董維 郭楊* 馬勇， 趙丹 王培民

1. 南京中醫(yī)藥大學骨傷研究所，骨傷修復與重建新技術實驗室，南京 210023 2. 南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院骨傷科，南京 210029

近年來，隨著激素在臨床中的廣泛應用，使得激素性股骨頭缺血性壞死發(fā)病率逐年上升。盡管有各種各樣的理論，包括血液脂代謝紊亂學說、激素直接感應學說、高粘滯狀態(tài)學說、血管內凝血學說，然而其發(fā)病機制尚不明確[1]。由于早期診斷率較低且缺乏有效的治療方法，許多患者最終不得不進行人工關節(jié)置換[2]，故早期診斷和治療非常關鍵。因此，本實驗旨在建立一個能夠模擬人類早期激素性股骨頭壞死的動物模型，為進一步研究該病的發(fā)病機制和治療方法提供幫助。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

30只雄性新西蘭大白兔，體重2.5～4.0 kg，由南京中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供。所有動物在南京中醫(yī)藥大學動物實驗中心飼養(yǎng)，每日給予定量兔飼料和清潔飲用水。

1.2 材料

大腸桿菌內毒素(Sigma公司，美國)；注射用甲潑尼龍琥珀酸鈉(甲強龍)(輝瑞制藥公司，美國)；MRI(西門子Magnetom Trio Tim 3.0T，德國)；光學顯微鏡(Olympus 公司，日本)。

1.3 實驗方法

適應性喂養(yǎng)1周后，30只新西蘭大白兔隨機分為實驗組(20只)和對照組(10只)。實驗組經(jīng)耳緣靜脈注射10 μg/kg的脂多糖，24小時后右側臀部肌注甲強龍20 mg/kg，連續(xù)注射3天，每次間隔24小時。對照組注射同等劑量的生理鹽水，不注射脂多糖和甲強龍。所有動物均肌注青霉素預防感染。

1.4 觀察指標

6周后處死動物，解剖右側股骨攝X 線片、MRI觀察股骨頭形態(tài)、骨質密度、骨小梁變化、壞死信號等影像學變化情況。然后將上述股骨頭標本以4%多聚甲醛固定2天，甲酸10 ml加入10%福爾馬林90 ml制成甲酸脫鈣液對標本進行脫鈣，5天后石蠟包埋標本股骨頭，切片后常規(guī)HE染色，光學顯微鏡觀察股骨頭、骨小梁、骨細胞、髓腔及脂肪細胞形態(tài)、結構和數(shù)量的變化。

2 結果

兩組皆未出現(xiàn)白兔死亡，對照組無白兔出現(xiàn)股骨頭壞死，實驗組白兔共計15只出現(xiàn)股骨頭壞死，發(fā)生率為75%。

2.1 影像學觀察

2.1.1X 線：對照組雙側股骨頭骨皮質完整，大小及形態(tài)正常，骨密度均勻，骨小梁清晰(圖1)；模型組股骨頭骨質疏松，頭內密度不均，可見大小不一的囊狀透亮區(qū)，部分骨小梁模糊不清，但股骨頭保持完整(圖2)。

2.1.2MRI：T2-tse-tra序列：股骨頭見一類圓形高信號影，邊界相對清晰；T2-tse-cor序列：股骨頭見一類圓形稍高信號影，關節(jié)面清晰完整(圖3、4)。

2.2 病理學觀察

對照組股骨頭軟骨層較厚，骨小梁致密，排列規(guī)則，陷窩內有數(shù)量很多的骨細胞；髓腔增生活躍，造血細胞豐富，脂肪細胞體積及數(shù)量正常。實驗組股骨頭軟骨層較薄，骨小梁纖細，部分骨小梁斷裂，陷窩內骨細胞數(shù)量明顯減少，空骨陷窩數(shù)量明顯增多；髓腔增生減低，骨髓出現(xiàn)了明顯的壞死、溶解現(xiàn)象，造血細胞明顯減少，充滿大量肥大的脂肪細胞，有的融合成泡狀(圖5、6)。

圖1 對照組雙側股骨頭骨皮質完整，大小及形態(tài)正常，骨密度均勻，骨小梁清晰Fig.1 The X-ray of the femoral head in control group shows that the cortical bone is complete, the size and shape are normal, the density is even, and the trabecular bone is clear in the bilateral femoral heads.

圖2 實驗組X線示股骨頭密度減低，骨小梁模糊不清，可見一囊狀透亮區(qū)，股骨頭保持完整Fig.2 The X-ray of the femoral head in model group shows that the reduced bone mineral density, blurred trabecular bone with cystic zone, and intact femoral head.

圖3 實驗組MRIT2-tse-tra序列：股骨頭見一類圓形高信號影，邊界相對清晰Fig.3 MRI T2-tse-tra sequence of the model group shows a circular high signal in the femoral head with a relatively clear boundary.

圖4 實驗組MRI T2-tse-cor序列：股骨股骨頭見一類圓形稍高信號影，關節(jié)面清晰完整Fig.4 MRI T2-tse-cor sequence of the model group shows a round slightly high signal in the femoral head and clear and complete joint surface.

圖5 對照組HE示軟骨細胞排列整齊，骨小梁完整,排列規(guī)則，骨小梁中的骨細胞清晰可見，空骨陷窩少見，骨髓中造血細胞豐富，脂肪細胞大小一致，形態(tài)正常Fig.5 In control group HE staining shows that the cartilage cells arranges neatly, trabecular bone is intact and regularly arranged, trabecular bone cells are visible, empty bone lacunae are rare, hematopoietic cells in bone marrow are rich, and the size and morphology of adipocytes are normal.

圖6 實驗組HE示骨小梁纖細，部分骨小梁斷裂，髓腔內造血細胞減少，脂肪細胞體積增大，有的融合成泡狀 Fig.6 In the model group HE staining shows that the trabecular bone is thin and broken in some part, the hematopoietic cells in the medullary cavity are reduced, and the volume of adipocytes increases and some fuse into a bubble.

3 討論

激素性股骨頭壞死多發(fā)生于20～50歲之間[3]，其發(fā)病機制尚不完全清楚，早期診斷較困難，晚期往往造成嚴重的后果。在股骨頭壞死發(fā)病機制的研究過程中，建立與股骨頭壞死病程相似的動物模型非常重要，現(xiàn)行建立模型的方法主要有血清加激素模型[3]、單純激素模型[4]、無水乙醇模型骨內注射模型[5]以及液氮冷凍模型[6]等，給藥途徑與給藥劑量都不盡相同。

有國外學者單純應用激素誘導股骨頭壞死模型，結果很難產(chǎn)生典型的股骨頭壞死變化[7]。血清加激素模型因所用血清多為異種血清，容易致使實驗動物休克死亡。股骨頭鉆孔注入無水乙醇以及液氮的造模方法需要在透視機下進行穿刺，定位要求較高，對實驗人員傷害較大且對實驗操作技術要求較高。

仔細研究不難發(fā)現(xiàn)這些疾病具有共同特點是：均可造成機體血管內皮的損傷從而使機體處于高凝狀態(tài)[8]。由此可見在造模過程應用激素之前，適當加用一些藥物使實驗動物處于高凝狀態(tài)后再應用激素，這樣建立的股骨頭壞死動物模型就更接近臨床，更有利于臨床治療及預防的研究。

內毒素是革蘭氏陰性桿菌細胞壁的組成成分之一，它可以引發(fā)一系列病理變化如：局部炎性反應、脂代謝異常以及機體凝血-纖溶系統(tǒng)的功能紊亂而造成機體高凝狀態(tài)等[9-11]，這些病理變化與臨床上使用激素治療的基礎病的病理過程相近。所以內毒素加激素來誘導股骨頭壞死更加接近人類激素性股骨頭壞死的特點。

實驗結果表明，模型組X線片示股骨頭密度減低，骨小梁模糊不清，可見一囊狀透亮區(qū)，但股骨頭保持完整無塌陷，按Ficat分期屬于早期壞死模型(Ⅰ～Ⅱ期)；MRI對股骨頭壞死早期診斷有較高的敏感性，能早期準確描述骨壞死的形態(tài)、部位及炎性反應過程，本實驗模型組MRI示在T2-tse-tra序列股骨頭可見一類圓形高信號影，邊界相對清晰，T2-tse-cor序列股骨頭可見一類圓形稍高信號影，關節(jié)面清晰完整，與同期組織學檢查結果相一致，從而印證其在股骨頭壞死早期診斷的高度靈敏和特異性。組織學切片觀察則是一種最常規(guī)觀察病理改變的檢測手段之一，實驗中發(fā)現(xiàn)模型組骨陷窩中骨細胞明顯減少，而伴有不同程度的脂肪細胞肥大、增生，可能與激素促使骨細胞向脂肪細胞轉化有關。股骨頭髓腔內脂肪細胞肥大、增生，使得正常的紅骨髓受壓并逐漸被脂肪取代，加上股骨頭髓腔為一半封閉的腔隙，肥大增生的脂肪細胞引起骨髓腔內壓力增高，骨內壓升高使髓內血管受壓變細，靜脈瘀滯， 微循環(huán)障礙造成缺氧又促使髓內組織滲出，腫脹，進一步加重髓內高壓而形成惡性循環(huán)[4]。組織學檢查發(fā)現(xiàn)模型組骨髓腔內大量的脂肪細胞填塞，部分融合為泡狀，其可能是股骨頭早期壞死的直接原因。

綜上所述，甲強龍聯(lián)合脂多糖能夠誘導兔早期股骨頭缺血性壞死模型，且方法簡單、快速，成功率高，更加接近人早期股骨頭缺血壞死，值得在股骨頭壞死的動物實驗中推廣應用。