陳大偉劉燕青張朝

嗅鞘細(xì)胞聯(lián)合神經(jīng)干細(xì)胞對大鼠急性脊髓損傷及腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)的影響*

陳大偉①劉燕青①張朝①

【摘要】目的：探討嗅鞘細(xì)胞（OECs）聯(lián)合神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）對大鼠急性脊髓損傷及腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（Brain Derived Neurotrophic Factor，BDNF）表達(dá)的影響。方法：取新生3 d SD大鼠的海馬和嗅球制備神經(jīng)干細(xì)胞和嗅鞘細(xì)胞，對80只SD大鼠做急性脊髓損傷造模，隨機(jī)分為對照組（假手術(shù)組）、NSCs移植組、OECs移植組、NSCs+OECs聯(lián)合移植組（記為實(shí)驗(yàn)A、B、C組），細(xì)胞移植。于術(shù)前，術(shù)后1、3、7、14、21 d行BBB評分、斜板實(shí)驗(yàn)和運(yùn)動誘發(fā)電位（MEP N1波）潛伏期檢測，在各組隨機(jī)抽一只SD大鼠做免疫組化，觀察比較受損脊髓中BDNF的表達(dá)情況。結(jié)果：（1）BBB評分變化：除第1天外，各實(shí)驗(yàn)組恢復(fù)程度均明顯大于對照組（P＜0.05），第7天開始各實(shí)驗(yàn)組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（2）斜板試驗(yàn)角度變化：第1周開始，四組中任意兩組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（3）MEP（N1波）潛伏期變化：自第3天，四組中任意兩組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（4）BDNF染色陽性細(xì)胞數(shù)變化：細(xì)胞移植后，各組大鼠受損脊髓中BDNF開始升高，第3天到高峰后減少。術(shù)后第3天開始，四組中任意兩組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：采用細(xì)胞移植治療大鼠急性脊髓損傷，OECs與NSCs聯(lián)合移植治療效果最佳；單細(xì)胞移植時，OECs比NSCs移植治療效果更強(qiáng)。聯(lián)合移植組中BDNF表達(dá)最高。

【關(guān)鍵詞】嗅鞘細(xì)胞； 神經(jīng)干細(xì)胞； 急性脊髓損傷； 腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子

First-author’s address：The First Affiliated Hospital of Baotou Medical College，Baotou 014010，China

脊髓損傷（Spinal Cord Injury，SCI）是臨床上中樞神經(jīng)系統(tǒng)一種嚴(yán)重的創(chuàng)傷性疾病。該病有發(fā)病率高，致殘率高，治療費(fèi)用高等特點(diǎn)，一直被醫(yī)學(xué)界高度關(guān)注。僅北京地區(qū)脊髓損傷發(fā)病率就從上世紀(jì)80年代末6.8/百萬人增至2002年的60/百萬人，十多年間發(fā)病率增長近10倍［1］。

急性脊髓損傷動物實(shí)驗(yàn)中新方法和臨床中治療措施是層出不窮，細(xì)胞移植是一非常有前途的修復(fù)策略。本實(shí)驗(yàn)對大鼠急性損傷脊髓局部注入神經(jīng)干細(xì)胞，嗅鞘細(xì)胞，神經(jīng)干細(xì)胞+嗅鞘細(xì)胞，通過BBB評分、斜板實(shí)驗(yàn)、運(yùn)動誘發(fā)電位（MEP）及免疫組化檢測BDNF表達(dá)情況，來評判各組受損脊髓恢復(fù)情況，比較兩種細(xì)胞各自、聯(lián)合對急性脊髓損傷修復(fù)的能力，以期可作為臨床治療的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 SD大鼠88只，成年SD大鼠85只（80只實(shí)驗(yàn)，5只備用）；另3只（出生3 d）SD大鼠為神經(jīng)干細(xì)胞和嗅鞘細(xì)胞取材。隨機(jī)分組（每組20只）：對照組（假手術(shù)組）、NSCs移植組、OECs移植組、NSCs+OECs聯(lián)合移植組（分別記為實(shí)驗(yàn)A、B、C組）。

1.2 試劑與儀器 兔抗鼠巢蛋白（Nestin）單抗、兔抗鼠P75單抗、異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記羊抗兔二抗、兔抗大鼠BDNF多克隆抗體、免疫組化SABC試劑盒、生物素標(biāo)記羊抗兔IgG二抗等試劑、IX71型倒置熒光顯微鏡、Thermo3110型5%CO2培養(yǎng)箱、TGL-16B型普通臺式離心機(jī)等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 新生SD大鼠海馬和嗅球的取材 將（出生3 d）SD大鼠消毒后，引頸脫位法處死，無菌操作顯露兩大腦半球、嗅球和小腦。完全剝離海馬，分離嗅球保持兩側(cè)嗅鞘完整。去除表面毛細(xì)血管等軟組織，4 ℃下分別清洗后備用。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定

1.3.2.1 嗅鞘細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定 將嗅球入DMEM/ F12培養(yǎng)液，剪碎吹打分離，細(xì)胞篩網(wǎng)過濾后離心沉淀，沉淀入DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)液（按比例配入bFGF、EGF和B27），至培養(yǎng)箱（37 ℃、5%CO2）。每3天全換一次培養(yǎng)液，16 d傳代1次。第二代細(xì)胞懸液入凹玻片，培養(yǎng)、棄液，PBS漂洗，固定，依步驟進(jìn)行至滴兔抗鼠P75一抗（1∶200），PBS漂洗3次，滴羊抗兔二抗（1∶400），孵育封片。倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.3.2.2 神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定 將海馬同法制備，每2～4天換半量培養(yǎng)液，傳代1次約6～8 d。鑒定同樣，兔抗鼠Nestin為一抗（1∶100），羊抗兔二抗（1∶200）。封片觀察。

1.3.3 大鼠急性脊髓損傷Allen’s模型的制備及局部注射細(xì)胞移植 將大鼠麻醉見效，俯臥固定，術(shù)區(qū)備皮消毒，脊正中切口（約3 cm），顯露T10～12棘突及椎板。定位切除T12棘突及椎板上半部分，T11全椎板和棘突，T10棘突及椎板下半部分［2］，顯露T11相應(yīng)脊髓節(jié)段的硬脊膜，定為損傷區(qū)。自制改良Allen’s撞擊器重物15 g高度6 cm自由落下，瞬間下落能量對T11段脊髓致傷即制為大鼠急性脊髓損傷實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停?］，打擊后重物停3 min，硬脊膜靜脈充血增粗，局部紫紅色，鼠尾痙攣擺動，后肢回縮抽動，即打擊有效。造模后即行細(xì)胞移植（生理鹽水植入對照組、NSCs植入實(shí)驗(yàn)A組、OECs植入實(shí)驗(yàn)B組、NSCs與OECs混合1∶1植入實(shí)驗(yàn)C組）：用1 mL無菌注射器慢注入0.1 mL細(xì)胞懸液（數(shù)量約為1×105個）。逐層關(guān)閉傷口。術(shù)后禁食水?dāng)?shù)小時。1.3.4 功能檢測 在術(shù)后1、3、7、14 d和21 d，隨機(jī)抽取對照組、實(shí)驗(yàn)組各15只大鼠，進(jìn)行BBB評分，評分基本內(nèi)容：雙后肢可活動的關(guān)節(jié)數(shù)量、活動范圍、步態(tài)、負(fù)重、前后肢協(xié)調(diào)性及尾部活動情況，共22個分?jǐn)?shù)級別；斜板實(shí)驗(yàn)［4］，實(shí)驗(yàn)時將大鼠頭朝前，身體軀干與斜板平行，角度漸大，大鼠在板上停留5 s且不滑落，記錄角度，測3次取平均值。兩檢測法對大鼠后肢運(yùn)動功能進(jìn)行雙盲法評分來了解受損脊髓功能恢復(fù)情況；再行神經(jīng)電生理運(yùn)動誘發(fā)電位（motor evoked potentials，MEP）潛伏期檢測，刺激電極穿骨膜置于皮層，記錄電極置于暴露的坐骨神經(jīng)，參考電極位于大鼠硬腭下。觀察脊髓傳導(dǎo)或外周運(yùn)動神經(jīng)功能狀況。

1.3.5 大鼠灌注、取材、固定與免疫組化 每組隨機(jī)抽一只大鼠麻醉開胸，用靜脈針頭經(jīng)左心室入主動脈，待冰鹽水從右心耳流出后灌注4%多聚甲醛。切取T10～12對應(yīng)脊髓節(jié)段（損傷處為中心約1 cm），入10%福爾馬林固定，脫水沉底后石蠟包埋，厚度10 μm連續(xù)切片。按SABC試劑盒操作說明進(jìn)行。按步驟進(jìn)行，其中按步滴入一抗兔抗鼠BDNF多克隆抗體（1∶200）、生物素化標(biāo)記的二抗羊抗兔IgG。封片選最優(yōu)切片15張。10倍光鏡下分別計(jì)數(shù)4個視野內(nèi)BDNF染色陽性細(xì)胞占總計(jì)數(shù)細(xì)胞比例，即為陽性細(xì)胞標(biāo)記指數(shù)，染色陽性標(biāo)志是細(xì)胞漿或細(xì)胞膜呈明顯棕黃色。即檢測BDNF在受損脊髓中表達(dá)情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 17.0軟件處理，計(jì)量資料以 （±s）表示，比較采用單因素方差分析（ANOVA），P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SD大鼠急性脊髓損傷細(xì)胞移植后BBB評分變化 除第1天外，各實(shí)驗(yàn)組恢復(fù)程度均明顯大于對照組（P＜0.05），第7天開始各實(shí)驗(yàn)組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1、圖1。

圖1 SD大鼠急性脊髓損傷細(xì)胞移植后BBB評分變化

2.2 SD大鼠急性脊髓損傷細(xì)胞移植后斜板實(shí)驗(yàn)角度變化 第1周開始，四組中任意兩組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2、圖2。

圖2 SD大鼠急性脊髓損傷細(xì)胞移植后斜板試驗(yàn)角度變化

2.3 SD大鼠急性脊髓損傷細(xì)胞移植MEP（N1波）潛伏期變化 自第3天，四組中任意兩組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3、圖3。

圖3 SD大鼠急性脊髓損傷細(xì)胞移植MEP（N1波）潛伏期變化

2.4 SD大鼠急性脊髓損傷細(xì)胞移植后BDNF染色表達(dá)陽性的細(xì)胞數(shù)變化 細(xì)胞移植后，各組大鼠受損脊髓中BDNF開始升高，第3天到高峰后減少。術(shù)后第3天開始，四組中任意兩組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表4、圖4。

圖4 SD大鼠急性脊髓損傷細(xì)胞移植后BDNF染色表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)變化

表1 SD大鼠急性脊髓損傷細(xì)胞移植后BBB評分變化（±s） 分

表1 SD大鼠急性脊髓損傷細(xì)胞移植后BBB評分變化（±s） 分

*與對照組比較，P＜0.05；△與實(shí)驗(yàn)A組比較，P＜0.05；#與實(shí)驗(yàn)B組比較，P＜0.05

組別 1 d 3 d 7 d 14 d 21 d對照組（n=15） 0.00±0.00 0.51±0.22 2.64±0.38 5.05±0.62 5.92±0.92實(shí)驗(yàn)A組（n=15） 0.00±0.00 0.88±0.31*3.03±0.43*6.03±0.49*7.68±0.97*實(shí)驗(yàn)B組（n=15） 0.00±0.00 0.83±0.29*3.33±0.37*△6.49±0.42*△8.94±0.99*△實(shí)驗(yàn)C組（n=15） 0.00±0.00 0.98±0.03*3.64±0.41*△#6.87±0.43*△#9.67±0.93*△#F值 - 10.790 17.230 37.570 44.550 P值 - 0.000 0.000 0.000 0.000

表2 SD大鼠急性脊髓損傷細(xì)胞移植后斜板試驗(yàn)角度變化（±s）

表2 SD大鼠急性脊髓損傷細(xì)胞移植后斜板試驗(yàn)角度變化（±s）

*與對照組比較，P＜0.05；△與實(shí)驗(yàn)A組比較，P＜0.05；#與實(shí)驗(yàn)B組比較，P＜0.05

組別 1 d 3 d 7 d 14 d 21 d對照組（n=15） 12.93±1.26 13.25±1.21 17.12±2.56 24.17±4.52 30.19±2.36實(shí)驗(yàn)A組（n=15） 12.61±0.93*13.59±1.90 23.37±2.71*31.93±4.79*34.03±2.65*實(shí)驗(yàn)B組（n=15） 12.67±1.21*13.65±1.58 28.63±2.68*△36.69±3.86*△40.09±5.88*△實(shí)驗(yàn)C組（n=15） 12.62±1.31*14.62±1.57 31.07±2.79*△#41.63±6.51*△#43.52±5.95*△#F值 0.241 2.072 79.520 32.930 25.980 P值 0.867 0.114 0.000 0.000 0.000

表3 SD大鼠急性脊髓損傷細(xì)胞移植MEP（N1波）潛伏期變化（±s） ms

表3 SD大鼠急性脊髓損傷細(xì)胞移植MEP（N1波）潛伏期變化（±s） ms

*與對照組比較，P＜0.05；△與實(shí)驗(yàn)A組比較，P＜0.05；#與實(shí)驗(yàn)B組比較，P＜0.05

組別 1 d 3 d 7 d 14 d 21 d對照組（n=15） 26.28±3.32 18.51±0.99 15.83±0.71 13.57±0.96 11.59±0.97實(shí)驗(yàn)A組（n=15） 25.69±3.20 16.33±0.96*13.91±1.18*11.58±0.98*9.78±0.93*△實(shí)驗(yàn)B組（n=15） 25.10±3.48 17.11±0.93*△13.15±0.83*△10.63±0.97*△9.21±0.96*△實(shí)驗(yàn)C組（n=15） 25.00±3.28 17.47±0.91*△#12.24±0.79*△#9.92±0.89*△#8.61±0.95*△#F值 1.403 13.670 43.540 41.620 27.380 P值 0.252 0.002 0.000 0.000 0.000

表4 SD大鼠急性脊髓損傷細(xì)胞移植后BDNF染色表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)變化（±s） %

表4 SD大鼠急性脊髓損傷細(xì)胞移植后BDNF染色表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)變化（±s） %

*與對照組比較，P＜0.05；△與實(shí)驗(yàn)A組比較，P＜0.05；#與實(shí)驗(yàn)B組比較，P＜0.05注：表中各組例數(shù)為切片數(shù)

組別 1 d 3 d 7 d 14 d 21 d對照組（n=15） 12.76±2.63 15.59±0.81 15.21±0.98 14.33±0.99 13.95±1.04實(shí)驗(yàn)A組（n=15） 13.40±2.69 16.21±0.93*16.16±0.93*15.57±0.91*15.01±1.05*實(shí)驗(yàn)B組（n=15） 14.57±2.93 17.63±0.82*△17.15±0.94*△16.93±0.95*△16.31±0.98*△實(shí)驗(yàn)C組（n=15） 15.28±2.92 18.10±0.78*△#17.95±0.95*△#17.58±0.91*△#17.02±0.91*△#F值 2.470 33.609 23.534 35.566 28.133 P值 0.071 0.000 0.000 0.000 0.000

3 討論

3.1 造模方法及脊髓損傷治療方法的選擇 實(shí)驗(yàn)中改良Allen’s重物打擊挫傷法，不僅減小重物致傷力量延長擠壓時間，還有穩(wěn)定、簡便、可重復(fù)性等優(yōu)勢，且實(shí)驗(yàn)中對脊髓階段（T11）制損并未發(fā)生硬脊膜破損及腦脊液外滲等現(xiàn)象，與臨床急性脊髓損傷更為相近，更貼切體現(xiàn)治療方法及療效對比。細(xì)胞移植在臨床中對ASCI治療國外已有報(bào)道，國內(nèi)學(xué)者將嗅鞘細(xì)胞移植治療SCI處于臨床試驗(yàn)，效果頗為滿意［5］，有望推廣。NSCs有多向性分化能力，OECs可調(diào)節(jié)受損脊髓局部微環(huán)境。將NSCs和OECs分別、聯(lián)合移植到急性受損脊髓中發(fā)揮各自特性，觀察比較效果，來體現(xiàn)對受損脊髓功能恢復(fù)的強(qiáng)弱。

3.2 各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

3.2.1 BBB評分和斜板實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析 BBB評分法側(cè)重雙后肢運(yùn)動的各行為細(xì)節(jié)，如關(guān)節(jié)、腳趾、尾部等，斜板實(shí)驗(yàn)注重雙后肢肌力情況，兩評法從不同角度分析對比，各有側(cè)重又有彌補(bǔ)，評價更加客觀。

實(shí)驗(yàn)中各組大鼠造模前BBB評分均21分，造模細(xì)胞移植后24 h全是0分，隨實(shí)驗(yàn)進(jìn)行有不同程度恢復(fù)，各實(shí)驗(yàn)組比對照組明顯增高（P＜0.05），說明細(xì)胞移植對急性脊髓損傷有修復(fù)作用，且大于脊髓損傷后自身恢復(fù)作用。NSCs+OECs組比OECs組、NSCs組的增高差異都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），也說明NSCs+OECs聯(lián)合移植對急性脊髓損傷后運(yùn)動功能發(fā)揮最大恢復(fù)作用。這與損傷早期進(jìn)行聯(lián)合移植會有較好效果的研究假設(shè)相符合［6］。

造模前，各組大鼠斜板實(shí)驗(yàn)平均角度（81.50±2.33）°，造模細(xì)胞移植后，第1天斜板實(shí)驗(yàn)角度降至（12.71±1.19）°，降低幅度之大與脊髓損傷導(dǎo)致后肢肌力減退呈直接關(guān)系，說明急性脊髓損傷造模成功。隨實(shí)驗(yàn)進(jìn)行各組斜板實(shí)驗(yàn)角度都回復(fù)增大，第7天開始實(shí)驗(yàn)組比對照組增大幅度更明顯（P＜0.05），NSCs+OECs組比OECs組、NSCs組增大幅度有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），OECs組次之，NSCs組最弱，再次證實(shí)單種或多種細(xì)胞移植對損傷脊髓均有不同程度修復(fù)且急性脊髓損傷后有一定自身恢復(fù)性。

3.2.2 運(yùn)動誘發(fā)電位（MEP）檢測結(jié)果分析 采用MEP（N1波）潛伏期為檢測標(biāo)準(zhǔn)，反復(fù)刺激取平均值。造模細(xì)胞移植后各組大鼠MEP（N1波）潛伏期明顯延長，對照組潛伏期延長幅度比三實(shí)驗(yàn)組都大，第3天開始三實(shí)驗(yàn)組縮短幅度大于對照組縮短幅度（P＜0.05），說明細(xì)胞移植促進(jìn)受損脊髓的運(yùn)動傳導(dǎo)功能，NSCs+OECs組縮短幅度比OECs組、NSCs組都大（P＜0.05），OECs組次之，NSCs組最差，與BBB評分和斜板實(shí)驗(yàn)結(jié)果趨于一致。表明大鼠急性脊髓損傷后有些許修復(fù)作用，細(xì)胞移植促進(jìn)修復(fù)效果應(yīng)是由NSCs、OECs對軸突再生的促進(jìn)，再髓鞘化及延長，建立新突觸連接有助于傳導(dǎo)束功能恢復(fù)。

3.2.3 BDNF染色表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)結(jié)果分析 實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)，急性脊髓損傷后BDNF表達(dá)明顯增大，術(shù)后第3天到高峰，后下降，說明大鼠脊髓受損早期會自我保護(hù)性的提高BDNF分泌，那么BDNF很可能參與損傷早期有限的恢復(fù)過程。三實(shí)驗(yàn)組BDNF表達(dá)量比對照組的增多部分，在第3、7、14、21天比較差異均有統(tǒng)計(jì)意義（P＜0.05）。無論BDNF上升或下降，三實(shí)驗(yàn)組與對照組的變化趨勢相一致基礎(chǔ)上且表達(dá)要高，說明細(xì)胞移植對BDNF表達(dá)有明顯促進(jìn)。OECs+NSCs組與OECs組、NSCs組相比增大很明顯（P＜0.05），說明OECs+NSCs組產(chǎn)生BDNF最多，除OECs+NSCs分泌BDNF外脊髓損傷后自身也分泌，OECs組比NSCs組所表達(dá)BDNF要多（P＜0.05），實(shí)驗(yàn)組中NSCs組表達(dá)BDNF最弱，OECs組較強(qiáng)，OECs+NSCs組最強(qiáng)。

OECs、NSCs移植可提高BDNF表達(dá)，且BDNF參與ASCI修復(fù)過程，作用機(jī)制可能降低繼發(fā)性損傷的炎癥反應(yīng)，與神經(jīng)生長抑制因子進(jìn)行對抗及競爭，在ASCI中對受損神經(jīng)元起改善和修復(fù)的生物效應(yīng)及抗損傷性的保護(hù)作用，促進(jìn)軸突塑造，引導(dǎo)干細(xì)胞分裂方向，減少自由基代謝及堆積［7-8］，以調(diào)控到滿足神經(jīng)元再生所需微環(huán)境，促進(jìn)脊髓損傷后功能恢復(fù)。

3.3 NSCs與OECs移植修復(fù)ASCI 目前細(xì)胞聯(lián)合移植治療ASCI倍受關(guān)注，但目前NSCs和OECs移植后各自所發(fā)揮作用機(jī)制的諸多方面并未徹底明確，結(jié)合細(xì)胞特性、以往經(jīng)驗(yàn)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果做出推測：急性脊髓損傷勢必引起神經(jīng)細(xì)胞衰亡、神經(jīng)元?dú)埲焙蛪乃?、纖維受損及髓鞘脫離。NSCs分化成新的神經(jīng)元發(fā)揮作用；也可生成膠質(zhì)細(xì)胞（如星形、少突膠質(zhì)細(xì)胞等），發(fā)揮支持、滋養(yǎng)、協(xié)助神經(jīng)信號傳遞。NSCs增殖分化狀態(tài)受局部微環(huán)境和多種細(xì)胞因子所影響［9-11］，即NSCs對損傷脊髓發(fā)揮作用過程受干預(yù)性很強(qiáng)，這可能是本實(shí)驗(yàn)OECs組比NSCs組效果顯著的原因。OECs是一種具備神經(jīng)再生功能的細(xì)胞發(fā)揮作用同時分泌BDNF、NTF等神經(jīng)營養(yǎng)因子，調(diào)節(jié)局部微環(huán)境更適宜神經(jīng)細(xì)胞生長、分化及修復(fù)；還能分泌有利于神經(jīng)纖維延伸的各種蛋白［12］，和在細(xì)胞膜上表達(dá)出多細(xì)胞黏合和軸突生長相關(guān)支持因子［13-14］，以建立新髓鞘，向受損邊延伸，建立新突觸連接。實(shí)驗(yàn)中OECs組大鼠雙后肢運(yùn)動功能和MEP（N1波）潛伏期部分恢復(fù)正是機(jī)制的體現(xiàn)。目前對NSCs和OECs移植后各自所發(fā)揮作用機(jī)制的諸多方面并未徹底明確，兩者各自濃度和配比比例等諸多因素都需深入探索研究。在單細(xì)胞移植的基礎(chǔ)上，醫(yī)學(xué)界對聯(lián)合移植治療的研究日益升溫，使之早日在脊髓損傷的綜合多種方法這一鏈條中發(fā)揮自身最大能力。

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①包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 內(nèi)蒙古 包頭 014010

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.20.006

收稿日期：（2015-04-21） （本文編輯：蔡元元）

*基金項(xiàng)目：內(nèi)蒙古自治區(qū)高等學(xué)校科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（自然科學(xué)研究）中的一般項(xiàng)目（NJ10186）

通信作者：張朝

Impact of Olfactory Ensheathing Cells Combined Neural Stem Cells in Rats Subjected to Acute Spinal Cord Injury and Brain Derived Neurotrophic Factor Expression

CHEN Da-wei，LIU Yan-qing，ZHANG Chao.//Medical Innovation of China，2016，13（20）：022-027

【Abstract】Objective：To explore effect of olfactory ensheathing cells combined with neural stem cells on acute spinal cord injury in rats and brain derived neurotrophic factor（BDNF） expression.Method：The newborn （born 3 days） SD rats hippocampus and olfactory bulb were taken for preparation of neural stem cells and olfactory ensheathing cells.80 SD rats were made model of acute spinalcord injury，the rats were randomly divided into the control group（sham group），NSCs，OECs，NSCs+OECs transplantation group（were the experimental A，B，C group successively），then the cell transplantation.In the preoperative and postoperative 1 day，3，7，14，21 days，adopt BBB score，inclined plane experiments and tested motor evoked potential（MEP N1 wave）preclinical，Last，one rat were selected in each group randomly.Immunohistochemical staining were used to observe and comparison BDNF in the damaged spinal cord tissue localized expression in each group.Result：（1）The change of BBB score：except for the first day，any of experimental group the degree of recovery was significantly higher than the control group（P＜0.05）.From the beginning of the seventh day，the comparison between arbitrary two experimental group was statistically significant difference（P＜0.05）.（2）The changes of the inclined plate test：from the seventh day，the differences between arbitrary the group were statistically significant（P＜0.05）.（3）The change of MEP （N1 wave） latency：from the third day，the differences between arbitrary the group were statistically significant（P＜0.05）.（4）BDNF staining of cells expressing positive change：after cell transplantation，BDNF in the injured spinal cord of Each group rats began to increase.Until third days to reach the peak，after decrease.From the third day，the differences between arbitrary the group were statistically significant（P＜0.05）.Conclusion：When the cell transplantation is used to treat acute spinal cord injury in rats，research show：OECs+NSCs transplantation group achieve the best results.When a single cell specie transplant alone，OECs transplantation has better treatment effect than NSCs transplantation.BDNF expresses highest in the OECs+NSCs transplantation group.

【Key words】Olfactory ensheathing cells； Neural stem cells； Acute spinal cord injury； Brain derived neurotrophic factor