗。結(jié)果表明：車間試驗發(fā)酵條件確定為溫度42℃，全程鹽度18°Bé，加鹽水比為1∶2，淋澆次數(shù)為3 次/d。

米曲霉；蛋白酶活力；醬油；神經(jīng)網(wǎng)路；固態(tài)釀造

我國目前主流的醬油生產(chǎn)工藝主要有兩種：一種是低鹽固態(tài)發(fā)酵，另一種是高鹽稀態(tài)發(fā)酵，其中前者占到80%左右。而兩種發(fā)酵方式都存在各自的缺點：低鹽固態(tài)雖然發(fā)酵周期短，但是原料蛋白質(zhì)利用率不高，產(chǎn)品風(fēng)味不好；高鹽稀態(tài)發(fā)酵發(fā)酵周期過長，勞動強度大，不適合大規(guī)模生產(chǎn)［1-4］。因此，尋求一種合適的發(fā)酵方式來提高醬油原料利用率、提高醬油風(fēng)味同時縮短發(fā)酵周期，已成為急需解決的問題［5-8］。由于醬油發(fā)酵的主要菌種是米曲霉，利用該菌種生產(chǎn)的成曲主要分泌堿性、中性和酸性蛋白酶，研究蛋白酶作用的最佳條件是提高蛋白質(zhì)利用率的主要方式［9-15］。

作者主要針對生產(chǎn)用醬油曲精所生產(chǎn)的成曲進行蛋白酶的粗提取，根據(jù)所產(chǎn)蛋白酶在不同溫度、鹽分和pH條件下的酶活數(shù)據(jù)，確定蛋白酶的最佳作用條件。利用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型對實驗條件進行深入優(yōu)化，得出最優(yōu)條件，并在此優(yōu)化的基礎(chǔ)上對放大規(guī)模最優(yōu)醬油發(fā)酵條件進行研究。

1材料與方法

1.1成曲蛋白酶液的分離提取

成品曲由江蘇恒順萬通食品釀造有限公司提供。稱取充分研細的成曲5 g，加水至100 mL，在40℃水浴內(nèi)間斷攪拌1 h，過濾，濾液用0.1 mol/L、pH 7.2的磷酸鹽緩沖溶液稀釋到一定倍數(shù)。

提取酸性和堿性蛋白酶時，各自加入相應(yīng)倍數(shù)的pH 3.0的乳酸緩沖液和pH 10.0的硼酸緩沖溶液。

1.2蛋白酶酶活力的測定

采用改進的福林酚法［17］，取試管3支，每管加入酶液稀釋液1 mL，置于40℃水浴中預(yù)熱2 min，再加入經(jīng)同樣預(yù)熱的酪蛋白1 mL，精確保溫10 min，時間到后，立即再各加入0.4 mol/L三氯乙酸2 mL，以終止反應(yīng)，繼續(xù)置于水浴鍋中保溫20 min，使殘余蛋白質(zhì)沉淀后過濾。另取試管3支，每管加入濾液1 mL，再加入0.4 mol/L碳酸鈉5 mL，已稀釋的福林試劑1 mL搖勻。40℃保溫發(fā)色20 min后測定吸光值。

空白試驗也取試管3支，測定方法同上，在加酪蛋白之前先加0.4 mol/L三氯乙酸2 mL，使酶失活，再加入酪蛋白。酶活力計算：在40℃下每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1 ug酪氨酸定義為1個蛋白酶活力單位（U）。

式中：A為樣品的凈吸光值，由標準曲線得相當?shù)睦野彼嵛⒖藬?shù)；4為4 mL反應(yīng)液取出1 mL測定；N為酶液稀釋倍數(shù)；10為反應(yīng)10 min；w為樣品水分質(zhì)量分數(shù)。

1.3溫度對成曲溶液酶活力的影響

鑒于溫度敏感性是米曲霉產(chǎn)蛋白酶的一個重要特性，設(shè)定鹽度為0°Bé、pH 7.5恒定，在25、30、35、40、45、50、55℃下精確保溫30 min，再調(diào)溫至40℃測定酶活力，以溫度為橫坐標，以相應(yīng)的酶活力為縱坐標，即可求得酶反應(yīng)的最適溫度。

1.4鹽度對成曲溶液酶活力的影響

鹽分在發(fā)酵生產(chǎn)過程當中主要起調(diào)味和抑制雜菌生長的作用，但是也會抑制蛋白酶的酶活。通過保持溫度40℃、pH 7.5不變的情況下，在0、5、10、15、20、25°Bé的鹽度下保持30 min，測定酶活力，可以了解到不同鹽分對蛋白酶的抑制程度。

1.5pH對成曲溶液酶活力的影響

pH不僅對酶活性有很大的影響，而且對酶的穩(wěn)定性也有很大的影響。將提取的酶液分成5份，分別置于pH為3、5、7、9、11緩沖溶液中保溫處理30 min，然后再調(diào)至pH 7.5測定酶活力。

1.6BP（Back Propagation）神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)對各因素的學(xué)習(xí)訓(xùn)練

人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)是近年來發(fā)展的一門前沿科學(xué)，已成為數(shù)學(xué)建模領(lǐng)域的一個熱點并在工程領(lǐng)域得到了較為廣泛的應(yīng)用［17-18］。作為一個非線性動態(tài)系統(tǒng)，人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)具有很強的自學(xué)習(xí)和自適應(yīng)能力，使得它適于處理在已知條件和結(jié)果之間無明確數(shù)學(xué)關(guān)系的數(shù)據(jù)，并能夠在條件與結(jié)果之間建立一定的關(guān)系。

對于蛋白酶反應(yīng)條件和酶活大小的對應(yīng)關(guān)系，現(xiàn)在來說還是一個盲區(qū)，或者說很多時候都是以經(jīng)驗為主，利用BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)剛好可以模擬此過程，進行深入優(yōu)化。

以溫度、鹽度和pH為輸入層的三個因素，以對應(yīng)條件下的蛋白酶酶活為輸出層因素，通過對單因素數(shù)據(jù)的不斷正向訓(xùn)練和反向傳播，不斷更改隱含層各節(jié)點的權(quán)值，得出模擬結(jié)果。網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1　BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練結(jié)構(gòu)圖Fig.1　Trained BP neural network structure diagram

2結(jié)果與討論

2.1單因素實驗結(jié)果與討論

2.1.1溫度對成曲蛋白酶酶活力的影響根據(jù)實驗所得數(shù)據(jù)，做出成曲溶液酶活力隨溫度的變化趨勢圖，見圖2。在其他的條件不變時，溫度對蛋白酶的影響極大，最低到620 U/g。而在最適溫度38℃時，酶活可以達到1 550 U/g。中性蛋白酶在36℃左右酶活最大，而堿性蛋白酶和酸性蛋白酶略低，在37℃左右。所以，在醬油發(fā)酵時，前期要保持在35～40℃之間，利于蛋白質(zhì)的分解利用。

圖2　溫度對成曲蛋白酶酶活力的影響Fig.2　Effects of temperatures on the enzyme activity

2.1.2鹽度對成曲蛋白酶酶活力的影響根據(jù)實驗所得數(shù)據(jù)做出隨鹽度的變化，蛋白酶酶活力的變化趨勢見圖3。鹽分主要在醬油發(fā)酵過程中對蛋白酶的影響主要是負面的。

在鹽度從0°Bé到10°Bé時，中性蛋白酶酶活下降較為快速，之后趨于緩慢。食鹽濃度的增加對3種酶都產(chǎn)生抑制作用，該抑制作用隨鹽度的增加而更加顯著。

圖3　鹽度對蛋白酶酶活力的影響Fig.3　Effects of salinity on enzyme activity of protease

2.1.3pH對成曲蛋白酶酶活力的影響根據(jù)實驗所得數(shù)據(jù)，做出酶活隨pH的變化趨勢，見圖4?？梢钥闯?，蛋白酶的最適作用pH在7左右，偏酸或偏堿都會影響蛋白酶的總體酶活，呈“倒鐘”形。pH較低時，酸性蛋白酶酶活力較高，但是因為在整體酶系中，酸性蛋白酶含量較少，而此時中性和堿性蛋白酶酶活減少，應(yīng)控制總酸，抑制變酸。

圖4　pH對蛋白酶酶活力的影響Fig.4　Effects of pH on the enzyme activity

2.2BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)對不同作用參數(shù)的研究探討

利用訓(xùn)練好的BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)對已做實驗數(shù)據(jù)進行驗證，見表1。

可以看出，網(wǎng)絡(luò)對已測值的模擬誤差在0.5%～6%波動，基本上很穩(wěn)定，可以利用訓(xùn)練好的網(wǎng)絡(luò)對影響因素進行進一步的優(yōu)化。

表1　　蛋白酶活力網(wǎng)絡(luò)模擬值和實測值的比對Table 1　Protease activity network simulation value and test value

本實驗采取溫度區(qū)間為 36、38、40、42、44、46℃；pH為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，利用訓(xùn)練好的網(wǎng)絡(luò)進行優(yōu)化，結(jié)果見圖5—7。

圖5　酸性蛋白酶網(wǎng)絡(luò)條件優(yōu)化結(jié)果Fig.5　Optimization results of acid protease networkcondition

由圖5可知，網(wǎng)絡(luò)所模擬的酸性蛋白酶在限制區(qū)間下，在36℃、pH 5.5具有最高酶活，隨著溫度和pH的升高，酶活快速下降。

圖6　中性蛋白酶神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)條件優(yōu)化結(jié)果Fig.6　Optimization results of neutral protease network condition

由圖6可知，中性蛋白酶的最佳作用條件是42℃、pH 7.0，在偏酸和溫度偏高的條件下，酶活力下降較快。

由圖7可以看出，堿性蛋白酶在溫度42℃、pH 為7.0時，有最佳的蛋白酶活性，在偏酸和溫度較低的條件下酶活下降較快。

圖5-7均為網(wǎng)絡(luò)模擬結(jié)果，采用最優(yōu)條件再次實驗，結(jié)果超出文獻參考值，見表2。

圖7　　堿性蛋白酶神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)條件優(yōu)化結(jié)果Fig.7　Optimization results of alkaline protease neural network condition

由表2可以看出，通過神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練，酸性蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶酶活均有了顯著提高，分別比優(yōu)化前提高了101.4%，52.8%，和33.6%，而且均高于文獻值。

2.3車間發(fā)酵試驗

車間共進行了三批共6大罐發(fā)酵試驗。確定的試驗工藝參數(shù)為：原料配比為豆粕∶麩皮=6∶4，鹽水濃度18°Bé，發(fā)酵作用溫度為40、45、50℃，加鹽水比為1°2，淋澆次數(shù)為3次/d。

發(fā)酵過程中不同溫度條件下的氨基酸態(tài)氮和總酸的變化情況見圖8。從氨基酸態(tài)氮的變化曲線可以看出，40～50℃條件下，溫度對氨基酸態(tài)氮的影響不明顯；發(fā)酵前期氨基酸態(tài)氮增長都較慢，但逐漸增長，蛋白質(zhì)分解時間較長，同時利于其他微生物的生長，利于后期生香；總酸的變化曲線顯示，45℃最適于生酸，進一步提高溫度，生酸變緩，而且催化產(chǎn)物產(chǎn)生高峰較早出現(xiàn)，并且峰值較低。

圖8　　車間發(fā)酵不同溫度條件下氨基酸和總酸變化Fig.8　AN and total acid change in workshop fermentation condition under different temperature

3結(jié)語

通過單因素試驗，得出了米曲霉產(chǎn)蛋白酶的最佳作用條件是：38℃、pH 7.0、鹽度為3°Bé。通過BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的優(yōu)化，得出了米曲霉產(chǎn)蛋白酶的作用條件應(yīng)為：42℃、pH 7.0、鹽度為0°Bé。因為鹽度對蛋白酶酶活具有抑制作用，所以在單因素試驗過程中，未添加鹽分。通過對網(wǎng)絡(luò)模擬條件的實際操作，得出實驗結(jié)果也較單因素階段有較大提高。結(jié)合生產(chǎn)實際，修正部分工藝參數(shù)后，進行了三批共6大罐發(fā)酵試驗。確定的試驗工藝參數(shù)為：原料配比為豆粕∶麩皮=6∶4，鹽水濃度18°Bé，發(fā)酵作用溫度為45℃，加鹽水比為1∶2，淋澆次數(shù)為3次/d。

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Study on the Optimization of Solid State Fermentation Conditions of Soy Sauce by Using BP Neural Network

LENG Yunwei1，2，XU Yan1*
（1.Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.Department of Biological Engineering，China University of Mining and Technology，Xuzhou 221008，China）

Soy sauce is a kind of Chinese traditional fermented condiment.The main mechanism of soy sauce production is the decomposition of raw protein into amino acids using protease formed by Aspergillus oryzae，and the late fermentation flavor，shower oil，sterilization and blending into.This paper studies the characteristics of the protease formed by Aspergillus oryzae in different temperature，pH and salinity conditions analysis，and by using BP neural network to optimize the protease hydrolyse conditions.The results show：the best effect condition of 42℃，pH 7.0，salinity is 0°Bé.With the above research results as the foundation，carries on the scale of the experiment，the results showed that：the shop tests the optimal fermentation conditions for a temperature of 42℃，the whole salinity 18°Bé，and salt water ratio is 1∶2，pouring 3 times/day.

Aspergillus oryzae，protease，soy sauce，neural network，solid state fermentation

TQ 920.1

A

1673—1689（2016）05—0471—06

2014-10-17

國家863計劃項目（2012AA021301；2008BAI63B07）。
*

徐巖（1962—），男，浙江慈溪人，工學(xué)博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事釀酒科學(xué)與酶技術(shù)方面的研究。E-mail：yxu@jiangnan.edu.cn