劉虹　　趙海鵬　　李源　　陳燕

（濰坊市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，山東 濰坊 261205）

環(huán)孢素軟膠囊溶出度H PLC檢測方法改進(jìn)研究

劉虹趙海鵬李源陳燕

（濰坊市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，山東 濰坊 261205）

目的：對環(huán)孢素軟膠囊溶出度檢測高效液相色譜（HPLC）方法進(jìn)行改進(jìn)。方法：采用漿法，含0.1 mol/L HCl的0.5%十二烷基磺酸鈉為溶出介質(zhì)，轉(zhuǎn)速75 rpm，分別于第15，30，45，60，75，90 min取樣，測定4個廠家產(chǎn)品的溶出度，繪制溶出曲線。HPLC色譜條件為：C8（2）柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；0.1%三氟乙酸∶四氫呋喃∶乙腈∶0.5%三乙胺（磷酸調(diào)pH為2.4）（20∶25∶40∶15）為流動相，柱溫60℃，流速1.0 mL/min；檢測波長210 nm。結(jié)果：本方法線性范圍為5～ 100 μg/mL，定量限、檢測限分別為2.6，0.86 μg/mL。4個廠家的樣品在90 min內(nèi)溶出度均超過標(biāo)示量的80%，但溶出曲線存在明顯差別。結(jié)論：本方法準(zhǔn)確、可靠，靈敏度高，能夠區(qū)分不同廠家產(chǎn)品的溶出特征，適用于環(huán)孢素軟膠囊溶出度的檢測。

環(huán)孢素軟膠囊；溶出度；高效液相色譜法

環(huán)孢素是一種環(huán)肽類免疫抑制劑，主要用于預(yù)防組織器官移植的排斥反應(yīng)及自身免疫性疾病。根據(jù)國家食品藥品監(jiān)督管理總局網(wǎng)站查詢結(jié)果，目前國內(nèi)批準(zhǔn)上市的環(huán)孢素制劑已達(dá)14家，劑型主要為軟膠囊制劑。環(huán)孢素存在環(huán)孢素H、異環(huán)孢素A等多種雜質(zhì)，且環(huán)孢素在高效液相色譜（HPLC）系統(tǒng)中存在構(gòu)象異構(gòu)體變換。其軟膠囊則含有表面活性劑及中長鏈油脂等親油性內(nèi)容物。上述雜質(zhì)、構(gòu)象異構(gòu)體及內(nèi)容物的存在對其溶出度的測定均存在干擾，影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

《中國藥典》未收錄環(huán)孢素軟膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，部頒標(biāo)準(zhǔn)WS1-（-144）2004Z［1］未對其溶出度檢測作出規(guī)定。目前國內(nèi)尚缺乏關(guān)于環(huán)孢素軟膠囊溶出度檢測方法的文獻(xiàn)報道，本文參考國內(nèi)外質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)［2］及文獻(xiàn)方法［3-4］對環(huán)孢素軟膠囊溶出度測定的HPLC檢測方法進(jìn)行了研究，建立的HPLC方法專屬性強(qiáng)、靈敏度高、準(zhǔn)確度和重復(fù)性好、方法簡便，有利于環(huán)孢素軟膠囊的質(zhì)量控制和監(jiān)管。

1儀器和試藥

1.1儀器

美國Agilent1200型高效液相色譜儀（G1310A泵，G1316A柱溫箱，G1329A自動進(jìn)樣器，G1314 BVWD紫外檢測器），XS-205型電子分析天平（Mettler-Toledo公司），ZRS-6G藥物溶出實(shí)驗(yàn)儀（天津市天大天發(fā)科技有限公司），PHS-3C型精密pH計（上海精密科學(xué)儀器有限公司）。

1.2試藥

環(huán)孢素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：130495-200202）；環(huán)孢素軟膠囊（規(guī)格：25 mg）由N、H、C、S 4家公司提供（批號：S057，140502HB，110902201，11171023）。三氟乙酸、四氫呋喃、乙腈、三乙胺為色譜純，水為超純水。其余試劑為分析純。

2色譜條件與方法

2.1色譜條件與系統(tǒng)適用性

色譜柱：Phenomenex LunaC8（2）色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：0.1%三氟乙酸∶四氫呋喃∶乙腈∶0.5%三乙胺（磷酸調(diào)pH為2.4）（20∶25∶40∶15）；柱溫：60℃；流速：1.0 mL/min；檢測波長：210 nm；進(jìn)樣量：10 μL。理論塔板數(shù)按環(huán)孢素峰計算不低于2 000，環(huán)孢素峰與相鄰峰的分離度不低于1.7，重復(fù)進(jìn)樣的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于2.0%［3］。

2.2溶液制備

2.2.1供試品溶液制備取本品，照溶出度與釋放度測定法（《中國藥典》2015年版四部通則 0931第二法），以含 0.1 mol/L HCl的0.5%十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfonate，SDS）水溶液1 000 mL為溶出介質(zhì)，轉(zhuǎn)速為75 rpm，依法操作，經(jīng)45 min取溶液適量，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.2對照品溶液制備精密稱取環(huán)孢素對照品，加“2.2.1”項(xiàng)下溶出介質(zhì)溶解，分別稀釋制成2，5，15，30，60，100，140 μg/mL濃度的溶液。

2.2.3空白輔料溶液制備各廠家輔料存在差異，因此以4個廠家的常見輔料：明膠、無水乙醇、玉米油、1，2-丙二醇、甘油、聚氧乙烯氫化蓖麻油、單硬脂酸甘油酯、山梨醇等為輔料，依處方量按“2.1.1”項(xiàng)供試品溶液制備方法配制空白輔料溶液。

2.3樣品測定

精密量取供試品溶液及對照品溶液各10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計算出對應(yīng)時間點(diǎn)每粒膠囊的溶出度，繪制溶出曲線。

3方法學(xué)考察

3.1檢測條件考察

3.1.1色譜柱的選擇《中國藥典》2015年版［5］、《美國藥典》［2］HPLC測定環(huán)孢素軟膠囊含量的色譜柱為C18柱，柱溫需要達(dá)到70～ 80℃。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，按照《美國藥典》［2］色譜條件測定環(huán)孢素軟膠囊溶出度時，主峰與共洗脫峰無法有效分離；采用C8柱可將主峰與共洗脫峰有效分離。結(jié)果見圖1。3.1.2柱溫的選擇試驗(yàn)中對不同溫度下（55，60，65，70℃）環(huán)孢素軟膠囊的峰形進(jìn)行了考察，結(jié)果見圖2。環(huán)孢素主峰峰形隨溫度升高趨于尖銳。65，70℃下，主峰與共洗脫峰未能有效分離；55℃下主峰與共洗脫峰分離效果較好，但理論塔板數(shù)低于700，分離效率較低。因此本實(shí)驗(yàn)選用60℃柱溫進(jìn)行溶出度測定。

3.1.3流動相的選擇國內(nèi)外藥品標(biāo)準(zhǔn)［1，2，5］及文獻(xiàn)［3-4］用于環(huán)孢素含量測定的流動相包括乙腈-水-叔丁基甲醚-磷酸（430∶520∶50∶1）、四氫呋喃-水（80∶20）等。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)采用上述流動相普遍存在環(huán)孢素峰出峰晚（12～ 15 min）及峰形拖尾問題。因此本文對流動相組成進(jìn)行調(diào)整，加入三乙胺作為掃尾劑，并對流動相配比進(jìn)行了考察，結(jié)果表明，采用“2.1”項(xiàng)下流動相可使環(huán)孢素主峰出峰時間縮短至7.2 min（見圖1～ 2），平均峰寬為0.55，環(huán)孢素主峰與相鄰峰的分離度為（1.7± 0.2）；平均拖尾因子為1.04。

圖1　溶出介質(zhì)中環(huán)孢素軟膠囊的HPLC色譜圖

圖2　不同溫度下溶出介質(zhì)中環(huán)孢素軟膠囊的HPLC色譜圖

3.1.4溶出介質(zhì)的選擇《美國藥典》［2］中環(huán)孢素膠囊劑溶出度測定所用介質(zhì)為水或含 0.1 mol/L HCl的0.5%SDS水溶液。試驗(yàn)中比較了環(huán)孢素軟膠囊在超純水和含0.1 mol/L HCl的0.5%SDS水溶液兩種介質(zhì)中的色譜分離行為。結(jié)果見圖3。在超純水中，環(huán)孢素主峰與共洗脫峰未能有效分離；在含0.1 mol/L HCl的0.5%SDS水溶液中，環(huán)孢素主峰與共洗脫峰可有效分離，因此選用含0.1 mol/L HCl的0.5%SDS水溶液作為溶出介質(zhì)。

圖3　環(huán)孢素及軟膠囊在不同溶出介質(zhì)中的色譜圖

3.1.5溶出方法及轉(zhuǎn)速的選擇《美國藥典》［2］中環(huán)孢素軟膠囊溶出度測定采用漿法，轉(zhuǎn)速為50 rpm。試驗(yàn)中考察了藍(lán)法（50，75 rpm）和漿法（50，75 rpm）的溶出曲線，結(jié)果見圖4。4種條件下，環(huán)孢素軟膠囊在45 min內(nèi)均可達(dá)到溶出平臺。其中漿法75 rpm溶出曲線更為理想且能夠區(qū)分不同廠家產(chǎn)品的溶出曲線。

3.2方法學(xué)考察

3.2.1專屬性試驗(yàn)分別依次取對照品溶液、供試品溶液和空白輔料溶液按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，色譜圖見圖5，可見空白輔料不干擾環(huán)孢素的測定。

圖4　不同溶出方法和轉(zhuǎn)速下環(huán)孢素軟膠囊的溶出曲線

圖5　　對照品（A）、供試品（B）及空白輔料（C）HPLC色譜圖

3.2.2線性范圍及標(biāo)準(zhǔn)曲線取“2.2.2”項(xiàng)下不同濃度的對照品溶液，注入液相色譜，以環(huán)孢素濃度（μg/mL）對峰面積進(jìn)行線性回歸（圖6）。線性方程為：

Y=35.75X+185（R2=0.999 9），

線性范圍為5～ 100 μg/mL。

圖6　　環(huán)孢素含量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.2.3精密度試驗(yàn)日內(nèi)精密度：取對照品適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法配成 20，40，80 μg/mL的溶液，每隔2 h測定一次，連續(xù)測定5次，記錄峰面積并計算5次峰面積的 RSD；日間精密度：取上述溶液，每日同一時間測定1次，連續(xù)測定3天，記錄峰面積并計算3次峰面積的RSD。結(jié)果見表1。

表1　　環(huán)孢素在流動相中的日內(nèi)及日間精密度

3.2.4穩(wěn)定性試驗(yàn)取“2.2.1”項(xiàng)下供試品溶液1份，依法分別于0，3，6，9，12，24 h進(jìn)樣分析，結(jié)果環(huán)孢素峰面積的RSD為0.26% （n=6），表明環(huán)孢素溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.2.5回收率試驗(yàn)按處方量的 80%，100%，120%精密稱取環(huán)孢素對照品20，25，30 mg各 3份，加入處方量輔料，溶出介質(zhì)溶解，容量瓶中定容至500 mL，搖勻、靜置。精密吸取上清液 1 mL 于 10 mL容量瓶中，溶出介質(zhì)稀釋至刻度，過濾，取續(xù)濾液 10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，測定峰面積，計算回收率及 RSD。結(jié)果見表2。

3.2.6定量限和檢測限取“2.2.1”項(xiàng)下對照品，配成系列濃度的溶液，取上述溶液各10 μL注入液相色譜儀，依法測定。信噪比S/N=10時，環(huán)孢素濃度為2.6 μg/mL，當(dāng)信噪比S/N=3時，環(huán)孢素濃度為0.86 μg/mL。因此該法的定量限和檢測限分別為2.6 μg/mL和0.86 μg/mL。

4結(jié)果與結(jié)論

取4個廠家的環(huán)孢素軟膠囊樣品，照溶出度與釋放度測定法（《中國藥典》2015年版四部通則0931第二法），以“2.2.1”項(xiàng)下溶出介質(zhì)1 000 mL為介質(zhì)，轉(zhuǎn)速為75 rpm，依法操作，分別于第15，30，45，60，75，90 min取溶液適量，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。另精密稱取環(huán)孢素對照品適量，加溶出介質(zhì)溶解并稀釋制成與供試品溶液相同濃度的溶液，作為對照品溶液。分別精密量取上述兩種溶液各 10 μL，照“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，并按外標(biāo)法以峰面積計算每粒的溶出量。限度為90 min內(nèi)溶出度不低于標(biāo)示量的80%［2］。

表2　　環(huán)孢素回收率試驗(yàn)結(jié)果

依法測定，同批次樣品均測定6次（n=6），計算各時間點(diǎn)的溶出度（%），結(jié)果見圖7。

圖7　　不同樣品的溶出曲線

由圖可見，4種樣品在90 min內(nèi)的溶出度均超過標(biāo)示量的80%，符合《美國藥典》［2］標(biāo)準(zhǔn)要求，但4種樣品溶出速度存在顯著差異，樣品達(dá)到標(biāo)示量80%的速度依次為N＞H＞S＞C。通過溶出曲線可見，4種樣品溶出度達(dá)到最值后其曲線均存在輕微下行趨勢，可能是由于環(huán)孢素降解所致。

5討論

環(huán)孢素治療指數(shù)較窄［6］，治療劑量與毒性劑量接近。其體外溶出行為的差異對藥物體內(nèi)吸收、藥效及毒性造成的影響相比其他藥物更為顯著。由于我國尚缺乏環(huán)孢素制劑的溶出度測定法定標(biāo)準(zhǔn)，本文參考國外藥典標(biāo)準(zhǔn)［2］及文獻(xiàn)對環(huán)孢素軟膠囊的溶出度測定方法進(jìn)行了改進(jìn)研究，并對不同廠家環(huán)孢素軟膠囊的溶出曲線進(jìn)行了比較研究。

《美國藥典》［2］中環(huán)孢素膠囊含量測定常用 C18柱，柱溫普遍高于70℃，導(dǎo)致色譜柱壽命縮短，僅能維持2～ 4周［7］。本文比較了C18與C8兩種色譜柱對環(huán)孢素軟膠囊主藥及輔料的分離效果。結(jié)果表明，C8在較低溫度下仍能夠?qū)崿F(xiàn)主藥及輔料的有效分離，且在本色譜條件下主藥出峰時間較快，有利于延長色譜柱壽命，縮短分析時間?！睹绹幍洹翻h(huán)孢素膠囊溶出度測定轉(zhuǎn)速為 50 rpm，指標(biāo)為90 min內(nèi)藥物溶出度，本次實(shí)驗(yàn)研究表明，所測樣品在45 min內(nèi)溶出度均可超過標(biāo)示量的80%，因此上述標(biāo)準(zhǔn)存在偏低的問題。

仿制藥質(zhì)量一致性評價是目前我國藥品監(jiān)管的主要工作之一。我國已發(fā)布《普通口服固體制劑溶出曲線測定與比較指導(dǎo)原則》，旨在通過體外溶出度試驗(yàn)確認(rèn)藥品質(zhì)量和療效的一致性。本研究采用建立的HPLC方法對不同廠家產(chǎn)品的溶出度進(jìn)行了測定，雖然所測樣品的溶出度均符合要求，但其溶出曲線存在明顯差異，原研廠家產(chǎn)品（N）的溶出速度快于國產(chǎn)品種（C、H、S），而國產(chǎn)品種之間的溶出速度也存在明顯差別。上述溶出速度的差異可能是導(dǎo)致臨床療效差異的原因之一。

由于不同廠家環(huán)孢素軟膠囊輔料配方及配比可能存在不同，進(jìn)而導(dǎo)致溶出度產(chǎn)生差異。而本研究的HPLC方法中，空白輔料溶液的選取可能無法反映不同廠家產(chǎn)品輔料的差異，因此，本HPLC方法的專屬性試驗(yàn)可能存在一定的局限。

綜上，本實(shí)驗(yàn)建立的環(huán)孢素軟膠囊溶出度HPLC檢測方法能夠有效解決環(huán)孢素主峰展寬及輔料干擾問題，主峰出峰時間快，方法準(zhǔn)確、精密、具有較寬的線性范圍，相比現(xiàn)有方法，能夠在較低溫度下實(shí)現(xiàn)環(huán)孢素軟膠囊溶出度測定，且能夠區(qū)分不同廠家產(chǎn)品的溶出曲線，適用于環(huán)孢素軟膠囊溶出度檢查和評價。

［1］ 國家藥典委員會.新藥轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn)（55冊）［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2008：53.

［2］ 美國藥典委員會.美國藥典［S］.VSP35-NF30.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2011：2794-2795.

［3］ 劉浩，仇士林.HPLC法測定環(huán)孢素膠囊中環(huán)孢素及降解產(chǎn)物的含量［J］.中國抗生素雜志，2002，27（4）：227-231.

［4］龐文哲，宋更申，王茉莉.HPLC法同時測定環(huán)孢素注射液的含量和有關(guān)物質(zhì)［J］.中國藥房，2015，26（3）：399-401.

［5］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（二部）［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：583-584.

［6］ 孟金薇，司繼剛，袁姜.高效液相色譜法測定環(huán)孢素A血藥濃度的方法改進(jìn)［J］.中國藥業(yè)，2003，12（9）：38.

Improvement of HPLC Method for Determination of Dissolution of Ciclospor in Soft Capsules

Liu Hong，Zhao Haipeng，Li Yuan，Chen Yan
（Weifang Institute for Food and Drug Control，Shandong Weifang 261205，China）

Objective：To improve the HPLC method for determination of dissolution of ciclosporin soft capsules.Methods：The paddle method was adopted using 0.5%sodium dodecyl sulfonate containing 0.1 mol/L HCl as a media at a rotation rate of 75 rpm.Samples were taken from the products of manufacturers at time points（15，30，45，60，75 and 90 min）and determined for dissolution，based on which a dissolution curve was plotted.HPLC was performed with C8（2）column（4.6 mm×250 mm，5 μm）at a column temperature of 60℃，using the mixture of 0.1%trifluoroacetic acid，tetrahydrofuran，acetonitrile and 0.5%triethylamine（20∶25∶40∶15，adjusted to pH 2.4 using phosphoric acid）as mobile phase at a flow rate of 1.0 mL/min.The wavelength for detection was 210 nm.Results：The linear range of the method was 5～ 100 μg/mL，while the quantitation and detection limits were 2.6 and 0.86 μg/mL，respectively.All the dissolutions of samples from four manufacturers within 90 min were more than 80%of the stated amount.However，the dissolution curves of the samples showed significant difference.Conclusion：The HPLC method was accurate，reliable and highly sensitive，which distinguished the dissolution characters of products from various manufacturers，and was suitable for the determination of dissolution of ciclosporin soft capsules.

Ciclosporin Soft Capsules；Dissolution；HPLC

10.3969/j.issn.1672-5433.2016.04.003

劉虹，女，主管藥師。研究方向：藥品檢驗(yàn)。通訊作者E-mail：liuhong1969@163.com

2016-01-07）