馬忠平 黃健 張志峰 楊云 葉楠

內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院關(guān)節(jié)外科，呼和浩特 010030

國內(nèi)外眾多研究報道，高血壓與成骨異常存在著密切的聯(lián)系[1]，高血壓患者的骨丟失明顯加重，而鈣從骨質(zhì)中流失也相應(yīng)加速，此外高血壓引起的繼發(fā)性骨質(zhì)疏松近年來成為科學(xué)研究的熱點問題[2-3]，為現(xiàn)代骨代謝研究提供了重要線索。貝尼地平(benidipine，BD)作為臨床上常用降血壓藥物，其作用機制主要是抑制血管平滑肌上的L型電壓依賴性鈣通道蛋白開放，以此阻斷鈣離子在血管平滑肌細胞中的聚集，從而舒張血管平滑肌并降低血壓[4]，但該藥物在骨代謝中的研究報道甚少。本研究旨在通過體外實驗觀察貝尼地平在骨代謝中的具體作用，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

取原代BMSCs所用的雌性4周大C57/BL6小鼠，體重10～15 g，購至內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗動物中心；主要實驗儀器與試劑：(1)主要儀器：倒置光學(xué)顯微鏡(Nikon，TE2000-U),(2)主要試劑：一抗Runx2(CST公司)，一抗OCN(CST公司)，一抗GAPDH(CST公司),一抗β-catenin(CST公司)，一抗LRP5(CST公司)，ALP染色試劑盒(碧云天生物試劑公司)，Caspase-8比色測定工具包(凱基生物公司)，貝尼地平(Sigma公司)，α-MEM(Hyclone公司)，胎牛血清(Gibco公司)。

1.2 BMSCs的提取與培養(yǎng)

小鼠寰樞椎脫臼處死后75%酒精浸泡消毒5分鐘，在超凈臺中用眼科剪和眼科鑷剝開小鼠皮膚，從髖臼關(guān)節(jié)處取下小鼠雙下肢，PBS清洗掉粘連毛發(fā)，剝離附屬肌肉等軟組織整理出股骨，浸泡于α-MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，用一套新的滅菌眼科剪和眼科鑷剪開股骨雙側(cè)骨端暴露骨髓腔，用1 ml注射器吸取10% FBS的完全培養(yǎng)基沖出骨髓，反復(fù)并兩端交換沖洗，待骨頭發(fā)白后將含有骨髓的完全培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至干凈的15 ml離心管，800 r/min低速離心5分鐘，骨髓重懸后轉(zhuǎn)移至10 cm 培養(yǎng)皿中5% 的CO2下37℃培養(yǎng)，培養(yǎng)基3天更換1次。

1.3 細胞實驗的分組與處理

取第3代生長良好的小鼠BMSCs按1×105個/孔密度接種于6孔板，待細胞融合率達到90%以上時，將細胞分為2組，對照組：成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)；貝尼地平處理組：成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基條件下分別以1、10和100 μmol/L貝尼地平培養(yǎng)。成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基各成分比例為100 nmol/L的地塞米松，50 μg/ml的維生素C磷酸酯，10 mM/L的β-甘油磷酸鈉。藥物連續(xù)處理14 天，3天更換1次培養(yǎng)基，37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)。

1.4 CCK8檢測貝尼地平對BMSCs的細胞毒性

第3代BMSCs種于96孔板中，細胞的種植密度為1×105個/孔，培養(yǎng)2天后對細胞進行加藥處理，加入貝尼地平濃度分別為0.1、1、10、100和1 000 μmol/L，加藥處理1天和14天，使用Caspase-8比色測定工具包(CCK8)進行藥物細胞毒性檢測。每孔加入10 μL的CCK8溶液和90 μL的α-MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，使用酶標儀測量各孔吸光度(optical density, OD)，CCK8溶液吸收波長為450 nm。

1.5 ALP染色實驗

第3代BMSCs種于6孔板中，細胞成骨誘導(dǎo)并加入貝尼地平(1～100 μmol/L)處理 14天后，對細胞行ALP染色。具體步驟為：洗去細胞培養(yǎng)基，使用無菌PBS輕柔沖洗2次，每孔加入2 ml的4%多聚甲醛室溫固定20分鐘；PBS沖洗3次，每次3分鐘，洗掉多余多聚甲醛；按照使用說明書配制ALP染液，現(xiàn)配現(xiàn)用，配好ALP染液避光保存；每孔細胞加入ALP染液1 ml避光37℃孵育半小時；PBS沖洗3遍，每遍3分鐘，終止染色。光鏡下拍照，Image-Pro Plus software(IPP，美國)軟件計數(shù)陽性細胞數(shù)。

1.6 Western blotting 檢測Runx2、OCN、GAPDH、β-catenin和LRP5的表達水平

對細胞成骨誘導(dǎo)并加入貝尼地平(1～100 μmol/L)處理14 天后，在冰上用蛋白裂解緩沖液裂解細胞，收集蛋白，樣品金屬浴96℃處理10分鐘，10 000 r/min高速離心1分鐘，取上清，-20℃長期儲存?zhèn)溆?。每條泳道上樣30 μg蛋白，用體積分數(shù)(V/V)為10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳60分鐘，將凝膠中蛋白電泳轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，脫脂奶粉常溫封閉1小時后分別加入一抗(1∶2000)冰箱4℃過夜孵育，室溫TBST溶液清洗3遍，每遍5分鐘，二抗(1∶3000)常溫孵育1小時，增強化學(xué)發(fā)光(ECL)發(fā)光試劑顯色攝像。條帶用Image J軟件分析，測定灰度值。目的條帶與對應(yīng)的GAPDH條帶灰度比值為統(tǒng)計結(jié)果。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗數(shù)據(jù)在SPSS 20.0統(tǒng)計軟件中運用單因素方差分析。首先行方差齊性檢驗，若結(jié)果方差齊，則組間多重比較采用LSD法；若結(jié)果方差不齊組間多重比較采用Dunnett’s T3法。P<0.05差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，定量數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±方差表示。

2 結(jié)果

2.1 BD對BMSCs的細胞毒性影響

加藥處理1天(圖1)和14天(圖2)后，對細胞行CCK8檢測，結(jié)果提示BD濃度在1～100 μmol/L時對細胞均不會出現(xiàn)毒性作用(P>0.05)，各實驗組(1～100 μmol/L)CCK8結(jié)果和對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，圖1、2，表1)。

圖1 各濃度貝尼地平處理BMSC 24小時后所得CCK8吸光度(OD)Fig.1 The optical density of CCK8 with different doses of benidipine for 24h (OD).

圖2 不同濃度貝尼地平處理BMSC 14天后所得CCK8吸光度(OD)Fig.2 The optical density of CCK8 with different doses of benidipine for 2 weeks (OD).

組別24小時CCK8吸光度14天CCK8吸光度ALP陽性細胞數(shù)Runx2灰度值OCN灰度值β-catenin灰度值LRP5灰度值對照組1.195500±0.1895421.193000±0.18862588.931830±13.8409301.054064±0.1719731.094875±0.0915891.014758±0.0531500.990622±0.0440071 μmol/L組1.233300±0.3393531.225200±0.309850120.267100±24.9013301.634447±0.1609291.667254±0.0822152.090139±0.1359571.611732±0.09187110 μmol/L組1.346800±0.1567971.351400±0.097437133.637300±20.9852302.116751±0.2348301.984705±0.1670003.444125±0.4555161.864968±0.096020100 μmol/L組1.268800±0.1979481.345200±0.156238174.438700±15.3431602.924276±0.1659722.586582±0.2274704.381943±0.4081262.474474±0.158240

2.2 BD對BMSCs的ALP表達影響

細胞處理14天后，行ALP染色，光鏡下拍照用IPP軟件計陽性細胞數(shù)。對照組：88.931830±13.840930，1 μmol/L組：120.267100±24.901330，10 μmol/L組：133.637300±20.985230，100 μmol/L組：174.438700±15.343160，各組組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖3，表1)，隨著BD濃度的增加，ALP陽性細胞數(shù)相應(yīng)明顯增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 BD對BMSCs的Runx2和OCN表達影響

細胞處理14天后行蛋白免疫印跡檢測Runx2表達量，對照組：1.054064±0.171973， 1 μmol/L組：1.634447±0.160929，10 μmol/L組：2.116751±0.234830，100 μmol/L組：2.924276±0.165972，各組組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖4，表1)，隨著BD濃度的增加，Runx2表達相應(yīng)明顯增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。同樣，對細胞行蛋白免疫印跡檢測OCN表達量，對照組：1.094875±0.091589， 1 μmol/L組：1.667254±0.082215，10 μmol/L組：1.984705±0.167000，100 μmol/L組：2.586582±0.227470，各組組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖4，表1)，隨著BD濃度的增加，OCN表達也相應(yīng)明顯增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖3 不同濃度貝尼地平處理下ALP染色結(jié)果(100×)Fig.3 The staining of ALP with different doses of benidipine (100×).

圖4 不同濃度貝尼地平處理下Runx2和OCN蛋白免疫印跡結(jié)果Fig.4 The Western blotting result of Runx2 and OCN with different doses of benidipine

2.4 BD對WNT/β-catenin信號通路影響

細胞處理14天后行蛋白免疫印跡檢測β-catenin表達量，對照組：1.014551±0.053150，1 μmol/L組：2.090139±0.135957，10 μmol/L組：3.444125±0.455516，100 μmol/L組：4.381943±0.408126，各組組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖5，表1)，隨著BD濃度的增加，β-catenin表達相應(yīng)明顯增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。同樣，對細胞行蛋白免疫印跡檢測LRP5表達量，對照組：0.990622±0.044007，1 μmol/L組：1.611732±0.091871，10 μmol/L組：1.864968±0.096020，100 μmol/L組：2.474474±0.158239，各組組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖5，表1)，隨著BD濃度的增加，LRP5表達也相應(yīng)明顯增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖5 不同濃度貝尼地平處理下β-catenin和LRP5蛋白免疫印跡結(jié)果Fig.5 The Western blotting result of β-catenin and LRP5 with different doses of benidipine.

3 討論

隨著我國人口老齡化程度加劇，人們心血管問題越發(fā)突出，高血壓病的發(fā)病率以及患者數(shù)呈逐年上漲趨勢，給社會、家庭和個人帶來沉重經(jīng)濟負擔[5-6]。此外，國外臨床證據(jù)提示體內(nèi)長期高血壓狀態(tài)和骨代謝異常存在著密切聯(lián)系[7]，這為我們提供了一個解決高血壓病和骨代謝異常疾病的良好思路，能否在降血壓藥物中找到一種良好的緩解骨質(zhì)疏松癥的藥物是本次研究的主要目的。貝尼地平作為L型鈣離子通道阻滯劑，通過調(diào)控細胞內(nèi)的鈣通道進而調(diào)節(jié)血管平滑肌的收縮，但貝尼地平在其他靶細胞的具體作用目前研究不多。骨髓間充質(zhì)干細胞作為成骨細胞的祖細胞，調(diào)控著體內(nèi)成骨發(fā)育的關(guān)鍵過程，但貝尼地平對骨髓間充質(zhì)干細胞的具體作用目前尚不清楚，明確貝尼地平對骨髓間充質(zhì)干細胞在成骨分化過程中的影響，對臨床上如何干預(yù)骨折愈合、抗骨丟失有重要意義。

本實驗采用體外誘導(dǎo)原代骨髓基質(zhì)干細胞誘導(dǎo)分化為成骨細胞技術(shù)來探討貝尼地平對成骨分化的影響，骨髓基質(zhì)干細胞作為骨代謝中重要的祖細胞，是成骨細胞、脂肪細胞等共同的來源細胞，地位重要[8]。本研究首先通過酶標儀法檢測貝尼地平對骨髓基質(zhì)干細胞的毒性作用，在實驗設(shè)置的貝尼地平濃度范圍內(nèi)(1～100 μmol/L)未發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細胞出現(xiàn)毒性反應(yīng)(P>0.05)，這為下一步的實驗研究提供了重要參考。此外，堿性磷酸酶作為成骨細胞的標志性蛋白，在成骨細胞鑒定、成骨功能實現(xiàn)等過程中作用巨大。在成骨誘導(dǎo)條件下加藥培養(yǎng)14天后的中期成骨階段，筆者發(fā)現(xiàn)在實驗組中各濃度(1～100 μmol/L)的堿性磷酸酶表達和對照組相比都是明顯增加的(P<0.05)，此外，在實驗組(1～100 μmol/L)的組內(nèi)比較中發(fā)現(xiàn)，隨著貝尼地平的濃度增大，堿性磷酸酶的表達和陽性細胞數(shù)呈濃度依賴性增加(P<0.05)，提示貝尼地平對成骨細胞中堿性磷酸酶的表達具有明顯促進作用。另外，為進一步探討貝尼地平對成骨分化的分子生物學(xué)影響，筆者對處理14天后的細胞行蛋白免疫印跡檢測，探究成骨分化過程中關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Runx2[9]和重要成骨調(diào)控蛋白OCN表達量，本研究發(fā)現(xiàn)貝尼地平通過促進成骨細胞中關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Runx2的表達進而促進成骨細胞分化進程，在各實驗組(1～100 μmol/L)中，OCN的表達均高于對照組(P<0.05)，并呈現(xiàn)濃度依賴性(P<0.05)，從成骨調(diào)控蛋白角度印證了貝尼地平對成骨分化的作用。另外，成骨過程中關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Runx2表達在貝尼地平的作用下明顯增加，在實驗組中(1～100 μmol/L)Runx2表達量明顯高于對照組(P<0.05)，隨著貝尼地平濃度增加，Runx2表達明顯增加的(P<0.05)，從核轉(zhuǎn)錄因子水平發(fā)現(xiàn)貝尼地平促進骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化。Wang BX等人[10]在成骨細胞株MC3T3-E1中發(fā)現(xiàn)貝尼地平促進ALP、Runx2和OCN表達。骨髓間充質(zhì)干細胞作為成骨細胞的上游細胞，其成骨能力改變對骨代謝的影響更為巨大，本研究則從干細胞層面發(fā)現(xiàn)貝尼地平對成骨作用的影響。

為進一步探討貝尼地平對骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化的信號通路機制，本研究對成骨誘導(dǎo)并加藥培養(yǎng)14天后的細胞行蛋白免疫印跡檢測，探究WNT/β-catenin信號通路的關(guān)鍵蛋白β-catenin和LRP5的表達水平。WNT/β-catenin信號通路是成骨細胞分化和成熟的關(guān)鍵通路[11]，前人實驗結(jié)果提示在β-catenin參與情況下，骨髓間充質(zhì)干細胞才具有向成骨細胞分化的能力[12]。在本實驗中，貝尼地平的加入能上調(diào)β-catenin表達，和對照相比，實驗組(1～100 μmol/L)的β-catenin表達量均明顯增加(P<0.05)，實驗組(1～100 μmol/L)內(nèi)β-catenin的表達隨貝尼地平增加而增加(P<0.05)；另外，作為WNT/β-catenin信號通路中重要的通路活性調(diào)控蛋白，LRP5表達隨著貝尼地平加入而明顯上調(diào)(P<0.05)，并呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性(P<0.05)。由以上結(jié)果我們不難看出，β-catenin和LRP5作為WNT/β-catenin信號通路內(nèi)關(guān)鍵正性調(diào)控蛋白，其表達量的上調(diào)提示W(wǎng)NT/β-catenin信號通路強度明顯增強，從信號通路方面闡述貝尼地平促進骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化的機制。

貝尼地平作為臨床上常用的心血管藥物，其降血壓特性已得到廣泛運用，國外已有部分研究報道貝尼地平對成骨細胞的促進作用[10, 13]。在此背景下，本研究以骨髓基質(zhì)干細胞為研究切入點，從成骨細胞的祖細胞水平在體外環(huán)境下探討貝尼地平對骨代謝的具體作用，并闡述了本過程的信號通路機制，為臨床上貝尼地平的全新運用提供實驗依據(jù)。