楊琳 曾英 李勁平 劉珊 王文杰 楊巖冰 莫新民

1. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)， 長沙 410007 2. 中南大學(xué)藥學(xué)院， 長沙 410013

補骨脂素為補骨脂的主要化學(xué)成分，具有促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、分化，可用于骨質(zhì)疏松癥治療[1-3]。近年有研究表明補骨脂素可與雌激素受體(ER)結(jié)合，啟動雌激素受體元件，具有擬雌激素活性[4-6]。壯骨止痛膠囊是本課題組研發(fā)的治療原發(fā)性骨質(zhì)疏松的已上市六類中藥新藥，補骨脂是壯骨止痛膠囊中的君藥，而補骨脂素是壯骨止痛膠囊的主要定量控制指標(biāo)之一。課題組已有研究表明補骨脂素對于雙側(cè)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠模型具有良好抗骨質(zhì)疏松作用[7]。近年來的研究表明免疫系統(tǒng)在骨質(zhì)疏松發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-17(IL-17)在骨質(zhì)疏松發(fā)生發(fā)展過程中扮演了重要角色，本研究通過觀察補骨脂素對去勢骨質(zhì)疏松雌鼠血清雌激素(E2)、ERβ、TNF-α、IL-17水平及骨組織ERβ、TNF-α、IL-17基因表達(dá)的影響，探討補骨脂素抗絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松作用機理。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雌性SD大鼠72只，3月齡，體重210～250 g，購自湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司，動物質(zhì)量合格證號NO.43004700005517，湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心許可證號：SCXK(湘)2013-0004。

1.2 藥品

壯骨止痛膠囊(四川美大康藥業(yè)股份有限公司，批準(zhǔn)文號：Z20050118)、補骨脂素(中國藥品生物制品檢定所，純度>98%)，戊酸雌二醇(拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司，批準(zhǔn)文號：J20130009)，青霉素鈉(哈藥集團制藥總廠，批號：A1301022417)。

1.3 試劑

大鼠腫瘤壞死因子-α檢測試劑盒(上海邦奕生物科技有限公司，批號：201410)，大鼠白介素-17檢測試劑盒(上海邦奕生物科技有限公司，批號：201406)，大鼠ERβ免疫組化試劑盒(上海雅吉生物科技有限公司)，雌二醇E2檢測試劑盒(上海邦奕生物科技有限公司，批號：201406)，TRIZOL試劑(美國Invitrogen公司，批號：28218)，Go Taq Green MasterMix(美國Promega公司，批號：0000110146)，DNA Marker I(天能生物科技有限公司，批號：20140714)，瓊脂糖(天能生物科技有限公司，批號：111860)，TBE液(天能生物科技有限公司，批號：20140714)，水合氯醛(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號：20120110)，無水乙醇(上海振興化工一廠，批號：201408301)，氯仿(國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號：T20101202)，異丙醇(國藥集團試劑有限公司，批號：20120627)，液氮(長沙日臻氣體有限公司)。

1.4 儀器

凝膠成像分析系統(tǒng)(美國Bio-Rad)，PCR 擴增儀(北京六一儀器廠，型號：WD-9402A)，核酸蛋白分析儀(Eppendorf Biophotometer plus，型號：GPS-9160MBE)，立式壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠，型號：LDZX-30KBS)，全自動雪花制冰機(常熟市雪科電器有限公司，型號：IMS-30)，電泳儀槽(北京六一儀器廠，型號：DYY-8c)，電泳槽(北京六一儀器廠，型號：DYCP-31DN)，電子天平(奧豪斯儀器有限公司，型號：CP214)，-80度冰箱(Thermo scientific)，-20度冰箱(Haier 低溫冷柜)，-4度冰箱(Haier 冷藏箱)，微波爐(Midea 417-ykk)，移液槍(規(guī)格0.5～10 ul；20～200ul；100～1 000 ul)，液氮生物容器(YDS-10 型 編號：20060282)。

1.5 分組及造模方法

72只雌性SD雌鼠，按體重隨機分為假手術(shù)組、模型組、戊酸雌二醇對照組、壯骨止痛膠囊對照組、補骨脂素高劑量組、補骨脂素低劑量組共6組，每組12只。每只大鼠分別用2%的水合氯醛腹腔注射麻醉(0.35 ml/100 g)后，在無菌條件下從距離第一腰椎兩側(cè)外1 cm處縱向切開，除假手術(shù)組僅切除少許脂肪組織外，其余各組大鼠完整摘除雙側(cè)卵巢，徹底止血后分兩層縫合切口。術(shù)后各組大鼠切口嚴(yán)格用絡(luò)合碘消毒，連續(xù)3 d肌注獸用青霉素 (4萬u/只/天)抗炎，5 d后拆線。

1.6 給藥方法

各組均從術(shù)后一周開始給藥，每天灌胃1次，連續(xù)13周。除假手術(shù)組和模型組每天灌胃相應(yīng)體積蒸餾水外，其余各組開始灌胃相應(yīng)藥物(1 ml/100 g)。劑量按人鼠體表面積折算，戊酸雌二醇對照組按0.21 mg/kg給藥，壯骨止痛膠囊對照組按相當(dāng)于生藥6.6 g/kg給藥，補骨脂素高、低劑量組分別按8 mg/kg和4 mg/kg給藥。

1.7 指標(biāo)檢測

實驗過程中，所有大鼠自由飲水?dāng)z食，每10天稱體重1次。給藥l3周后，每組選取10只大鼠分別用2%的水合氯醛腹腔注射麻醉(0.35 ml/100 g)后，切開腹腔，分離腹主動脈插管取血2 ml，待凝固后500 g/min離心分離血清，ELISA法檢測血清中E2、TNF-α、IL-17的含量。提取左股骨組織mRNA樣本進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)檢測TNF-α、ERβ、IL-17的基因表達(dá)，取右股骨脫鈣切片免疫組化檢測ERβ。

1.7.1RT-PCR：(1)總RNA提?。喝?80℃保存的左股骨，在研缽中加入液氮研碎，加入1 ml Trizol，按Trizol說明書抽提總RNA，采用紫外分光光度計測定其濃度及純度，A260/A280均在1.8～2.0之間。(2)cDNA合成：采用20 μL逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，內(nèi)含2 μg待測RNA，操作嚴(yán)格按照逆轉(zhuǎn)錄合成說明書執(zhí)行。(3)引物序列及擴增條件：按照PCR反應(yīng)條件，取2 μL cDNA模板配成25 μL反應(yīng)體系進(jìn)行目的基因擴增。ERβ有意義鏈5′- TCACCGTCGAGCCTTAGTTC -3′，反意義鏈5′- TCTGCATAGAGGAGCGATGA -3′；TNF-α有意義鏈5′-ACGTCGTAGCAAACCACCAA-3′，反意義鏈5′-CTGGGAGTAGATAAGGTACA-3′；IL-17有意義鏈5′ATCCATGTGCCTGATGCTGT-3′，反意義鏈5′-GTTATTGGCCTCGGCGTTTG-3′；內(nèi)對照β-actin有意義鏈5′- CCTAGCACCATGAAGATCAA -3′，反意義鏈5′- TTTCTGCGCAAGTTAGGTTTT -3′。ERβPCR擴增循環(huán)參數(shù)：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s、50℃退火30 s、72℃延伸30 s，35個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。TNF-αPCR擴增反應(yīng)循環(huán)參數(shù)：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s、53℃退火30s、72℃延伸30 s，35個循環(huán)，最后72℃延伸10 min，擴增片段141 bp。IL-17PCR擴增循環(huán)參數(shù)：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸30 s，35個循環(huán)，最后72℃延伸10 min，擴增片段106 bp。β-acin擴增循環(huán)參數(shù)：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸30 s，35個循環(huán)，最后72℃延伸10 min，擴增片段227 bp。(4)半定量分析：各取PCR產(chǎn)物3 ul，用2%的瓊脂糖電泳及溴化已錠染色，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad) 進(jìn)行拍照，用Image Lab 5.0軟件進(jìn)行定量分析。計算ERβ、TNF-α、IL-17產(chǎn)物電泳條帶灰度與β-actin產(chǎn)物電泳條帶灰度比值。

1.7.2免疫組化檢測ERβ：取大鼠的完整右股骨，去除附著的肌肉和筋膜后浸泡在10%福爾馬林PBS中脫鈣后按常規(guī)切片、脫蠟至水洗后經(jīng)抗原修復(fù)。加3%H202PBS溶液室溫孵育10 min，PBS沖洗3次，滴加正常山羊血清(1∶10)室溫孵育10 min。滴加兔抗大鼠ERβ抗體，陰性對照切片采用正常羊血清代替一抗，4℃孵育過夜。然后PBS浸洗3次，再滴加生物素標(biāo)記羊抗兔IgG，室溫反應(yīng)30 min，PBS浸洗3次，然后滴加HRP鏈霉菌抗生物素蛋白，室溫反應(yīng)20 min；PBS浸洗3次；然后用0.06%DAB顯色8 min；蘇木精復(fù)染，酒精脫水，二甲苯透明后中性樹膠封片。Olympus BX51型顯微鏡下觀察、拍照，在Image-Pro Plus4.5進(jìn)行圖像分析。

1.8 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果

2.1 補骨脂素對大鼠血清E2測定結(jié)果

與假手組相比，模型組大鼠血清E2水平非常顯著降低(P<0.01)。與模型組相比，壯骨止痛膠囊顯著升高血清E2水平(P<0.05)，補骨脂素高劑量組血清E2水平顯著升高(P<0.05)，補骨脂素低劑量組血清E2水平升高趨勢明顯，但沒有統(tǒng)計學(xué)差異。見表1。

表1 不同組別補骨脂素對去卵巢雌鼠血清E2水平的影響(n=6)Table 1 Effect of psoralen on the serum level of E2 in ovariectomized rats of different groups (n=6).

注：與模型組比較，**P<0.01，*P<0.05

2.2 補骨脂素對大鼠股骨ERβ表達(dá)的影響

與假手組相比，模型組股骨ERβ的mRNA轉(zhuǎn)錄和表達(dá)均顯著降低(P<0.01或P<0.05)。與模型組相比，戊酸雌二醇組ERβ的表達(dá)顯著升高(P<0.01或P<0.05)；壯骨止痛膠囊組股骨ERβ基因表達(dá)顯著升高(P<0.05)；補骨脂素高劑量組股骨ERβ基因表達(dá)顯著升高(P<0.05)，補骨脂素低劑量組對股骨ERβ基因表達(dá)沒有統(tǒng)計學(xué)差異，見表2。各組ERβmRNA表達(dá)電泳圖見圖1，股骨ERβ免疫組化染色見圖2。

2.3 補骨脂素對大鼠血清TNF-α水平及基因表達(dá)的影響

與假手組相比，模型組血清TNF-α水平和股骨TNF-α基因表達(dá)均非常顯著升高(P<0.01)。與模型組相比，戊酸雌二醇組血清TNF-α水平和股骨

表2 不同組別補骨脂素對去卵巢雌鼠股骨ERβ表達(dá)的影響(n=6)Table 2 Effect of psoralen on ERβ in the femur in ovariectomized rats of different groups (n=6).

注：與模型組比較，**P<0.01，*P<0.05

圖1 各組ERβmRNA表達(dá)電泳圖譜 1：補骨脂素低劑量；2：補骨脂素高劑量；3：戊酸雌二醇；4：假手術(shù)組；5：模型組；6：壯骨止痛方；M=DNA MarkerFig.1 The ERβ mRNA expression in each group. 1: Psoralen low dose; 2: Psoralen high dose; 3: Sham operation group; 4:Estradiol group; 5:Model group; 6:ZGZT capsule group; M: DNA Marker.

TNF-α基因表達(dá)均非常顯著降低(P<0.01)；壯骨止痛膠囊組股骨TNF-α基因表達(dá)非常顯著降低(P<0.01)，血清TNF-α水平顯著降低(P<0.05)；補骨脂素高劑量組血清TNF-α水平和股骨TNF-α基因表達(dá)均顯著降低(P<0.05)，補骨脂素低劑量組血清TNF-α水平顯著降低(P<0.05)，而股骨TNF-α基因表達(dá)沒有統(tǒng)計學(xué)差異，見表3。各組TNF-αRNA表達(dá)電泳趨勢圖譜見圖3。

表3 不同組別補骨脂素對去卵巢雌鼠血清TNF-α水平及股骨TNF-α基因表達(dá)的影響(n=6)Table 3 Effect of psoralen on serum TNF-α and the gene expression of TNF-α in ovariectomized rats of different groups (n=6).

注：與模型組比較，**P<0.01，*P<0.05

2.4 補骨脂素對大鼠血清IL-17水平及其基因表達(dá)的影響

與假手組相比，模型組血清IL-17水平和股骨IL-17基因表達(dá)均非常顯著升高(P<0.01)。與模型組相比，戊酸雌二醇組血清IL-17水平和股骨IL-17基因表達(dá)均非常顯著降低(P<0.01)；壯骨止痛膠囊組股骨IL-17基因表達(dá)非常顯著降低(P<0.01)，血清IL-17水平顯著降低(P<0.05)；補骨脂素高劑量組血清IL-17水平非常顯著降低(P<0.01)，而股骨IL-17基因表達(dá)顯著降低(P<0.05)，補骨脂素低劑量組血清IL-17水平和股骨IL-17基因表達(dá)均顯著降低(P<0.05)，見表4。各組IL-17 mRNA表達(dá)電泳圖譜見圖4。

表4 不同組別補骨脂素對去勢雌鼠血清IL-17水平及股骨IL-17基因表達(dá)的影響(n=6)Table 4 Effect of psoralen on serum IL-17 and the gene expression of IL-17 in ovariectomized rats of different groups (n=6).

注：與模型組比較，**P<0.01，*P<0.05

圖3 各組TNF-αRNA表達(dá)電泳趨勢圖譜 1：補骨脂素低劑量組；2：補骨脂素高劑量組；3：假手術(shù)組；4：陽性對照組；5：模型組；6：壯骨止痛方組；M：DNA Marker Fig.3 The TNF-α mRNA expression in each group. 1: Psoralen low dose; 2: Psoralen high dose; 3: Sham operation group; 4:Estradiol group; 5:Model group; 6:ZGZT capsule group; M: DNA Marker.

圖4 各組IL-17 mRNA表達(dá)電泳圖譜 1：補骨脂素低劑量組；2：補骨脂素高劑量組；3：壯骨止痛方組；4：假手術(shù)組；5：陽性對照組；6：模型組；M：DNA Marker Fig.4 The IL-17 mRNA expression in each group. 1: Psoralen low dose; 2: Psoralen high dose; 3: Sham operation group; 4:Estradiol group; 5:Model group; 6:ZGZT capsule group; M: DNA Marker.

3 討論

補骨脂素是補骨脂的主要活性成分，可與雌激素受體(ER)結(jié)合，啟動雌激素受體元件調(diào)控一系列基因的表達(dá)而發(fā)揮擬雌激素活性[4]。研究表明補骨脂素能促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分化，增加成骨細(xì)胞骨保護(hù)素(OPG)的表達(dá)，抑制核因子 kB 受體激活因子配體(RANKL)的表達(dá)而抑制破骨細(xì)胞的分化和成熟，從而抑制骨吸收發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松的作用[8]。

雌激素受體有ERα和ERβ兩種亞型，在骨組織內(nèi)主要是ERβ，大部分分布在胞漿中，少部分分布在細(xì)胞膜。雌激素受體與雌激素結(jié)合后，雌激素受體轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核內(nèi)調(diào)控一系列靶基因的表達(dá)。絕經(jīng)后婦女的體內(nèi)不僅雌激素水平大幅下降，而且組織細(xì)胞內(nèi)的ER也下降[9-10]。由于ER是一種基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，其表達(dá)水平的下降必然影響到受其調(diào)控的一系列基因的表達(dá)。因此，在補充體內(nèi)雌激素的同時，適當(dāng)提高體內(nèi)ER水平能更好地延緩絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的發(fā)展。本研究結(jié)果表明，大鼠去卵巢3個月后，其體內(nèi)血清E2水平和股骨ERβ水平顯著下降。給予戊酸雌二醇能顯著提升ERβ的表達(dá)水平。壯骨止痛膠囊不僅提高去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠體內(nèi)E2水平，而且促進(jìn)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠股骨內(nèi)ERβ的表達(dá)。補骨脂素高劑量(8 mg/kg)也具有同時升高骨質(zhì)疏松大鼠體內(nèi)E2和ERβ水平的作用。補骨脂素在低劑量(4 mg/kg)時對體內(nèi)E2和ERβ的調(diào)節(jié)作用沒有顯著影響。

IL-17主要由輔助性T17細(xì)胞(Th17)分泌，IL-17受體廣泛存在于人體各種組織與細(xì)胞中，包括軟骨細(xì)胞、骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞等。已有實驗證實雌激素缺乏可以上調(diào)IL-17，促進(jìn)RANKL的表達(dá)和骨的重吸收，且特異性拮抗IL-17或者IL-17受體缺失的小鼠在切除卵巢后不會發(fā)生骨質(zhì)疏松[11]。因此，IL-17作為Th17細(xì)胞與骨細(xì)胞之間的調(diào)節(jié)因子，可以作為抗骨質(zhì)疏松藥物的一個新的作用靶點。本實驗?zāi)Ｐ徒M大鼠血清IL-17非常顯著升高(P<0.01)，而且股骨的IL-17基因表達(dá)也顯著增強(P<0.01)，表明去卵巢造成體內(nèi)雌激素缺乏導(dǎo)致股骨內(nèi)的T17細(xì)胞的IL-17基因表達(dá)增強，從而提高骨微環(huán)境的IL-17水平，促進(jìn)破骨細(xì)胞的骨吸收。補充戊酸雌二醇則非常顯著抑制股骨內(nèi)的T17細(xì)胞的IL-17基因表達(dá)，降低血清IL-17水平。補骨脂素高劑量(8 mg/kg)和低劑量(4 mg/kg)均能抑制去卵巢大鼠股骨T17細(xì)胞的IL-17基因表達(dá)和血清IL-17水平。

TNF-α是目前發(fā)現(xiàn)的一種強有力的骨吸收誘導(dǎo)劑，在雌激素缺乏的小鼠中，T細(xì)胞分泌的TNF-α通過與骨髓單核細(xì)胞表面的TNF受體結(jié)合，加強RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞的形成[12]。雌激素缺乏時，激活和增殖T細(xì)胞，T細(xì)胞增多，TNF-α、等細(xì)胞因子分泌增多[13]，促進(jìn)破骨細(xì)胞的形成和活化，增強破骨細(xì)胞主導(dǎo)的骨吸收過程。本實驗中，去卵巢模型大鼠血清TNF-α水平及股骨TNF-α基因表達(dá)升高非常顯著(P<0.01)。給予戊酸雌二醇后，去卵巢模型大鼠血清TNF-α水平及股骨TNF-α基因表達(dá)下降非常顯著(P<0.01)，這進(jìn)一步證實雌激素缺乏后T細(xì)胞功能失衡在骨代謝失常中扮演了重要角色。補骨脂素高劑量(8 mg/kg)顯著降低去卵巢大鼠血清TNF-α水平(P<0.05)，同時股骨TNF-α基因表達(dá)也明顯下調(diào)(P<0.05)。

本實驗表明補骨脂素呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系提高去卵巢大鼠血清雌激素水平，同時對去卵巢大鼠TNF-α、IL-17的調(diào)節(jié)也呈現(xiàn)量效關(guān)系。補骨脂素在低劑量(4 mg/kg)對E2和ERβ的影響與模型組相比沒有統(tǒng)計學(xué)差異，但其仍然能夠抑制TNF-α、IL-17基因表達(dá)和降低血清TNF-α、IL-17水平。這種現(xiàn)象提示補骨脂素可能從兩個方面發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松作用：一方面補骨脂素通過調(diào)節(jié)體內(nèi)雌激素和雌激素受體水平對TNF-α、IL-17基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)，其中包括補骨脂素與雌激素受體結(jié)合；另一方面，補骨脂素可能通過其它非雌激素信號途徑調(diào)節(jié)TNF-α、IL-17基因表達(dá)。相關(guān)的具體作用細(xì)節(jié)需要借助有關(guān)轉(zhuǎn)基因?qū)嶒瀯游锖腕w外細(xì)胞實驗進(jìn)一步研究。