姬會(huì)春，周 燏，劉軍權(quán)，陳復(fù)興，李 昳，費(fèi)素娟

1.徐州醫(yī)學(xué)院研究生院，江蘇 徐州 221002； 2.中國(guó)人民解放軍第97醫(yī)院實(shí)驗(yàn)科； 3.徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化科

阿托伐他汀對(duì)人NK細(xì)胞殺傷HCT-116細(xì)胞的影響及其機(jī)制研究

姬會(huì)春1，周 燏2，劉軍權(quán)2，陳復(fù)興2，李 昳2，費(fèi)素娟3

1.徐州醫(yī)學(xué)院研究生院，江蘇 徐州 221002； 2.中國(guó)人民解放軍第97醫(yī)院實(shí)驗(yàn)科； 3.徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化科

目的 探討阿托伐他汀對(duì)人自然殺傷細(xì)胞(natural killer，NK)殺傷HCT-116細(xì)胞的影響及其機(jī)制。方法 CCK-8法測(cè)定不同濃度的阿托伐他汀對(duì)HCT-116 細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率的影響。自動(dòng)生化分析儀測(cè)NK細(xì)胞對(duì)HCT-116 細(xì)胞的殺傷活性；流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)HCT-116 細(xì)胞MICA/B的表達(dá)率。結(jié)果 不同濃度的阿托伐他汀作用于HCT-116細(xì)胞48 h后在濃度為5～40 μmol/L及作用96 h后在濃度為1.25～40 μmol/L時(shí)，對(duì)HCT-116細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。阿托伐他汀濃度相同時(shí)，HCT-116細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率在48 h組與96 h組相比，除5 μmol/L濃度組外差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。阿托伐他汀的濃度與HCT-116細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率呈正相關(guān)(r[48h]=0.13，r[96h]=0.22，P<0.05)。NK細(xì)胞對(duì)HCT-116細(xì)胞的殺傷活性在阿托伐他汀濃度為2.5～10 μmol/L各組中均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。2.5 μmol/L濃度組及5 μmol/L濃度組，HCT-116細(xì)胞MICA/B的表達(dá)率與對(duì)照組比較顯著升高(P<0.05)。結(jié)論 阿托伐他汀呈劑量依賴性抑制HCT-116細(xì)胞的生長(zhǎng)，且延長(zhǎng)作用時(shí)間可以增強(qiáng)阿托伐他汀對(duì)HCT-116細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用；還能夠增強(qiáng)NK細(xì)胞對(duì)HCT-116殺傷活性；以及上調(diào)HCT-116細(xì)胞MICA/B的表達(dá)率，提高其免疫原性。

阿托伐他??；HCT-116細(xì)胞；自然殺傷細(xì)胞；MICA/B

近年，隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展、人們生活習(xí)慣、飲食結(jié)構(gòu)的改變及環(huán)境污染等，結(jié)腸癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，新發(fā)病例以每年4%的速度增長(zhǎng)，每年新發(fā)病例超過17萬，現(xiàn)已成為我國(guó)發(fā)病率上升最快的惡性腫瘤之一[1-2]，嚴(yán)重威脅著國(guó)人類的健康。他汀類藥物是臨床常用的降血脂藥物。近年來有研究表明，他汀類藥物具有抗腫瘤作用[3]。NK細(xì)胞是天然免疫細(xì)胞，臨床上NK細(xì)胞過繼免疫治療多種腫瘤已取得了一些療效。如何增強(qiáng)NK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性是提高NK細(xì)胞抗腫瘤療效的關(guān)鍵。目前尚沒有阿托伐他汀與NK細(xì)胞聯(lián)合應(yīng)用進(jìn)行抗腫瘤研究的報(bào)道。本文擬探討阿托伐他汀對(duì)NK細(xì)胞殺傷HCT-116細(xì)胞的影響及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 阿托伐他汀(輝瑞制藥有限公司)；人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT-116(低分化腺癌)(中科院上海細(xì)胞所)；CCK-8試劑盒(碧云天)；PE標(biāo)記MICA/B、PE標(biāo)記的CD3、FITC標(biāo)記的CD56(美國(guó)BD公司)；ST-360酶標(biāo)儀(上?？迫A實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有限公司)；Encore自動(dòng)生化分析儀(北京希亞克技術(shù)有限公司)；流式細(xì)胞儀(flow cymetory，F(xiàn)CM)(美國(guó)BD公司)。

1.2 HCT-116細(xì)胞的培養(yǎng) 復(fù)蘇后的HCT-116加入適宜的培養(yǎng)液，置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中，2～3 d半量更換培養(yǎng)液，平均3 d傳代1次。待細(xì)胞鋪滿瓶底時(shí)用0.25%的胰酶消化脫壁，1 800 r/min離心6 min，離心半徑為13 cm，棄上清液，收集細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 CCK-8檢測(cè)HCT-116細(xì)胞抑制作用 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCT-116細(xì)胞，PBS洗滌3次，將細(xì)胞配成1×104個(gè)/ml的細(xì)胞懸液加入96孔板內(nèi)，培養(yǎng)24 h后加入不同濃度的阿托伐他汀，同時(shí)設(shè)DMSO 溶劑對(duì)照組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。分別于44 h、92 h時(shí)每孔加入CCK-8 20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，輕輕搖勻，于酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處測(cè)OD值。按下列公式計(jì)算結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率：生長(zhǎng)抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)×100%。

1.4 自動(dòng)生化儀測(cè)定NK細(xì)胞殺傷活性 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCT-116細(xì)胞予胰酶消化，洗滌3次，將細(xì)胞配成5×105個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，加入6孔細(xì)胞培養(yǎng)板。分別將不同濃度的阿托伐他汀加入細(xì)胞培養(yǎng)板中，收集培養(yǎng)第48 h的HCT-116細(xì)胞，將細(xì)胞密度調(diào)整為2×105個(gè)/ml，作為靶細(xì)胞。以培養(yǎng)后的NK 細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2×106個(gè)/ml，按效靶比10∶1接種于試管中，置 37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h，1 000 r/min離心5 min(離心半徑為13 cm)，吸取上清液，自動(dòng)生化分析儀測(cè)乳酸脫氫酶(LDH)值。按下列公式計(jì)算NK細(xì)胞的殺傷活性：殺傷活性=(實(shí)驗(yàn)組LDH值-效應(yīng)細(xì)胞自然釋放組LDH值)/(靶細(xì)胞最大釋放組LDH值-靶細(xì)胞自然釋放組LDH值)×100%。

1.5 FCM檢測(cè)檢測(cè)MHC-I類鏈相關(guān)分子A/B(MICA/B)表達(dá) 收集HCT-116細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105個(gè)/ml，以每孔5 ml接種于6孔板內(nèi)，加入不同濃度的阿托伐他汀，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，PBS洗滌，調(diào)整細(xì)胞密度至1×107個(gè)/ml，取細(xì)胞懸液100 μl，加入PE-MIC A/B 20 μl，室溫避光孵育15 min，同時(shí)設(shè)同型IgG1作為對(duì)照。PBS洗滌并重懸細(xì)胞，F(xiàn)CM檢測(cè)MICA/B的表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度阿托伐他汀對(duì)HCT-116細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率的影響 作用48 h后，阿托伐他汀濃度為5～40 μmol/L的4個(gè)實(shí)驗(yàn)組中及作用96 h后阿托伐他汀1.25～40 μmol/L的所有濃度組中，HCT-116細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。阿托伐他汀濃度相同時(shí)，HCT-116細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率在48 h組與96 h組之間比較，除5 μmol/L濃度組外差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見表1)。另外，相關(guān)分析顯示，阿托伐他汀的濃度與HCT-116細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率呈正相關(guān)(r[48h]=0.13，r[96h]=0.22，P<0.05，見圖1)。

藥物濃度(μmol/L)HCT-116細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率48hOD值抑制率(%)96hOD值抑制率(%)0(對(duì)照組)1.81±0.0901.86±0.0801.251.78±0.082.08±0.181.69±0.098.36±0.18*△2.51.78±0.101.60±0.151.68±0.079.61±0.20*△51.74±0.083.79±0.38*1.69±0.088.51±0.28*101.75±0.083.52±0.34*1.63±0.0811.58±0.44*△201.68±0.097.26±0.14*1.61±0.0919.12±1.25*△401.42±0.0721.68±1.40*1.01±0.0645.46±1.96*△

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與48 h組比較，△P<0.05。

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與48 h組比較，△P<0.05。

圖1 不同濃度阿托他汀與HCT-116細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率的相關(guān)性分析

Fig 1 Correlation analysis of different concentrations of Atorvastatin and HCT-116 cell growth inhibition rate

2.2 不同濃度阿托伐他汀對(duì)NK細(xì)胞殺傷HCT-116細(xì)胞活性的影響 NK細(xì)胞對(duì)HCT-116細(xì)胞的殺傷活性在阿托伐他汀2.5～10 μmol/L的3個(gè)濃度組中均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，其中5 μmol/L濃度組NK細(xì)胞對(duì)HCT-116細(xì)胞的殺傷活性最高(見表2)。

藥物濃度(μmol/L)LDH值HCT-116殺傷活性0(對(duì)照組)84.97±2.5640.23±2.342.5108.80±6.0259.32±3.90*5101.10±12.0462.30±2.46*1082.33±7.9850.42±5.64*2091.33±4.0845.32±2.394083.98±5.7339.43±5.46

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05； 1.2 μmol/L濃度組與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，未作統(tǒng)計(jì)。

2.3 不同濃度阿托伐他汀HCT-116細(xì)胞MIC濃度組A/B表達(dá)的影響 在2.5 μmol/L濃度組及5 μmol/L濃度組，HCT-116細(xì)胞MICA/B的表達(dá)率與對(duì)照組比較顯著升高(P<0.05)；40 μmol/L濃度組HCT-116細(xì)胞MICA/B表達(dá)率明顯降低，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表3)。

藥物濃度μmol/L)MICA/B表達(dá)率P值0(對(duì)照組)51.29±2.80—2.570.98±2.10<0.05564.87±3.27<0.051055.40±3.83>0.052042.42±4.47>0.054027.19±2.78<0.05

注：1.25 μmol/L濃度組與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，未作統(tǒng)計(jì)。

3 討論

結(jié)腸癌是一種發(fā)病率和死亡率均較高的惡性腫瘤，居我國(guó)男性惡性腫瘤發(fā)病率的第5位，女性的第3位[4]。由于結(jié)腸癌患者早期無明顯癥狀，臨床上確診時(shí)大都已發(fā)展為中晚期，錯(cuò)過了最佳手術(shù)期，預(yù)后差、病死率高。為延長(zhǎng)患者生存時(shí)間、提高患者生活質(zhì)量，尋找新的、有效、低毒的治療藥物具有重要的臨床意義。目前結(jié)腸癌的發(fā)病原因尚不明確，最近有報(bào)道認(rèn)為可能為自身免疫性疾病，細(xì)胞免疫與實(shí)體腫瘤的抗腫瘤機(jī)制有關(guān)[5]。越來越多臨床工作者研究利用藥物增強(qiáng)免疫細(xì)胞的抗腫瘤功能來達(dá)到腫瘤治療的目的。

他汀類藥物作為臨床常用的降血脂藥物，近年來人們還發(fā)現(xiàn)其具有抗腫瘤作用，但目前抗腫瘤的相關(guān)機(jī)制尚不明確，多項(xiàng)研究表明可能與以下機(jī)制有關(guān)：(1)他汀類藥物可通過抑制基因轉(zhuǎn)錄后的異戊二烯化從而抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，推測(cè)異戊二烯代謝物具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的作用[6]；(2)Ras突變是腫瘤發(fā)生過程中經(jīng)常發(fā)生的事件，他汀類藥物可以抑制Ras蛋白翻譯后修飾，阻滯Ras信號(hào)傳導(dǎo)，從而影響細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞分化或凋亡。Park等[7]關(guān)于洛伐他汀對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖研究中同樣證實(shí)了這一點(diǎn)；(3)半胱氨酸蛋白酶(Caspase)是細(xì)胞凋亡中起重要作用的一類蛋白水解酶，Caspase活化與凋亡的啟動(dòng)有關(guān)，Bcl-2可阻礙細(xì)胞的凋亡過程。Cho等[8]通過小鼠結(jié)腸癌移植瘤動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)辛伐他汀可上調(diào)Caspase-3蛋白表達(dá)，下調(diào)Bcl-2表達(dá)，誘導(dǎo)HCT-l16細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用不同濃度的阿托伐他汀作用于HCT-116，結(jié)果顯示隨著阿托伐他汀濃度的升高，對(duì)HCT-116生長(zhǎng)抑制作用逐漸增強(qiáng)，分析結(jié)果顯示兩者呈正相關(guān)，證實(shí)阿托伐他汀呈劑量依賴性抑制HCT-116的生長(zhǎng)，且延長(zhǎng)作用時(shí)間可以增強(qiáng)阿托伐他汀對(duì)HCT-116細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。

NK細(xì)胞是先天性免疫系統(tǒng)的重要組成部分，對(duì)靶細(xì)胞的識(shí)別無主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)限制性，腫瘤細(xì)胞表達(dá)的MICA分子與NK細(xì)胞表面的活化型受體NKG2D交聯(lián)，可以促使NK細(xì)胞活化并產(chǎn)生穿孔素和顆粒酶裂解靶細(xì)胞，從而提高NK細(xì)胞對(duì)腫瘤的殺傷活性[9]。Pende等[10-11]研究發(fā)現(xiàn)，NK細(xì)胞對(duì)高表達(dá)MICA的腫瘤細(xì)胞殺傷活性明顯高于低表達(dá)者或者陰性者，殺傷活性增強(qiáng)的機(jī)理可能與腫瘤細(xì)胞MICA等配體的表達(dá)上調(diào)誘導(dǎo)NK細(xì)胞的活化有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用不同濃度阿托伐他汀作用48 h后的HCT-116與NK細(xì)胞配置成10∶1效靶比，發(fā)現(xiàn)NK細(xì)胞對(duì)HCT-116細(xì)胞的殺傷活性在阿托伐他汀5～10 μmol/L時(shí)顯著高于對(duì)照組。證實(shí)阿托伐他汀可增強(qiáng)HCT-116細(xì)胞對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞殺傷活性，推測(cè)NK細(xì)胞的殺傷活性升高可能與阿托伐他汀提高HCT-116細(xì)胞NKG2D的配體MIC A/B表達(dá)有關(guān)。

MICA是位于HLA-B位點(diǎn)上游約46 kb的基因，具有多態(tài)性[12]，其編碼產(chǎn)物介導(dǎo)細(xì)胞應(yīng)激時(shí)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，該分子在正常細(xì)胞和組織中不表達(dá)，但癌變、感染或應(yīng)激狀態(tài)可上調(diào)其表達(dá)，MICA具有免疫原性，是一種腫瘤相關(guān)抗原[13]。Li等[14]運(yùn)用免疫組化檢測(cè)82例卵巢癌患者腫瘤組織MICA/B表達(dá)，結(jié)果表明腫瘤組織中MICA/B表達(dá)率高達(dá)97.6%，而正常組織中基本不表達(dá)。而Watson等[15]研究結(jié)果顯示結(jié)直腸癌MICA高表達(dá)可作為結(jié)直腸癌預(yù)后良好的指標(biāo)之一。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示不同濃度阿托伐他汀作用于HCT-116細(xì)胞48 h后，在阿托伐他汀濃度2.5 μmol/L及5 μmol/L組， MICA/B的表達(dá)率與對(duì)照組比較顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，證實(shí)阿托伐他汀可以上調(diào)HCT-116細(xì)胞MICA/B的表達(dá)，增強(qiáng)其免疫原性，有利于NK細(xì)胞表面NKG2D受體的識(shí)別，提高NK細(xì)胞對(duì)HCT-116細(xì)胞的殺傷活性。

本研究證實(shí)阿托伐他汀能抑HCT-116細(xì)胞的增殖，能通過上調(diào)HCT-116細(xì)胞表達(dá)MICA/B，增強(qiáng)NKG2D受體識(shí)別MICA/B的能力，從而達(dá)到增強(qiáng)NK細(xì)胞殺傷HCT-116細(xì)胞敏感性。實(shí)驗(yàn)研究表明兩者存在著藥物劑量的依賴性，如何找到一種安全合適劑量進(jìn)行抗腫瘤治療是需要解決的問題。

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(責(zé)任編輯：馬軍)

The effect and mechanism of Atorvastatin on the cytotoxicity of human NK cells to HCT-116 cells

JI Huichun1, ZHOU Yu2, LIU Junquan2, CHEN Fuxing2, LI Yi2, FEI Sujuan3

1.School of Postgraduate, Xuzhou Medical College, Xuzhou 221002; 2.Department of Laboratory, the 97th Hospital of PLA; 3.Department of Gastroenterology, the Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College, China

Objective To investigate the mechanism of the cytotoxicity of NK cell induced by Atorvastatin to HCT-116 cells.Methods The effect of different concentrations of Atorvastatin on the growth of HCT-116 cells was measured by CCK-8. Automatic biochemical analyzer was applied to test the cytotoxicity of NK cells to HCT-116 cells. Flow cytometry (FCM) was used to detect the expression rate of MICA/B in the cells.Results Atorvastatin could inhibit the growth of HCT-116 cells, the inhitbition rates of HCT-116 were higher than those in the control group in different concentrations of Atorvastatin treatment 48 hours and 96 hours. Statistical analysis showed that the inhibition rates of HCT-116 had significant difference compared with the control group (P<0.05) when Atorvastatin was 5-40 μmol/L after 48 hours and 1.25-40 μmol/L after 96 hours. Correlation analysis showed that the concentration of Atorvastatin and the growth inhibition rate of HCT-116 cells were positively correlated(r[48h]=0.13，r[96h]=0.22，P<0.05). The cytotoxicity of NK cells to HCT-116 cells was higher than the control group when Atorvastatin was 2.5-10 μmol/L (P<0.05). The expression of MICA/B on HCT-116 cells was higher than the control group (P<0.05) in the concentration of 2.5 μmol/L and 5 μmol/L.Conclusion Atorvastatin could inhibit the growth of HCT-116 cells in a dose-dependent manner; and it could enhance the cytotoxic activity of the NK cells to HCT-116 cells; it also could promote the expression of MICA/B on HCT-116 cells, and improve the immunogenicity of HCT-116 cells.

Atorvastatin; HCT-116; Natural Killer cells; MICA/B

南京軍區(qū)醫(yī)學(xué)科技創(chuàng)新課題(13MA039)

姬會(huì)春，碩士研究生，主治醫(yī)師，研究方向：消化道腫瘤免疫治療。E-mail：48587581@qq.com

費(fèi)素娟，碩士，教授，碩士生導(dǎo)師，主任醫(yī)師，研究方向：消化系腫瘤的基礎(chǔ)與臨床研究。E-mail:feisj1031@ yahoo.com.cn

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.03.019

R735.3

A

1006-5709(2016)03-0304-04

2015-06-04