周慧，賈延濤，張江松，林咸明（浙江中醫(yī)藥大學(xué)，杭州 310053）

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·動物實驗·

胰島素穴位緩釋注射對SD大鼠不同時間降糖效應(yīng)的影響

周慧，賈延濤，張江松，林咸明
（浙江中醫(yī)藥大學(xué)，杭州 310053）

【摘要】目的觀察胰島素結(jié)合PVP緩釋劑穴位注射對SD大鼠不同時間血糖值、血清胰島素含量變化并分析其相關(guān)性。方法將144只SD雄性大鼠隨機分為A組（單純胰島素穴注組）、B組（胰島素穴注緩釋組）和C組（對照組）。各組以40%葡萄糖（劑量為2.2 g/kg）灌胃1 h后，A組和B組進行足三里穴位注射，C組不予處理。3組分別于穴位注射后0.5 h、3 h、6 h、8 h、10 h和24 h 6個時間點測定大鼠血糖值及血清胰島素含量（C組按相應(yīng)時點取血測定）；同時在穴位注射后3 h、10 h、24 h 3個時間點采用光鏡觀察各組大鼠足三里穴區(qū)組織刺激反應(yīng)。結(jié)果A組和B組降糖率均在穴位注射后3 h到達高峰后逐漸下降。A組在穴位注射后6 h降糖作用趨于穩(wěn)定，B組在穴位注射后10 h趨于穩(wěn)定，且B組在穴位注射后6 h與8 h的降糖作用明顯優(yōu)于A組（P＜0.01）。A組血清胰島素在穴位注射后3 h到達高峰（P＜0.05），至6 h趨于穩(wěn)定。B組在穴位注射后0.5 h、3 h、6 h、8 h 4個時間點血清胰島素含量均顯著低于A組（P＜0.05）。大鼠血清胰島素含量與降糖率相關(guān)性分析顯示，A組存在顯著正相關(guān)（P＜0.01），B組存在低度正相關(guān)（P＜0.05）。穴位注射后3h、8 h、24 h 3個時間點A組和B組大鼠足三里穴區(qū)周圍肌纖維組織橫紋清晰、結(jié)構(gòu)完整，無明顯變性、壞死和炎性反應(yīng)，與C組比較無明顯病理變化。結(jié)論PVP緩釋劑可減緩胰島素在大鼠足三里穴區(qū)的吸收速率，同時延長了胰島素降糖效應(yīng)持續(xù)時間，而且顯示血清胰島素含量與降糖效應(yīng)的相關(guān)性降低，提示穴位注射緩釋技術(shù)可以延長藥物穴位注射效應(yīng)。

【關(guān)鍵詞】水針；緩釋技術(shù)；胰島素；降糖作用；聚乙烯吡咯烷酮；大鼠

藥物緩釋（或控釋）技術(shù)是當(dāng)今給藥技術(shù)的新方法，目前已有一些成熟的藥物控釋制劑應(yīng)用于臨床［1］，其優(yōu)點一是可減少注射次數(shù)，提高患者的依從性；二是保持穩(wěn)定的血藥濃度，避免了峰谷現(xiàn)象，降低了藥物的不良反應(yīng)。但目前在穴位注射領(lǐng)域藥物緩釋（或控釋）技術(shù)的研究和應(yīng)用還少見報道，所以對穴位注射結(jié)合藥物緩釋技術(shù)影響穴位注射藥物在穴區(qū)維持作用的時間長短與其總體效應(yīng)的相關(guān)性進行研究，以及對穴位緩釋劑注射的穴效藥效整合機制方面進行探索具有重要意義。

目前，藥物穴位注射有大量的臨床使用度，但對其深入研究較少，特別是藥物在穴區(qū)的吸收速率對其效應(yīng)的影響未見報道。如何減緩藥物在穴位內(nèi)的吸收速率，使藥物對穴位的化學(xué)性刺激反應(yīng)延長，從而更好地激發(fā)經(jīng)氣，使藥物通過經(jīng)絡(luò)-腧穴系統(tǒng)的傳導(dǎo)而發(fā)揮更佳治療效應(yīng)，是提高藥物穴注療法療效的一個重要方面［2］。故本實驗采用穴位注射結(jié)合藥物緩釋技術(shù)，將聚乙烯吡咯烷酮（PVP）制備成胰島素緩釋劑［3］，研究胰島素結(jié)合緩釋劑穴位注射對SD大鼠血糖及血清胰島素含量及觀察對穴區(qū)組織的影響，試對藥物穴位注射進行改良，現(xiàn)報告如下。

1　材料與方法

1.1實驗動物

Sprague-Dawley（SD）大鼠144只，雄性，清潔級，體重為（200±20）g，由中科院上海實驗動物中心提供，飼養(yǎng)于學(xué)校實驗動物中心，給予嚙齒類動物標準顆粒飼料及飲水，實驗室適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d后進行實驗。

1.2主要儀器及試劑

羅氏血糖測定儀（德國羅氏公司，批號2189）；多功能酶標分析儀（德國Thermo公司，批號609464）。

血清胰島素酶聯(lián)免疫試劑盒（Sigma進口分裝，美國，BPE10552R）；胰島素注射液（諾和靈，規(guī)格400 U/ 10 mL，1003222）；聚乙烯吡咯烷酮（達文生物，杭州，0507-100G）。

1.3干預(yù)方法

采用隨機數(shù)字表分配法將SD大鼠隨機分為A組（單純胰島素穴注組）、B組（胰島素穴注緩釋組）和C組（對照組）。各組大鼠以40%葡萄糖（按2.2 g/kg劑量［4］）進行灌胃，1 h后各組處理如下。A組取雙側(cè)大鼠“足三里”（定位參照華興邦等［5］定位法）進行穴位注射胰島素（胰島素注射液與生理鹽水按1：1稀釋至200 U/10 mL，每只大鼠按胰島素5 U/kg劑量（即0.25 mL/kg）分雙側(cè)穴位等量注射）。B組取雙側(cè)“足三里”進行穴位注射胰島素緩釋液（胰島素注射液與生理鹽水按1：1稀釋至200 U/10 mL，取10 g PVP加入胰島素注射液稀釋液充分混勻定容到100 mL，經(jīng)0.45 μm、0.22 μm一次性濾膜抽濾除菌配制成胰島素緩釋液，每只大鼠按胰島素5 U/kg劑量（即0.25 mL/kg）分雙側(cè)穴位等量注射）。C組葡萄糖灌胃后不予任何處理。

1.4檢測指標及方法

1.4.1血糖、血清胰島素含量的檢測

分別于穴位注射后0.5 h、3 h、6 h、8 h、10 h 和24 h 6個時間點，各組大鼠剪尾法取血后，利用羅氏血糖儀檢測血糖值（C組按相應(yīng)時點取血測定），并根據(jù)以下公式計算處理不同時間點各組大鼠血糖下降百分率，血糖下降百分率＝［（給藥前血糖值－給藥后血糖值）/給藥前血糖值］×100%。待血糖值檢測完畢后，各組大鼠采用5 mL注射器采集靜脈血（腹腔靜脈取血約4 mL/只），利用酶聯(lián)免疫法（ELISA）檢測各組大鼠血清胰島素的含量。

1.4.2穴位注射周圍組織的刺激性實驗

取穴位注射后3 h、10 h、24 h 3個時間點的各組大鼠，待靜脈血采集完畢后，解剖取出雙側(cè)足三里穴位周圍組織，C組同時間點做相同處理。肉眼觀察各組穴注周圍局部刺激反應(yīng)后，采用10%福爾馬林進行組織固定、脫水、包埋。5 μm連續(xù)切片，HE染色，顯微鏡觀察各組肌纖維組織橫紋是否清晰、結(jié)構(gòu)是否完整，有無變性、壞死和炎性反應(yīng)。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差表示，多組間計量資料比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較，方差齊性時用LSD檢驗，方差不齊時用Dunnett-T3檢驗；計數(shù)資料采用卡方檢驗。以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　實驗結(jié)果

2.1各組不同時間點降糖率比較

由表1可見，A組和B組同一時間點均表現(xiàn)出較強的降糖作用，與C組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。A組的降糖作用在穴位注射后3 h到達高峰后逐漸下降，在穴位注射后6 h降糖作用趨于穩(wěn)定，穴位注射6 h之前相鄰2個時間點比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。B組降糖作用同樣在穴位注射后3 h到達高峰，但是其降糖作用卻延長至穴位注射后10 h才趨于穩(wěn)定，穴位注射10 h之前相鄰2個時間點比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），且穴位注射后6 h、8 h的降糖作用明顯強于A組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），提示PVP緩釋劑延長了胰島素的降糖作用。

表1　各組不同時間點降糖率比較（±s,%）

表1　各組不同時間點降糖率比較（±s,%）

注： 與C 組比較1）P＜0.01；與A 組比較2）P＜0.01；與同組前1 個時間點比較3）P＜0.01

組別　0.5 h（n=8）　3 h（n=8）　6 h（n=8）　8 h（n=8）　10 h（n=8）　24 h（n=8）A組　63.7±1.41）　86.2±1.01）3）　38.2±4.21）3）　33.5±3.41）　35.5±1.71）　37.5±1.61）B組　59.7±1.41）　85.2±0.71）3）　66.2±2.71）2）3）　49.2±3.21）2）3）　34.5±2.41）3）　33.8±2.11）C組　9.9±1.6　18.2±1.7　23.1±3.5　19.4±1.4　20.5±1.7　24.2±1.1

2.2各組不同時間點血清胰島素濃度比較

由表2可見，A組和B組同一時間點血清胰島素含量顯著高于C組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01或P＜0.05）。A組血清胰島素的含量變化較為明顯，在穴位注射后3 h到達高峰，之后隨著時間的延長血清胰島素含量逐漸下降，至6 h逐漸趨于穩(wěn)定。B組血清胰島素含量變化無明顯的峰值出現(xiàn)，且穴位注射后0.5 h、3 h、6 h、8 h 4個時間點的血清胰島素含量均顯著低于A組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。

表2　各組不同時間點血清胰島素濃度比較（±s,mU/L）

表2　各組不同時間點血清胰島素濃度比較（±s,mU/L）

注：與C組比較1）P＜0.01，2）P＜0.05；與A組比較3）P＜0.01，4）P＜0.05；與同組前1個時間點比較5）P＜0.05

組別　0.5 h（n=8）　3 h（n=8）　6 h（n=8）　8 h（n=8）　10 h（n=8）　24 h（n=8）A組　6.058±0.3812）　8.763±0.6001）5）　6.572±0.3181）5）　5.779±0.3501）　5.275±0.5871）　4.592±0.2921）B組　5.075±0.3044）　5.384±0.1543）　4.996±0.1752）3）　4.918±0.1302）4）　4.910±0.0502）　4.831±0.1441）C組　4.947±0.103　4.634±0.234　4.271±0.145　3.976±0.233　3.812±0.081　3.685±0.118

2.3各組大鼠血清胰島素含量與降糖率相關(guān)性分析結(jié)果

由表3可見，將各組大鼠不同時間點的血清胰島素含量與降糖率（小數(shù)表示）進行直線相關(guān)分析，結(jié)果顯示，A組大鼠血清胰島素含量與降糖率之間存在顯著正相關(guān)（P＜0.01）；B組大鼠血清胰島素含量與降糖率之間存在低度正相關(guān)（P＜0.05）；C組大鼠血清胰島素含量與降糖率之間并無明顯相關(guān)性（P＞0.05）。

表3　各組大鼠血清胰島素含量與降糖率相關(guān)性分析結(jié)果

2.4各組不同時間點大鼠“足三里”穴區(qū)組織刺激性實驗結(jié)果

2.4.1組織病理檢查

由圖1～3可見，穴位注射后3 h、10 h、24 h 3個時間點的各組大鼠“足三里”穴區(qū)肌纖維組織橫紋清晰、結(jié)構(gòu)完整，無明顯變性、壞死和炎性反應(yīng)，與A組比較無明顯病理變化，表明本實驗所采用的胰島素穴注緩釋技術(shù)對穴注周圍組織無明顯損害性刺激作用。

2.4.2各組大鼠“足三里”穴區(qū)組織刺激反應(yīng)

肉眼觀察在穴位注射后3 h、10 h、24 h 3個時間點各組大鼠“足三里”穴區(qū)組織刺激反應(yīng)，用刺激度［刺激度＝（陽性例數(shù)/總例數(shù)）×100%］表示。由表4可見，A組、B組和C組穴位注射后3 h、10 h、24 h 3個時間點的周圍組織刺激性反應(yīng)均無顯著性差異（P＞0.05）。

圖1　3 h穴位注射周圍組織光鏡觀察結(jié)果（HE染色×40）

圖2　10 h穴位注射周圍組織光鏡觀察結(jié)果（HE染色×40）

圖3　24 h穴位注射周圍組織光鏡觀察結(jié)果（HE染色×40）

表4　各組不同時間點大鼠足三里穴周圍肌肉刺激反應(yīng)評級結(jié)果?。ɡ?/p>

3　討論

穴位注射配合藥物緩釋技術(shù)具有穴效和藥效的整合效應(yīng)。在選穴適當(dāng)?shù)那闆r下，藥液注入穴位后，因其占有一定空間對周圍組織產(chǎn)生壓力從而刺激局部感受器產(chǎn)生酸、麻、脹等“針感”樣作用，以及藥液本身固有的藥理作用和藥物緩釋作用產(chǎn)生的持續(xù)的化學(xué)性刺激，均為穴位注射配合藥物緩釋技術(shù)發(fā)揮藥效的基礎(chǔ)，所以藥物在穴位內(nèi)作用持續(xù)時間的長短十分重要。Strudwick MW等［6］的研究表明，在同一穴位進行多次重復(fù)的注射可以明顯增強藥物對穴位的刺激。由此推測，利用藥物緩釋技術(shù)進行穴位注射，能獲得穴效與藥效的“整合效應(yīng)”［7］，即在低血藥濃度狀態(tài)下獲得藥效的“高效性”，在少次小劑量穴位藥物緩釋注射下獲得藥效的“長效性”。

本實驗對PVP混合胰島素緩釋穴位注射與胰島素常規(guī)穴位注射在穴位注射0.5 h、3 h、6 h、8 h、10 h和24 h 6個時間點的血清胰島素、血糖水平進行同步觀察。結(jié)果表明，穴注后0.5～8 h時間段B組血清胰島素含量明顯低于A組，但其降糖效應(yīng)優(yōu)于A組，表明藥物穴位注射效應(yīng)與血藥濃度無明確相關(guān)性。

此外，A組在各時點血清胰島素含量變化較大，與其降糖作用變化趨勢相同，均在穴位注射后3 h達到高峰隨即下降，至穴位注射6 h后血清胰島素含量變化相對平穩(wěn)，降糖作用也趨于穩(wěn)定；而B組各時間點之間的血清胰島素含量變化相對平穩(wěn)，檢測時點中均無明顯峰值出現(xiàn)，其降糖作用則于穴位注射后3 h到達高峰，至穴位注射后10 h才趨于穩(wěn)定，且穴位注射后6 h與8 h的降糖作用明顯強于A組。根據(jù)上述實驗結(jié)果分析，推測PVP緩釋劑起到了緩釋作用。而B組的這種降糖作用正是由于PVP以其獨特的理化特性及生理惰性，延緩了胰島素在穴區(qū)的釋放時間和作用強度，從而增加了胰島素對穴區(qū)的化學(xué)性刺激，產(chǎn)生出持久而有效的降糖作用［8］。

目前，PVP已作為助溶劑、分散劑及延效劑等廣泛應(yīng)用于可注射緩釋劑中，因其有高度的分散性和穩(wěn)定性，滅菌溫度下不影響助懸等性質(zhì)，常用做幫助主藥混懸的附加劑及延效劑，且PVP制得的混懸液很穩(wěn)定，組織中未見炎癥及免疫排斥反應(yīng)，具有良好的適應(yīng)性及可注射性。本研究所采用的穴位注射結(jié)合藥物緩釋技術(shù)是對穴位注射療法的一種改良試驗，有其一定的開發(fā)和應(yīng)用價值。

參考文獻

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【中圖分類號】R2-03

【文獻標志碼】A

DOI：10.13460/j.issn.1005-0957.2016.05.0608

文章編號：1005-0957（2016）05-0608-04

收稿日期2015-12-30

作者簡介：周慧（1989-），女，2013級碩士生，Email：250855167@qq.com

通信作者：林咸明（1966-），男，教授，Email：linxianming66@126.com

Hypoglycemic Effect of Acupoint Injection of Sustained-release Insulin at Different Times in SD Rats

ZHOU Hui，JIA Yan-tao，ZHANG Jiang-son，LIN Xian-ming.
Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine，Hangzhou 310053，China

［Abstract］ObjectiveTo observe blood glucose values and serum insulin levels at different times after acupoint injection of insulin with PVP as a sustained release agent and analyze the correlation between them in SD Rats.MethodsOne hundred and forty-four male SD rats were randomized into groups A （acupoint injection of insulin alone），B（acupoint injection of sustained-release insulin）and C（control）.At one hour after every group received an oral gavage of 40%glucose solution（2.2 g/kg），groups A and B were given point Zusanli injection and group C was not treated.In the three groups of rats，blood glucose values and serum insulin levels were measured at six time points：0.5，3，6，8，10 and 24 hours after acupoint injection（in group C at the corresponding time points）.In every group，the reaction of Point Zusanli region to the stimulation was observed by optical microscopy in at three time points：3，10 and 24 hours after acupoint injection.ResultsThe glucose-lowering rate reached its peak at 3 hours after acupoint injection and then declined in groups A and B.The hypoglycemic effect tended to be stable at 6 hours after acupoint injection in group A and at 10 hours after acupoint injection in group B.The hypoglycemic effect was better in group B than in group A at 6 and 8 hours after acupoint injection（P＜0.01）.In group A，serum insulin reached its peak at 3 hours and tended to be stable at 6 hours after acupoint injection（P＜0.05）.Serum insulin levels were significantly lower in group B than in group A at four time pints：0.5，3，6 and 8 hours after acupoint injection（P＜0.05）.An analysis of the correlation between rat serum insulin levels and the glucose-lowering rate showed a significant positive correlation in group A（P＜0.01）and a low positive correlation in group B（P＜0.05）.In groups A and B of rats，clear stripes and complete structure of muscle fibers were seen with no obvious degeneration，necrosis and inflammatory reaction around point Zusanli at three time points：3，8 and 24 hours after acupoint injection；there were no obvious pathological changes compared with group C.ConclusionsPVP as a sustained release agent can slow down the absorption rate of insulin in rat point Zusanli region.Meanwhile，it prolongs the continuous time of the hypoglycemic effect of insulin.There is a low correlation between serum insulin levels and the hypoglycemic effect，suggesting that acupoint injection with a sustained release agent can prolong the effect of acupoint injection of medicine.

［Key words］Acupoint injection；Sustained-release technique；Insulin；Hypoglycemic effect；Polyvinylpyrrolidone；Rats