蒯錦霞包海軍李周儒董國(guó)凱殷文江孫曉明李?yuàn)檴櫜碳t星

Apelin-13對(duì)腦缺血再灌注損傷作用的初步研究*

蒯錦霞①包海軍①李周儒①董國(guó)凱①殷文江①孫曉明①李?yuàn)檴櫌俨碳t星①

【摘要】目的：研究Apelin-13對(duì)缺血/再灌注小鼠腦損傷的作用，并初步探討其對(duì)自噬性細(xì)胞死亡的影響。方法：取健康雄性CD-1小鼠，隨機(jī)分為假手術(shù)（sham）組、生理鹽水（Saline）組、Apelin組；Apelin組和Saline組首先建立腦缺血再灌注（MCAO/R）模型，再灌注即刻給予同側(cè)側(cè)腦室注射Apelin-13或等量生理鹽水，然后在再灌注48 h后，進(jìn)行神經(jīng)功能方面檢測(cè)，同時(shí)利用2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色評(píng)估腦梗死體積；缺血再灌注24 h和48 h后，采用West-blot法檢測(cè)各組自噬相關(guān)蛋白LC3的表達(dá)情況。結(jié)果：Apelin-13可顯著降低小鼠腦缺血再灌注后神經(jīng)功能缺損癥狀，減少腦梗死體積，減低自噬相關(guān)蛋白LC3的表達(dá)及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值。結(jié)論：Apelin-13對(duì)小鼠腦缺血再灌注損傷有一定的保護(hù)作用，抑制神經(jīng)細(xì)胞的自噬性死亡可能是其作用機(jī)制之一。

【關(guān)鍵詞】Apelin-13； 腦缺血再灌注模型（MCAO/R）； 自噬； LC3

First-author’s address：Xuzhou Medical University，Xuzhou 221002，China

腦缺血缺氧可引起的神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞和腦功能的缺損，腦缺血再灌注損傷是腦缺血缺氧后恢復(fù)缺血區(qū)血供的又一次損傷，也是一種繼發(fā)性神經(jīng)元損傷，與神經(jīng)細(xì)胞的繼發(fā)性神經(jīng)元死亡密切相關(guān)［1］。近年來(lái)有研究表明自噬與腦缺血損傷的發(fā)生、發(fā)展有著密切的關(guān)系［2-3］。研究發(fā)現(xiàn)脂肪因子Apelin-13能夠?qū)ι窠?jīng)細(xì)胞的損傷發(fā)揮保護(hù)作用，但其具體作用機(jī)制還不甚明了［4-6］。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)觀察Aplin-13在腦缺血再灌注損傷中是否起到了保護(hù)性作用，并通過(guò)檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3的表達(dá)，研究其對(duì)神經(jīng)細(xì)胞自噬的影響，探討其在缺血再灌注腦損傷中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 共48只健康雄性CD-1小鼠，體重30～35 g（由徐州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供），隨機(jī)分為如下各組，實(shí)驗(yàn)1：sham組6只、Saline組6只、Apelin-13組6只，共18只用于行為學(xué)檢測(cè)和TTC實(shí)驗(yàn)；實(shí)驗(yàn)2組：sham組、再灌注24 h Saline組、再灌注48 h Saline組、再灌注24 h Apelin-13組、再灌注48 h Apelin-13組，每組6只，共30只用于Western-Blot測(cè)定。

1.2 小鼠MCAO/R模型的制備 參照甄毅嵐等［6］的線栓法制作左側(cè)大腦中動(dòng)脈閉塞（MCAO）模型。小鼠用7%的水合氯醛（0.05/10 g）腹腔麻醉后，仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，酒精擦拭頸部消毒，行頸部正中切口、鈍性分離左側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈。結(jié)扎頸外動(dòng)脈近端，在頸總動(dòng)脈近心端結(jié)扎，遠(yuǎn)心端掛線備用。微動(dòng)脈夾夾住頸內(nèi)動(dòng)脈，在頸總動(dòng)脈上于分叉處約3 mm處剪一小口，插入專用線栓，將預(yù)制的活結(jié)稍打緊（防止線栓脫出）。打開(kāi)夾住頸內(nèi)動(dòng)脈的動(dòng)脈夾，將線栓緩慢插入頸內(nèi)動(dòng)脈，大約9 mm時(shí)感到有一定阻力停止推進(jìn)，且向外拔1mm用絲線固定，阻斷大腦中動(dòng)脈起始部血流且不刺破血管。傷口以碘伏消毒，縫合頸部皮膚，保留線栓3～4 mm，術(shù)后動(dòng)物側(cè)臥置于單獨(dú)的籠內(nèi)。缺血后60 min，緩慢向外拉線10 mm，使其頭端回撤至頸總動(dòng)脈內(nèi)，計(jì)時(shí)實(shí)施再灌注。Saline組、Apelin-13組采用線栓法建立小鼠MCAO/R模型；sham組僅給予分離血管，不予結(jié)扎及栓塞血管。Apelin組于再灌注即刻給予同側(cè)側(cè)腦室注Apelin-13 （0.33μg/g；注射定位：前囟左側(cè)1 mm，后1 mm，深度2.5 mm），Saline組給予同側(cè)側(cè)腦室等量的生理鹽水注射。

1.3 神經(jīng)功能評(píng)分及大腦梗死體積檢測(cè) MCAO/R 48 h后，采用改良Bederson評(píng)分法進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分［7］。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分，無(wú)明顯神經(jīng)病學(xué)癥狀；1分，不能完全伸展右側(cè)前爪（左側(cè)手術(shù)）；2分，向右側(cè)旋轉(zhuǎn)；3分，行走時(shí)向右側(cè)傾倒；4分，不能自行行走。0分及昏迷不醒者剔除。神經(jīng)功能評(píng)分后，對(duì)腦組織進(jìn)行TTC染色，正常組織呈鮮紅色，梗死組織呈白色。SD小鼠在水合氯醛麻醉下心內(nèi)灌注處死，冰板上快速斷頭取腦。把腦放入-20 ℃冰箱中冷凍，20 min后取出，切成2 mm的冠狀切片，泡入1%TTC溶液中，37 ℃水浴箱中30 min，甲醛固定，圖象分析儀測(cè)梗死體積。每只小鼠腦總梗死體積MV=Σ（A1+A2）t/2，其中t為切片厚度，A1和A2分別表示切塊嘴、尾側(cè)梗死面積。同樣方法計(jì)算同側(cè)大腦半球體積，計(jì)算出梗死灶體積占缺血側(cè)大腦半球體積的百分比。

1.4 Western-Blot的檢測(cè) Saline組和Apelin-13組按時(shí)間點(diǎn)開(kāi)顱取出小鼠傷側(cè)的海馬組織，sham組取同側(cè)海馬組織，提取蛋白質(zhì)，采用12%的SDSPAGE膠進(jìn)行蛋白質(zhì)分離，等量（10 μL）蛋白樣品上樣。恒壓電泳，全濕式電轉(zhuǎn)法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（NC膜）上，麗春紅染NC膜可見(jiàn)清晰的紅色條帶，表明蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜成功。NC膜用5%脫脂奶粉溶液室溫封閉NC膜4 h。分別加入一抗（抗GAPDH抗體，1∶1000；抗LC3抗體，1∶5000），4 ℃孵育過(guò)夜；二抗（生物素標(biāo)記羊抗兔IgG，1∶1000稀釋），4 ℃孵育1 h；用辣根酶標(biāo)記親和素（1∶1000稀釋）與二抗結(jié)合，4 ℃孵育1 h，以上操作均在搖床上進(jìn)行，且各步驟間均用TBST洗膜5 min×5次（操作分別按相關(guān)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行）。膜上加ECL超敏發(fā)光液，保鮮膜包好后，暗室內(nèi)曝光30 s，X線片在顯影液中顯影2 min，定影液中定影5 min。最后利用Quantity One（Bio-Rid）軟件分析蛋白光密度值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)量資料以（±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)和方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能評(píng)分 按照改良Bederson評(píng)分法，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：MCAO/R 48 h后， Saline組Bederson評(píng)分（3.13±0.23）分與sham組（0.63±0.18）分相比顯著升高（P＜0.05），提示腦缺血再灌注后造成明顯的神經(jīng)功能缺損。術(shù)后48 h，Apelin-13組Bederson評(píng)分（2.38±0.18）分與Saline組相比有所降低（P＜0.01），提示Apelin-13能夠顯著改善腦缺血再灌注后神經(jīng)功能的缺失。見(jiàn)圖1。

2.2 腦梗死體積檢測(cè) 腦梗死范圍測(cè)定是評(píng)價(jià)腦缺血損傷的金指標(biāo)，缺血再灌注48 h后，TTC染色，sham組小鼠腦組織表現(xiàn)為均勻一致的鮮紅色，無(wú)明顯梗死灶形成；Saline組和Apelin-13組腦組織出現(xiàn)范圍不等的白色梗死區(qū)域。Saline組梗死區(qū)域體積比例（22.35±1.50）明顯高于sham組（0.52±0.20）（P＜0.01），提示腦缺血再灌注后造成明顯的大腦梗死。術(shù)后48 h， Apelin-13組腦梗死體積比例（10.55±1.01）與Saline組相比明顯降低（P＜0.01），提示Apelin-13能夠顯著降低缺血再灌注小鼠的梗死體積。見(jiàn)圖2。

圖1 缺血再灌注48 h后神經(jīng)功能評(píng)分檢測(cè)結(jié)果

圖2 缺血再灌注48 h后大腦梗死體積比的統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2.3 Western-Blot的檢測(cè)結(jié)果 通過(guò)對(duì)MCAO/R后受損海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的LC3的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，再灌注后24、48 h，Saline組海馬區(qū)的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值（0.366±0.319）、（0.408±0.035）與sham組（0.193±0.034）相比均增加，且在48 h達(dá)高峰，Apelin-13組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比 值（0.243±0.031）、（0.291±0.027）與Saline組相比從24 h開(kāi)始顯著降低，并且持續(xù)到了48 h，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖3。

3 討論

Apelin為孤兒G蛋白耦聯(lián)受體APJ的天然配體，Apelin及其受體APJ廣泛分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)及外周［8-9］，在中樞神經(jīng)系統(tǒng) 中，Apelin參與應(yīng)激以及痛覺(jué)的調(diào)制等生理作用；在心血管系統(tǒng)中，Apelin可調(diào)節(jié)心肌收縮力和降低動(dòng)脈血壓［10-11］。近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)Apelin有顯著抑制細(xì)胞凋亡的作用［12-13］，而自噬與凋亡有著共同的調(diào)節(jié)因子，及復(fù)雜的相互調(diào)節(jié)關(guān)系。自噬作為一種早期的自我適應(yīng)性機(jī)制，能清除受損的細(xì)胞器和蛋白，為組織穩(wěn)態(tài)的恢復(fù)提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和能量［14］。因此通過(guò)調(diào)控細(xì)胞自噬的發(fā)生，可成為治療缺血再灌注腦損傷的一種新的嘗試手段。

圖3 Western-Blot的檢測(cè)結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)腦室注射Apelin-13觀測(cè)其對(duì)腦神經(jīng)的保護(hù)作用，結(jié)果顯示，與Saline組相比，Apelin-13組小鼠神經(jīng)功能缺失顯著降低，表明Apelin-13可明顯改善腦缺血再灌注損傷后小鼠的神經(jīng)功能缺損，發(fā)揮保護(hù)神經(jīng)的作用。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)還采用了TTC染色法觀察梗死體積，與Saline組相比，Apelin-13組腦缺血再灌注損傷的腦梗死體積明顯減少，進(jìn)一步表明Apelin-13對(duì)腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用。

通過(guò)Western-Blot的檢測(cè)結(jié)果，筆者發(fā)現(xiàn)Apelin-13能顯著的降低LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值。LC3蛋白是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中酵母ATG8基因的同源物，靶向定位于自噬體膜，參與自噬體的形成，被認(rèn)為是觀察自 噬是否存在的標(biāo)記性分子［15-19］，有Ⅰ型和Ⅱ型之分。哺乳動(dòng)物細(xì)胞發(fā)生自噬時(shí)，細(xì)胞內(nèi)LC3的含量及LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)化均明顯增加，LC3-Ⅱ含量的多少與自噬泡數(shù)量的多少成正比［20-24］。因此，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值的變化，可以明確地判斷自噬水平的高低。本實(shí)驗(yàn)中，Apelin-13組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明顯降低，表明Apelin-13對(duì)腦缺血再灌注過(guò)程的自噬有顯著抑制作用。

綜上所述，Apelin-13可明顯減輕腦缺血再灌注損傷，保護(hù)大腦的功能。通過(guò)抑制細(xì)胞的自噬可能是其作用機(jī)制之一，但是自噬的發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，其具體作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步的研究證實(shí)。

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①徐州醫(yī)科大學(xué) 江蘇 徐州 221002

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.20.005

收稿日期：（2016-03-29） （本文編輯：蔡元元）

*基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)青年基金項(xiàng)目（81302612）；江蘇省高校自然指導(dǎo)項(xiàng)目（15KJD180003）

通信作者：李周儒

The Effect of Apelin-13 on Mice after Middle Cerebral Artery Occlusion-Reperfusion Injury

KUAI Jin-xia，BAO Hai-jun，LI Zhou-ru，et al.//Medical Innovation of China，2016，13（20）：018-021

【Abstract】Objective：To observe the effect of apelin-13 on the brain injury induced by middle cerebral artery occlusion-reperfusion（MCAO/R），and to explore the relationship between apelin-13 and autophagy in MCAO/R. Method：A total of 48 mice were randomly divided into sham，saline and apelin-13 groups.Firstly，mice s MCAO/R model was established using the suture’s method.After MCAO/R， Apelin-13 and saline groups were pretreated with an immediate injection of Apelin-13 and saline into the mice brain lateral ventricle.The effect of neurological deficit scores and the cerebral infarct volume was measured with TTC at 48h after MCAO/R.At last，to determine the role of Apelin-13 on the brain injury induced by MCAO/R，the autophagy associated proteins LC3 were also assessed with western-bloting.Result：Apelin-13 can significantly decreased neural dysfunction and cerebral infarct volume of mice after MCAO/R 48 h.Inadditionally，Apelin-13 also reduce the amount of protein LC3 expression and down-regulated protein LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰratio，at 24 h and 48 h after MCAO/R.Conclusion：Apelin-13 preconditioning has obvious protective effect on mice after MCAO/R，and the mechanism may possibly by suppressing neuron autophagy.

【Key words】Apelin-13； MCAO/R； Autophagy； LC3