蔣　雪，章　堯，王李卓，王　云，夏禮斌，陳月平，王　瑩，高家林

(1.皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院　呼吸內(nèi)科,安徽　蕪湖　241001；2.皖南醫(yī)學(xué)院　活性生物大分子安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,安徽　蕪湖　241002；3.皖南醫(yī)學(xué)院　生物化學(xué)教研室,安徽　蕪湖　241002 ;4.皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院　內(nèi)分泌科,安徽　蕪湖　241001)

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·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

Sidt2 基因剔除小鼠的肺部形態(tài)學(xué)改變

蔣雪1，2，章堯2，3，王李卓2，3，王云1，夏禮斌4，陳月平4，王瑩1，高家林4

(1.皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院呼吸內(nèi)科,安徽蕪湖241001；2.皖南醫(yī)學(xué)院活性生物大分子安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,安徽蕪湖241002；3.皖南醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室,安徽蕪湖241002 ;4.皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院內(nèi)分泌科,安徽蕪湖241001)

【摘要】目的：觀察Sidt2基因剔除小鼠的肺組織超微結(jié)構(gòu)，探討Sidt2基因在肺臟形態(tài)發(fā)育過程中的作用。方法：將利用基因打靶及同源重組技術(shù)獲得的Sidt2基因全身剔除小鼠和野生型B129品系小鼠合籠交配，鼠尾提取DNA進(jìn)行基因型鑒定，挑選出子代Sidt2-/+小鼠，同籠交配，再挑選出子代Sidt2-/-小鼠為實(shí)驗(yàn)組，以同窩野生型小鼠為對(duì)照，進(jìn)行DNA、RNA和Western鑒定，并行肺組織光鏡和電鏡形態(tài)學(xué)觀察。結(jié)果：通過DNA、RNA、蛋白質(zhì)水平驗(yàn)證模型構(gòu)造成功。光鏡下對(duì)照鼠肺泡壁光滑,僅有少量粒細(xì)胞浸潤；模型鼠肺泡間質(zhì)內(nèi)毛細(xì)血管擴(kuò)張、充血，多處炎癥細(xì)胞呈灶狀分布。電鏡下對(duì)照鼠的肺組織形態(tài)較規(guī)則；模型鼠可見肺泡上皮細(xì)胞崩解，毛細(xì)血管充血及基底膜增厚。結(jié)論：Sidt2基因剔除可影響小鼠肺組織形態(tài)，表現(xiàn)為細(xì)胞壞死，毛細(xì)血管充血及基底膜增厚，大量炎癥細(xì)胞浸潤，造成肺損傷。

【關(guān)鍵詞】溶酶體膜蛋白；Sidt2；肺部形態(tài)；炎癥；肺損傷

【DOI】10.3969/j.issn.1002-0217.2016.04.001

溶酶體(lysosome)是負(fù)責(zé)細(xì)胞內(nèi)蛋白降解的主要細(xì)胞器[1],參與營養(yǎng)物質(zhì)和一些無機(jī)電解質(zhì)輸入細(xì)胞,代謝產(chǎn)物排出細(xì)胞以及細(xì)胞膜內(nèi)外信號(hào)的傳遞等作用。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的溶酶體膜蛋白有50余種。溶酶體膜蛋白廣義上可包括溶酶體相關(guān)膜蛋白(lysosome-associated membrane proteins，LAMP)和溶酶體全膜蛋白(lysosome-integral membrane proteins)。最新的蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，Sidt2是新型的溶酶體候選蛋白，832個(gè)氨基酸，分子量為94.5 kU，是Sidt1橫跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的候選成員[2]。Sidt2是高度糖基化的溶酶體膜蛋白，生物信息學(xué)研究表明，Sidt2是多通道跨膜結(jié)構(gòu)，10個(gè)N型糖基化位點(diǎn)和兩個(gè)依賴絡(luò)氨酸的溶酶體胞質(zhì)靶點(diǎn)，此蛋白具有溶酶體膜蛋白的多種特性：①單個(gè)或多種跨膜結(jié)構(gòu);②溶酶體細(xì)胞器分選信號(hào);③適度的糖基化修飾;④一定的疏水特性[3]。符合作為溶酶體全膜蛋白的分子特征。Sidt2蛋白具有組織表達(dá)特異性，在細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)層面，Sidt2只表達(dá)于周圍神經(jīng)系統(tǒng)和溶酶體，并且在溶酶體中高表達(dá)[4]。根據(jù)推斷，Sidt2可能與維持溶酶體膜的完整性和轉(zhuǎn)運(yùn)降解產(chǎn)物有關(guān)。目前已發(fā)現(xiàn)，溶酶體與矽肺[5]、腫瘤有關(guān)[6],據(jù)研究報(bào)道LAMP1/2作為溶酶體的全膜蛋白,不僅參與膜的組成,還參與細(xì)胞自噬/凋亡途徑的調(diào)控[7]。溶酶體酸性脂肪酶基因敲除(LAL-/-)的老鼠出現(xiàn)巨噬細(xì)胞和肺泡Ⅱ型細(xì)胞內(nèi)中性脂質(zhì)的累積，影響肺泡內(nèi)穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致肺泡內(nèi)大量炎癥細(xì)胞浸潤和肺組織結(jié)構(gòu)的重塑[8]。本實(shí)驗(yàn)中，Sidt2基因剔除小鼠的肺臟有多處肺泡上皮細(xì)胞的壞死和大量炎癥細(xì)胞的浸潤。那么，Sidt2作為溶酶體膜蛋白在肺臟中起什么作用？是否參與肺臟的正常形態(tài)和生理功能的維持？本文就Sidt2基因剔除對(duì)小鼠肺臟的形態(tài)學(xué)影響進(jìn)行探討。

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室溫度22～25 ℃，濕度50%～60%，基礎(chǔ)飼養(yǎng)狀態(tài)下不限食水,鼠齡6～8周。野生型B129小鼠購自上海必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處置方法符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2小鼠繁育已經(jīng)通過基因打靶及同源重組技術(shù)獲得了Sidt2基因全身剔除模型(Sidt2-/-)小鼠，將Sidt2-/-雄鼠與B129品系的野生型同種雌鼠 1∶3合籠交配，子代小鼠基因型鑒定，8周齡時(shí)獲得Sidt2-/+小鼠，按雌雄比3∶1同籠交配，子代小鼠基因型鑒定，挑選出體質(zhì)量(21±1)g，8周齡Sidt2-/-小鼠為實(shí)驗(yàn)組，以同窩野生型小鼠為對(duì)照組。

1.3基因型鑒定(包括DNA、RNA和蛋白水平鑒定)①鼠尾中抽提DNA進(jìn)行基因型鑒定，嚴(yán)格按照試劑盒要求操作。②取小鼠肺臟進(jìn)行RNA水平驗(yàn)證小鼠基因型。引物序列：上游引物，5′-ATGTGGTGGTGGTAGTGAAG-3′；下游引物，5′-AGATACACCACCACCATCAC-3′。引物由上海生工生物技術(shù)工程有限公司合成。 ③取小鼠肺臟提取蛋白進(jìn)行Western試驗(yàn)從蛋白質(zhì)水平驗(yàn)證小鼠基因型。

1.4HE染色和光鏡觀察取材和固定：麻醉動(dòng)物，迅速打開胸腔將整個(gè)肺臟取出。隨機(jī)將一側(cè)肺組織投入 4%甲醛固定液固定，4 ℃保存；將另一側(cè)肺組織固定于2.5%戊二醛磷酸緩沖液，4 ℃保存。將固定后的組織脫水透明、浸蠟包埋、切片粘片、脫蠟染色、分化漂洗、脫水復(fù)染、脫水透明，最后封藏于倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)下進(jìn)行觀察。

1.5透射電鏡分析取出固定于2.5%戊二醛磷酸緩沖液的肺組織,修成體積不超過1 mm×1 mm×1 mm后進(jìn)行前固定、漂洗，后固定、漂洗、脫水、置換、浸透、包埋、切片后染色，在PHILIP(CM-120)透射電鏡下觀察。

2結(jié)果

2.1Sidt2基因剔除小鼠DNA水平基因型鑒定由圖1可見，1號(hào)的第一、二條帶DNA大小分別為200 bp、280 bp，為雜合子；2號(hào)的第一條沒有條帶，第二條條帶DNA大小為280 bp，為野生型；3號(hào)的第一條條帶DNA大小為200 bp，第二條沒有條帶，為純合子。

1號(hào)為雜合子；2號(hào)為野生型；3號(hào)為純合子。

圖1Sidt2基因剔除小鼠DNA水平的基因型鑒定

2.2Sidt2基因剔除小鼠RNA水平基因型鑒定由圖2可見，GAPDH條帶大小為150 bp，1號(hào)為野生型，目的條帶大小為750 bp；2號(hào)為純合子，沒有條帶；3號(hào)為雜合子，目的條帶大小為750 bp,1號(hào)野生型目的條帶濃度為3號(hào)雜合子的近兩倍。

1號(hào)為野生型；2號(hào)為純合子；3號(hào)為雜合子。

圖2Sidt2基因剔除小鼠的RNA水平基因型鑒定圖

2.3Western鑒定結(jié)果 各組小鼠肺組織Sidt2蛋白含量檢出率分別為：野生型(1.81±0.57)、雜合子(0.64±0.15)、純合子(0.21±0.02)，采用單因素方差分析(F=41.4，P<0.01)， 3組間兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

蛋白質(zhì)水平鑒定結(jié)果：1號(hào)條帶為野生型；2號(hào)條帶為純合子；3號(hào)條帶為雜合子。由圖3可見野生型Sidt2蛋白濃度大于雜合子，純合子幾乎沒有蛋白濃度。Sidt2蛋白大小為120～130 kU。Sidt2蛋白的預(yù)測(cè)大小是94.5 kU，但是通過Western blot檢測(cè)小鼠的各個(gè)組織，Sidt2的分子量大小在120～130 kU,因?yàn)樵S多溶酶體膜蛋白，包括多重跨膜蛋白都是糖基化蛋白，這些蛋白檢測(cè)出的分子量都不是統(tǒng)一的，并且大于它們?cè)镜姆肿有蛄辛俊?/p>

野生型小鼠的Sidt2蛋白含量最高，純合子含量最少，但也有少量的表達(dá)， 3組間表達(dá)有差異。

*表示與野生型比較P<0.05；#表示與雜合子比較P<0.05。

圖3Sidt2基因剔除小鼠蛋白質(zhì)水平基因型鑒定圖

2.4小鼠一般情況對(duì)照組小鼠毛發(fā)有光澤，無呼吸頻率加快，進(jìn)食正常，對(duì)刺激反應(yīng)能力無下降。模型組小鼠毛發(fā)直立無光澤，呼吸頻率加快，進(jìn)食差，對(duì)刺激的反應(yīng)能力下降，活動(dòng)少。存活的模型小鼠在生長發(fā)育期病死率較野生型明顯增高。在生長期，模型鼠的生長發(fā)育落后于野生小鼠(圖4)。

A：模型鼠，B：對(duì)照鼠。

圖4野生型小鼠與Sidt2基因剔除小鼠的對(duì)照?qǐng)D

2.5Sidt2剔除小鼠肺組織光鏡下表現(xiàn)正常對(duì)照組小鼠肺組織 HE 染色光鏡下可見肺結(jié)構(gòu)完整，各處肺泡間隔厚度正常均一，肺泡壁光滑,肺泡腔內(nèi)無痰栓，肺間質(zhì)內(nèi)僅有少量粒細(xì)胞浸潤。模型組可見肺內(nèi)過度、失控的炎癥反應(yīng),肺泡間隔內(nèi)毛細(xì)血管擴(kuò)張、充血,支氣管腔內(nèi)可見痰栓，見圖5。

A(×40)、B(×400)為正常對(duì)照組小鼠肺組織 HE 染色光鏡下肺組織結(jié)構(gòu)，肺泡壁光滑，無炎癥浸潤。C(×40)、D(×400)為模型組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)，可見大量炎癥細(xì)胞浸潤，支氣管腔內(nèi)可見痰栓。

圖5Sidt2基因剔除小鼠與對(duì)照組小鼠肺組織光鏡圖

2.6Sidt2剔除小鼠模型肺臟超微結(jié)構(gòu)改變利用透射電鏡技術(shù)，進(jìn)一步在超微結(jié)構(gòu)水平對(duì)Sidt2剔除小鼠肺臟組織進(jìn)行觀察，電鏡下正常對(duì)照小鼠的肺泡上皮細(xì)胞可見形態(tài)較規(guī)則，呈立方形或圓形，表面有很多長短不一的微絨毛。模型鼠：可見肺泡上皮細(xì)胞相對(duì)不規(guī)則，線粒體腫脹，胞質(zhì)內(nèi)大量空泡，細(xì)胞表面微絨毛減少,并發(fā)現(xiàn)細(xì)胞崩解。肺間質(zhì)可見毛細(xì)血管充血，肺泡間隔增寬,纖維組織增生，基底膜增厚，見圖6。

A、B示正常對(duì)照小鼠的肺組織細(xì)胞形態(tài)較規(guī)則。C、D示模型鼠：C可見肺泡上皮細(xì)胞崩解(黑、白箭頭所指)；D可見毛細(xì)血管充血(黑色箭頭所指)，肺泡間隔增寬,間質(zhì)膠原沉積，基底膜增厚(白色箭頭所指)。

圖6透視電鏡下兩組小鼠肺組織模型超微結(jié)構(gòu)

3討論

研究發(fā)現(xiàn)，溶酶體酸性脂肪酶(LAL)基因敲除(LAL-/-)的小鼠出現(xiàn)肺泡Ⅱ型細(xì)胞和巨噬細(xì)胞內(nèi)中性脂質(zhì)的累積，破壞肺泡表面活性物質(zhì)的構(gòu)成，導(dǎo)致肺泡內(nèi)大量的炎癥和肺組織結(jié)構(gòu)的重塑[8]。同時(shí)溶酶體膜蛋白和自噬又有著千絲萬縷的聯(lián)系，例如:在小鼠體內(nèi)溶酶體膜蛋白LAMP1和LAMP2[9]的缺失,可導(dǎo)致自噬現(xiàn)象的增加。另LAPTM4B等蛋白則可對(duì)自噬產(chǎn)生直接的抑制作用。自噬被認(rèn)為在炎癥反應(yīng)中起著關(guān)鍵調(diào)控作用，自噬缺陷(Atg4b-null)型敗血癥老鼠相較野生型敗血癥老鼠的肺部炎癥反應(yīng)增強(qiáng)，表現(xiàn)為炎癥因子白介素6(IL-6)、白介素12p40(IL-12p40)等的上升[10]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Sidt2基因的缺失引起肺組織的炎癥浸潤和肺泡上皮細(xì)胞的壞死而造成肺損傷。

Sidt2作為一個(gè)新的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白/通道蛋白，起到物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的作用，其轉(zhuǎn)運(yùn)對(duì)象可能是一些氨基酸或是一些其他小分子物質(zhì)。Sidt2的作用可能包括以下方面：①保護(hù)溶酶體膜不被降解,維持溶酶體膜的完整性;②作為膜上的蛋白或跨膜受體起到物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)作用;③可能介導(dǎo)內(nèi)吞噬和自噬;④參與細(xì)胞內(nèi)凋亡信號(hào)的調(diào)控。那么，Sidt2作為溶酶體膜蛋白在溶酶體和肺損傷的關(guān)聯(lián)中起到什么樣的作用呢？是影響肺泡內(nèi)穩(wěn)態(tài)還是抑制自噬而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的失控呢？為進(jìn)一步弄清Sidt2所起的作用,我們將在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中以腫瘤細(xì)胞株為研究對(duì)象,分別利用過表達(dá)和干擾的生物技術(shù)研究方式探討Sidt2在肺上皮細(xì)胞生長過程中的影響,在肺損傷機(jī)制中扮演的角色及其對(duì)細(xì)胞基本生物機(jī)制的作用。

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文章編號(hào)：1002-0217(2016)04-0307-04

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81200632；81471002)；安徽省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(1308085QH134)；弋磯山醫(yī)院引進(jìn)人才基金項(xiàng)目(2011014)

收稿日期：2016-01-02

作者簡(jiǎn)介：蔣雪(1989-)，女，2013級(jí)碩士研究生，(電話)18356565009，(電子信箱)3186411346@qq.com；

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】【中圖號(hào)】Q 786;R 563A

Lung morphology change in Sidt2 knockout mice

JIANG Xue,ZHANG Yao,WANG Lizhuo,WANG Yun,XIA Libing,CHEN Yueping,WANG Yin,GAO Jialing

Department of Respiratory Medicine,The First Affiliated Hospital of Wannan Medical College,Wuhu 241001,China

【Abstract】Objective：To investigate the role of Sidt2 gene in the lung morphogenesis through examining the lung tissue ultrastructure in Sidt2 knockout mice.Methods： Sidt2(-/-) mice generated by gene targeting and homologous recombination technology were mated with wild-type B129 mice,the genotype was identified by DNA extracted from rat tail.The offspring with the genotype Sidt2(-/+) were crossed each other,the Sidt2(-/-) mice in the F3 generation were selected as experimental group,wild-type littermates as control mice.Lung tissue morphology was observed by light microscopy and electron microscopy after confirming genotype with DNA,RNA and Western blotting.Results:Animal models were successfully established through verification by DNA,RNA and protein levels.Light microscopy indicated smooth alveolar wall of control mice,with a small amount of granulocyte infiltration.Dilated blood capillary,hyperemia,and focally distributed inflammatory cells were observed in alveolar interstitial of model mice.Lung morphology in control mice viewed by electron microscopy,while alveolar epithelial cells disruption,capillary hyperemia and basement membrane thickening were shown in experimental mice.Conclusion:Sidt2 knockout can affect the lung morphology,characterized by cell apoptosis,capillary hyperemia and basement membrane thickening as well as a large number of inflammatory cells infiltration,thus leading to lung damage.

【Key words】lysosome membrane proteins;Sidt2；lung morphology；inflammation；lung injury

王瑩，女，主任醫(yī)師，(電子信箱)w19y29h@163.com，通信作者；

高家林，男，副主任醫(yī)師，(電子信箱)jialing.gao@yahoo.com，通信作者.