龐　敏　盧慶萍　夏　冰　張宏福

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100193)

?

酪酸梭菌對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能、腸道組織形態(tài)及腸道通透性的影響

龐敏盧慶萍*夏冰張宏福

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100193)

摘要：本試驗(yàn)旨在研究酪酸梭菌對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能、腸道組織形態(tài)及腸道通透性的影響。試驗(yàn)選用21日齡斷奶、體重(5.35±1.33) kg的“杜×長(zhǎng)×大”三元雜交仔豬18頭，隨機(jī)分為3組，分別飼喂基礎(chǔ)飼糧(對(duì)照組)、基礎(chǔ)飼糧+500 mg/kg酪酸梭菌(酪酸梭菌組)、基礎(chǔ)飼糧+3 000 mg/kg氧化鋅(氧化鋅組)，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1頭豬，試驗(yàn)期14 d。結(jié)果表明：1)各組斷奶仔豬平均日增重與料重比無(wú)顯著差異(P>0.05)；酪酸梭菌組和氧化鋅組仔豬腹瀉率與對(duì)照組相比顯著降低(P<0.05)。2)與對(duì)照組相比，酪酸梭菌組和氧化鋅組斷奶仔豬回腸隱窩深度顯著降低(P<0.05)，絨腺比極顯著升高(P<0.01)。3)酪酸梭菌組和氧化鋅組斷奶仔豬第14天血清內(nèi)毒素與D-乳酸濃度均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，酪酸梭菌組與氧化鋅組之間無(wú)顯著差異(P>0.05)。4)與對(duì)照組相比，酪酸梭菌組和氧化鋅組斷奶仔豬回腸和結(jié)腸咬合蛋白(Occludin)mRNA表達(dá)量顯著升高(P<0.05)；與氧化鋅組相比，酪酸梭菌組斷奶仔豬回腸和結(jié)腸閉合小環(huán)蛋白-1(ZO-1)、Occludin mRNA表達(dá)量無(wú)顯著差異(P>0.05)。綜合以上結(jié)果，斷奶仔豬飼糧中添加酪酸梭菌可以顯著降低斷奶仔豬腹瀉率，改善腸黏膜形態(tài)，降低腸黏膜通透性，上調(diào)緊密連接蛋白的表達(dá)量，可達(dá)到與添加氧化鋅相同的效果。

關(guān)鍵詞：斷奶仔豬；酪酸梭菌；氧化鋅；腹瀉；腸道黏膜屏障

仔豬斷奶應(yīng)激(環(huán)境應(yīng)激、飼糧應(yīng)激、管理應(yīng)激、離開(kāi)母體等)會(huì)對(duì)仔豬生長(zhǎng)性能及自身腸道健康產(chǎn)生不良的影響，導(dǎo)致仔豬腹瀉、生長(zhǎng)緩慢、抵抗力下降等[1-2]。目前仔豬腹瀉仍是養(yǎng)豬生產(chǎn)中的難題。而生產(chǎn)中普遍存在將高劑量氧化鋅添加到飼糧中來(lái)達(dá)到預(yù)防仔豬腹瀉、促進(jìn)仔豬生長(zhǎng)的目的[3]。研究證明，氧化鋅以3 000 mg/kg劑量添加到斷奶仔豬飼糧中時(shí)，能顯著減少斷奶仔豬的腹瀉，提高仔豬的生長(zhǎng)性能[4-5]。有研究表明，飼糧中添加氧化鋅降低仔豬腹瀉率與腸道黏膜屏障改變有關(guān)[6-7]。然而，氧化鋅來(lái)源的高鋅雖然具有預(yù)防仔豬腹瀉、促進(jìn)生長(zhǎng)的作用，但其生物利用率很低。在斷奶仔豬中，只有5%～10%被機(jī)體利用，大部分都從糞尿中排出，對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重的污染，不利于養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)、健康發(fā)展[8-11]。

微生態(tài)制劑作為新型、環(huán)保的飼料添加劑越來(lái)越多地應(yīng)用于畜禽生產(chǎn)中，對(duì)降低仔豬腹瀉、提高仔豬生長(zhǎng)性能具有良好的效果，不同益生菌因菌株不同而功能各異。酪酸梭菌(Clostridiumbutyricum，CB)是動(dòng)物的正常腸道菌，因其產(chǎn)丁酸而又被命名為丁酸梭菌。有研究表明，飼糧中添加500 mg/kg的酪酸梭菌可以顯著改善斷奶仔豬小腸形態(tài)，提高仔豬免疫及抗氧化能力[12]。飼糧中添加酪酸梭菌可以有效地促進(jìn)肉雞的生長(zhǎng)性能和免疫功能[13]。Ling等[14]研究發(fā)現(xiàn)，酪酸梭菌可以減少小鼠腹瀉，促進(jìn)腸道組織修復(fù)，降低腸道通透性。目前關(guān)于酪酸梭菌在畜禽生產(chǎn)上的應(yīng)用已有一定的研究，但對(duì)緩解斷奶仔豬斷奶應(yīng)激，減少仔豬腹瀉及腸道通透性方面的研究還相對(duì)較少。本試驗(yàn)通過(guò)在斷奶仔豬飼糧中添加酪酸菌，以高劑量氧化鋅作為參比，研究酪酸梭菌對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能、腹瀉及緊密連接蛋白表達(dá)情況的影響，為氧化鋅替代產(chǎn)品的研發(fā)以及酪酸梭菌緩解斷奶應(yīng)激、改善仔豬腹瀉提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

酪酸梭菌購(gòu)自于青島某生物技術(shù)公司，活度為1×1010CFU/g，添加量為500 mg/kg；氧化鋅購(gòu)自于某國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，含鋅量≧79%，添加量為3 000 mg/kg。

1.2基礎(chǔ)飼糧

基礎(chǔ)飼糧為玉米-豆粕型，參照NRC(2012)營(yíng)養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)配制，不含抗生素，滿足斷奶仔豬(5～10 kg)營(yíng)養(yǎng)需要量?；A(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

1.3試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取健康、出生時(shí)間及胎次相近的21日齡斷奶“杜×長(zhǎng)×大”三元雜交仔豬18頭，體重(5.35±1.33) kg，隨機(jī)分為3組，分別飼喂基礎(chǔ)飼糧(對(duì)照組)、基礎(chǔ)飼糧+500 mg/kg酪酸梭菌(酪酸梭菌組，CB組)、基礎(chǔ)飼糧+3 000 mg/kg氧化鋅(氧化鋅組，ZnO組)，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1頭仔豬。

1.4飼養(yǎng)管理與屠宰

試驗(yàn)在動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室昌平實(shí)驗(yàn)基地進(jìn)行。試驗(yàn)期間仔豬自由采食、飲水。試驗(yàn)期共14 d，最后1 d所有仔豬屠宰采樣，分離回腸末端、結(jié)腸中段腸段，采集回腸、結(jié)腸組織及黏膜樣品。組織樣品采用4%多聚甲醛固定；黏膜樣品液氮預(yù)存，隨后轉(zhuǎn)移至-80 ℃保存。

1.5指標(biāo)測(cè)定

1.5.1生長(zhǎng)性能的測(cè)定

斷奶當(dāng)天(第1天)、試驗(yàn)第14天分別對(duì)所有仔豬(空腹)稱(chēng)重，記錄所有仔豬每天采食量，計(jì)算平均日增重、平均日采食量及料重比。

表1　基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1　Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis)　%

1)預(yù)混料為每千克飼糧提供 Premix provided the following per kg of the diet：VA 1 500 IU，VD3200 IU，VE 10 IU，VK31 mg，VB10.9 mg，VB21 mg,VB129 μg，生物素 biotin 0.05 mg，葉酸 folic acid 0.3 mg，泛酸 pantothenate 10 mg，尼克酸 nicotinic acid 10 mg，Cu (as copper sulfate) 6 mg，F(xiàn)e (as ferrous sulfate) 100 mg，Zn (as zinc sulfate) 80 mg，Mn (as manganese sulfate) 4 mg，Se (as sodium selenite) 0.3 mg，I (as potassium iodide) 0.14 mg。

2)消化能為計(jì)算值，其余為實(shí)測(cè)值。DE was a calculated value and the others were measured values.

1.5.2腹瀉率的測(cè)定

每天觀察和記錄仔豬的腹瀉與健康情況，計(jì)算腹瀉率。

腹瀉率(%)=[試驗(yàn)期內(nèi)仔豬腹瀉頭數(shù)/

(試驗(yàn)天數(shù)×同組豬頭數(shù))]×100。

1.5.3腸道組織絨毛高度和隱窩深度的測(cè)定

仔豬屠宰后，剪取回腸末端約1 cm的腸環(huán)，用預(yù)冷的生理鹽水將其沖洗干凈，用4%多聚甲醛溶液固定過(guò)夜后，石蠟包埋，連續(xù)切片，蘇木精-伊紅(HE)染色，封固。光鏡(Nikon eclipse ci光學(xué)顯微鏡)觀察，拍照(Tucsen圖森CCD ICE5.0拍照系統(tǒng))，采用Image pro insight 8.0采集、測(cè)量圖片，每個(gè)切片選擇5～10個(gè)左右腸絨毛和隱窩測(cè)量腸絨毛長(zhǎng)度及隱窩深度。

1.5.4腸道組織杯狀細(xì)胞數(shù)量的測(cè)定

取回腸末端腸環(huán)(1 cm左右)，經(jīng)4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片，阿利新蘭-高碘酸雪夫氏(AB-PAS)染色，光學(xué)顯微鏡下對(duì)杯狀細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)(每個(gè)組織切片上選取5～10個(gè)完整腸絨毛)。判定標(biāo)準(zhǔn)：染成紅色的杯狀細(xì)胞為分泌中性黏蛋白的中性杯狀細(xì)胞；染成藍(lán)色的為分泌酸性黏蛋白的酸性杯狀細(xì)胞；染成藍(lán)紫色的為可分泌中性黏蛋白又可分泌酸性黏蛋白的杯狀細(xì)胞，即中性酸性杯狀細(xì)胞。

1.5.5腸道通透性指標(biāo)的測(cè)定

采集試驗(yàn)第3天、第7天及第14天仔豬(空腹)前腔靜脈血液，4 ℃靜置過(guò)夜，4 000 r/min(4 ℃)離心20 min，分離血清，分裝于0.5 mL離心管中，-80 ℃保存。采用D-乳酸試劑盒(D-lactate colorimetric assay,Sigma)和顯色基質(zhì)鱟試劑盒(含偶氮化試劑終點(diǎn)顯色法，廈門(mén)市鱟試劑實(shí)驗(yàn)廠有限公司)分別測(cè)定血清中D-乳酸和內(nèi)毒素的濃度。

1.5.6腸道黏膜緊密連接蛋白mRNA表達(dá)量的測(cè)定

回腸及結(jié)腸黏膜總RNA的提取采用Trizol試劑(Invitrogen)提取法進(jìn)行，按試劑盒(PrimeScriptTMRT reagent kit with gDNA Eraser,TaKaRa)操作步驟進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。實(shí)時(shí)熒光定量PCR以3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參基因，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性10 s；60 ℃退火并延伸40 s，循環(huán)40次；熒光的采集與熔解曲線的制作按照熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI的PRISM7500型熒光定量PCR儀)操作說(shuō)明進(jìn)行，咬合蛋白(Occludin)和閉合小環(huán)蛋白-1(ZO-1)mRNA表達(dá)量用2-△△Ct法計(jì)算。引物信息見(jiàn)表2，由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。

1.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

根據(jù)單因素完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，以SAS 9.2的MEANS模塊對(duì)基本統(tǒng)計(jì)量進(jìn)行分析，采用GLM模塊對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，采用Tukey法進(jìn)行多重比較，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

表2　引物序列信息Table 2　Primer sequences information

2結(jié)果

2.1酪酸梭菌對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能和腹瀉率的影響

由表3可知，試驗(yàn)期內(nèi)各組斷奶仔豬平均日增重與料重比均沒(méi)有顯著差異(P>0.05)。與對(duì)照

組相比，酪酸梭菌組和氧化鋅組斷奶仔豬1～7 d腹瀉率分別降低了44.45%、66.67%(P<0.05)，1～14 d腹瀉率分別降低了46.88%、62.49%(P<0.05)。酪酸梭菌組與氧化鋅組斷奶仔豬腹瀉率在試驗(yàn)期內(nèi)差異不顯著(P>0.05)。

表3　斷奶仔豬生長(zhǎng)性能和腹瀉率Table 3　Growth performance and diarrhea rate of weaning piglets

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)相同或無(wú)字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫(xiě)字母表示差異極顯著(P<0.01)。下表同。

In the same row, values with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), and with different capital letter superscripts mean significant difference (P<0.01). The same as below.

2.2酪酸梭菌對(duì)斷奶仔豬腸道組織形態(tài)與杯狀細(xì)胞數(shù)量的影響

由表4可知，與對(duì)照組相比，酪酸梭菌組和氧化鋅組斷奶仔豬回腸隱窩深度顯著降低(P<0.05)，回腸絨毛高度增加(P>0.05)，絨腺比極顯著增加(P<0.01)；酪酸梭菌組和氧化鋅組斷奶仔豬回腸總杯狀細(xì)胞數(shù)量無(wú)顯著差異(P>0.05)，但氧化鋅組斷奶仔豬中性酸性杯狀細(xì)胞數(shù)量顯著增多(P<0.05)。氧化鋅組與酪酸梭菌組斷奶仔豬的總杯狀細(xì)胞數(shù)量與對(duì)照組相比有增多的趨勢(shì)(P>0.05)。由圖1可知，酪酸梭菌組和氧化鋅組斷奶仔豬在回腸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)上無(wú)明顯差異。

表4　斷奶仔豬回腸組織形態(tài)和杯狀細(xì)胞數(shù)量Table 4　Ileum morphology and goblet cell number of weaning piglets

2.3酪酸梭菌對(duì)斷奶仔豬腸道通透性的影響

由表5可知，各組斷奶仔豬血清內(nèi)毒素與D-乳酸濃度從試驗(yàn)第7天開(kāi)始出現(xiàn)差異，與對(duì)照組相比，氧化鋅組斷奶仔豬第7天血清內(nèi)毒素濃度顯著降低(P<0.05)，氧化鋅組和酪酸梭菌組斷奶仔豬第14天血清內(nèi)毒素和D-乳酸濃度顯著降低(P<0.05)。酪酸梭菌組與氧化鋅組之間斷奶仔豬血清內(nèi)毒素和D-乳酸濃度無(wú)顯著差異(P>0.05)。

圖1　斷奶仔豬回腸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)圖Fig.1　Ileum morphological structure graphs of weaning piglets 表5　斷奶仔豬血清內(nèi)毒素和D-乳酸濃度 Table 5　Serum endotoxin and D-lactate concentration of weaning piglets

項(xiàng)目Items時(shí)間Time對(duì)照組Controlgroup氧化鋅組ZnOgroup酪酸梭菌組CBgroupP值P-value標(biāo)準(zhǔn)誤SEM內(nèi)毒素Endotoxin/(EU/mL)3天Day30.2410.2320.2130.18590.0067天Day70.194a0.129b0.149ab0.04350.01114天Day140.116a0.081b0.065b0.01050.011D-乳酸D-lactate/(ng/μL)3天Day3103.69106.28113.900.958614.0257天Day7124.0553.4250.890.062514.79314天Day1486.32a26.84b26.33b0.025810.994

由表6可知，與對(duì)照組相比，氧化鋅組和酪酸梭菌組斷奶仔豬回腸和結(jié)腸OccludinmRNA表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，酪酸梭菌組回腸和結(jié)腸ZO-1 mRNA表達(dá)量無(wú)顯著差異(P>0.05)，氧化鋅組回腸ZO-1 mRNA表達(dá)量顯著升高(P<0.05)。與氧化鋅組相比，酪酸梭菌組斷奶仔豬回腸和結(jié)腸ZO-1與OccludinmRNA表達(dá)量均無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表6　斷奶仔豬腸道ZO-1及Occludin mRNA表達(dá)量Table 6　The mRNA expression of ZO-1 and Occludin in intestine of weaning piglets

3討論

仔豬斷奶是養(yǎng)豬生產(chǎn)中的重要環(huán)節(jié)，斷奶應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致仔豬腹瀉、生長(zhǎng)緩慢等問(wèn)題，生產(chǎn)中常以高劑量氧化鋅來(lái)解決此問(wèn)題。在本試驗(yàn)中，氧化鋅組斷奶仔豬在試驗(yàn)前7 d及試驗(yàn)全期腹瀉率均顯著降低，這與Zhang等[6]及Hu等[15-16]研究結(jié)果一致。同時(shí)酪酸梭菌組仔豬腹瀉情況與氧化鋅組之間無(wú)顯著差異，說(shuō)明酪酸梭菌在對(duì)抗仔豬腹瀉方面表現(xiàn)出了與氧化鋅同樣的效果。但在本研究中，試驗(yàn)期內(nèi)各組斷奶仔豬之間生長(zhǎng)性能沒(méi)有顯著差異。這與部分研究結(jié)果氧化鋅可以促進(jìn)仔豬生長(zhǎng)性能的結(jié)果[6,16-17]不一致，但也有報(bào)道發(fā)現(xiàn)斷奶仔豬飼糧中添加1 000、2 000和3 000 mg/kg氧化鋅時(shí)，2周內(nèi)無(wú)顯著促生長(zhǎng)作用[18]。劉婷婷等[12]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中單獨(dú)添加酪酸梭菌時(shí)對(duì)斷奶仔豬的生長(zhǎng)性能有增加的趨勢(shì)，但與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異。本試驗(yàn)期內(nèi)各組之間生長(zhǎng)性能無(wú)顯著差異可能與試驗(yàn)期較短，仔豬組內(nèi)個(gè)體之間存在一定的差異有關(guān)。

仔豬腹瀉往往與腸道的健康密切相關(guān)，仔豬斷奶后，腸道組織形態(tài)會(huì)因斷奶應(yīng)激發(fā)生改變，表現(xiàn)在絨毛高度降低，隱窩深度加深，腸黏膜細(xì)胞增殖能力下降，并且會(huì)隨著斷奶時(shí)間的提前而加重[19]。Carlson等[20]報(bào)道，補(bǔ)飼高劑量氧化鋅能改善腸道形態(tài)，使腸道隱窩變深，絨毛變長(zhǎng)。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，3 000 mg/kg氧化鋅能顯著增加小腸黏膜的絨毛高度及相關(guān)基因在mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)量[4,21]。鋅作為腸道上皮細(xì)胞發(fā)育成熟的必需微量元素，有利于改善腸道形態(tài)，增加蛋白質(zhì)合成和腸道細(xì)胞的增殖[11,17]。在本試驗(yàn)中，氧化鋅組和酪酸梭菌組斷奶仔豬隱窩深度顯著降低，絨腺比顯著提高，說(shuō)明酪酸梭菌與氧化鋅一樣抵御了腸道組織形態(tài)受損。這可能與酪酸梭菌在體內(nèi)可代謝產(chǎn)生丁酸有關(guān)，丁酸是腸道上皮組織細(xì)胞再生和修復(fù)的主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，對(duì)腸道組織形態(tài)的修復(fù)和改善同樣具有重要作用[12]。

杯狀細(xì)胞是特化的腸上皮細(xì)胞，能夠分泌黏蛋白，附著在腸黏膜表面，與腸道健康有著密切聯(lián)系[22]。新形成的杯狀細(xì)胞分泌中性黏液，而成熟度較高的杯狀細(xì)胞則以分泌酸性黏液為主，酸性黏液對(duì)有害微生物具有更強(qiáng)的抵御作用[5,23]。本試驗(yàn)中，飼喂氧化鋅仔豬回腸中性酸性杯狀細(xì)胞數(shù)量顯著增多，總杯狀細(xì)胞數(shù)量有增多的趨勢(shì)，這與Liu等[24]研究結(jié)果相一致。而飼喂酪酸梭菌斷奶仔豬在總杯狀細(xì)胞數(shù)量上與飼喂氧化鋅一樣均有增多的趨勢(shì)。從各種杯狀細(xì)胞數(shù)量來(lái)看，仔豬腸道細(xì)胞的增殖處于發(fā)育初期，進(jìn)一步說(shuō)明鋅具有促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的作用，而酪酸梭菌的作用要弱于氧化鋅，這可能與益生菌間接作用于腸道黏膜細(xì)胞有關(guān)。

腸道屏障的完整是腸道正常行使功能的基礎(chǔ)，而腸道屏障受損會(huì)使其通透性增大[16]。大量研究發(fā)現(xiàn)斷奶應(yīng)激會(huì)損傷腸道黏膜屏障，增大腸道通透性[15,25-27]。血清D-乳酸和內(nèi)毒素濃度可以作為腸道通透性的指標(biāo)，反映腸道通透性的大小[7,16,28]。正常情況下，血清中D-乳酸和內(nèi)毒素的濃度很少，當(dāng)腸道通透性加大時(shí)，其血清濃度會(huì)上升。在本試驗(yàn)中，仔豬斷奶前期血清內(nèi)毒素和D-乳酸濃度顯著升高，說(shuō)明斷奶應(yīng)激對(duì)腸道通透性具有極大的影響，損傷了腸道黏膜結(jié)構(gòu)，破壞了腸道菌群，使得菌群分泌的內(nèi)毒素和D-乳酸滲透入血。從試驗(yàn)第7天開(kāi)始飼喂酪酸梭菌與氧化鋅仔豬血清內(nèi)毒素和D-乳酸濃度顯著下降，緩解了由斷奶應(yīng)激引起的腸道通透性加大，腹瀉率上升。這表明飼糧中添加氧化鋅或酪酸梭菌協(xié)助了仔豬自身腸道的修復(fù)，進(jìn)一步說(shuō)明高鋅和酪酸梭菌減少腹瀉與腸道通透性的改變有關(guān)。

腸道通透的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)是緊密連接蛋白，其中ZO-1和Occludin常被用來(lái)作為觀察緊密連接屏障功能和通透性功能的指標(biāo)[7,29]。Zhang等[6]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加2 000 mg/kg氧化鋅可以顯著增加回腸ZO-1及OccludinmRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)量。本試驗(yàn)中，飼喂酪酸梭菌或氧化鋅斷奶仔豬回腸和結(jié)腸OccludinmRNA表達(dá)量顯著升高，氧化鋅組回腸ZO-1 mRNA表達(dá)量顯著升高，飼喂酪酸梭菌仔豬回腸ZO-1 mRNA表達(dá)量有升高的趨勢(shì)。可見(jiàn)二者對(duì)腸道黏膜完整性具有相同的作用。在應(yīng)激情況下，細(xì)菌和內(nèi)毒素可以通過(guò)調(diào)節(jié)或影響一些細(xì)胞因子及蛋白激酶C等來(lái)調(diào)控ZO-1和跨膜蛋白Occludin的表達(dá)，從而降低腸上皮細(xì)胞的屏障功能[30]。有研究表明，上皮細(xì)胞緊密連接蛋白的基因表達(dá)與腸道細(xì)菌的代謝產(chǎn)物(如丁酸、磷壁酸)有關(guān)[31]。因此，酪酸梭菌可能通過(guò)在體內(nèi)代謝產(chǎn)生丁酸或改變腸道微生態(tài)，改善腸道組織形態(tài)，上調(diào)腸上皮緊密連接蛋白基因表達(dá)，進(jìn)而達(dá)到降低腸道通透性，減少腹瀉的目的。

4結(jié)論

在本試驗(yàn)中，斷奶仔豬飼糧中添加500 mg/kg酪酸梭菌或3 000 mg/kg氧化鋅能夠顯著降低腹瀉率，改善腸黏膜形態(tài)，降低腸道通透性，上調(diào)緊密連接蛋白基因的表達(dá)，從而保護(hù)腸道黏膜屏障功能，減弱早期斷奶應(yīng)激引起的不利影響。

參考文獻(xiàn)：

[1]HEO J M,OPAPEJU F O,PLUSKE J R,et al.Gastrointestinal health and function in weaned pigs:a review of feeding strategies to control post-weaning diarrhoea without using in-feed antimicrobial compounds[J].Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition,2013,97(2):207-237.

[3]楊懷兵,李輝,黃建國(guó),等.高鋅在斷奶仔豬日糧中的應(yīng)用效果研究概述[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī),2013,40(12):220-223.

[4]LI X L,YIN J D,LI D F,et al.Dietary supplementation with zinc oxide increasesIGF-Ⅰ andIGF-Ⅰ receptor gene expression in the small intestine of weanling piglets[J].The Journal of Nutrition,2006,136(7):1786-1791.

[5]OU D Y,LI D F,CAO Y H,et al.Dietary supplementation with zinc oxide decreases expression of the stem cell factor in the small intestine of weanling pigs[J].The Journal of Nutritional Biochemistry,2007,18(12):820-826.

[6]ZHANG B K,GUO Y M.Supplemental zinc reduced intestinal permeability by enhancing occludin and zonula occludens protein-1 (ZO-1) expression in weaning piglets[J].British Journal of Nutrition,2009,102(5):687-693.

[7]胡彩虹,錢(qián)仲倉(cāng),劉海萍,等.高鋅對(duì)早期斷奶仔豬腸黏膜屏障和腸上皮細(xì)胞緊密連接蛋白表達(dá)的影響[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2009,40(11):1638-1644.

[8]HU C H,XIAO K,SONG J,et al.Effects of zinc oxide supported on zeolite on growth performance,intestinal microflora and permeability,and cytokines expression of weaned pigs[J].Animal Feed Science and Technology,2013,181(1/2/3/4):65-71.

[9]VERSTEGEN M W A,WILLIAMS B A.Alternatives to the use of antibiotics as growth promoters for monogastric animals[J].Animal Biotechnology,2002,13(1):113-127.

[10]王超.包膜氧化鋅促仔豬生長(zhǎng)效果及機(jī)理研究[D].博士學(xué)位論文.杭州:浙江大學(xué),2013:13-16.

[11]CARLSON M S,HILL G M,LINK J E.Early- and traditionally weaned nursery pigs benefit from phase-feeding pharmacological concentrations of zinc oxide:effect on metallothionein and mineral concentrations[J].Journal of Animal Science,1999,77(5):1199-1207.

[12]劉婷婷,張帥,鄧斐月,等.谷氨酰胺與丁酸梭菌對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能、免疫功能、小腸形態(tài)和腸道菌群的影響[J].動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào),2011,23(6):998-1005.

[13]YANG C M,CAO G T,FERKET P R,et al.Effects of probiotic,Clostridiumbutyricum,on growth performance,immune function,and cecal microflora in broiler chickens[J].Poultry Science,2012,91(9):2121-2129.

[14]LING Z X,LIU X,CHENG Y W,et al.Clostridiumbutyricumcombined withBifidobacteriuminfantisprobiotic mixture restores fecal microbiota and attenuates systemic Inflammation in mice with antibiotic-associated diarrhea[J].BioMed Research International,2015,2015:582048.

[15]HU C H,XIAO K,LUAN Z S,et al.Early weaning increases intestinal permeability,alters expression of cytokine and tight junction proteins,and activates mitogen-activated protein kinases in pigs[J].Journal of Animal Science,2013,91(3):1094-1101.

[16]HU C H,GU L Y,LUAN Z S,et al.Effects of montmorillonite-zinc oxide hybrid on performance,diarrhea,intestinal permeability and morphology of weanling pigs[J].Animal Feed Science and Technology,2012,177(1/2):108-115.

[17]胡彩虹,游兆彤,朱康,等.納米氧化鋅對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能和腸黏膜屏障的影響[J].動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào),2012,24(2):285-290.

[18]計(jì)峰,羅緒剛,李素芬,等.高鋅對(duì)斷乳仔豬促生長(zhǎng)作用及其機(jī)理的研究進(jìn)展[J].動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào),2003,15(3):1-5.

[19]顧憲紅,張宏福,佘銳萍,等.斷奶日齡對(duì)消化器官形態(tài)及小腸組織化學(xué)的影響[J].家畜生態(tài),2003,24(1):24-30.

[20]CARLSON M S,HOOVER S L,HILL G M,et al.Effect of pharmacological zinc on intestinal metallothionein concentration and morphology in the nursery pig[J].Journal of Animal Science,1998,76(Suppl.1):57.

[21]申俊華,周安國(guó),王之盛,等.包被氧化鋅對(duì)斷奶仔豬腹瀉指數(shù)及腸道發(fā)育的影響[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2013,44(6):894-900.

[22]DEPLANCKE B,GASKINS H R.Microbial modulation of innate defense:goblet cells and the intestinal mucus layer[J].The American Journal of Clinical Nutrition,2001,73(6):1131S-1141S.

[23]隋欣.益生菌對(duì)雛雞腸道杯狀細(xì)胞數(shù)量及黏蛋白2含量的影響[D].碩士學(xué)位論文.哈爾濱:東北農(nóng)業(yè)大學(xué),2014:45-46

[24]LIU P,PIEPER R,RIEGER J,et al.Effect of dietary zinc oxide on morphological characteristics,mucin composition and gene expression in the colon of weaned piglets[J].PLoS One,2014,9(3):e91091.

[25]PEACE R M,CAMPBELL J,POLO J,et al.Spray-dried porcine plasma influences intestinal barrier function,inflammation,and diarrhea in weaned pigs[J].The Journal of Nutrition,2011,141(7):1312-1317.

[26]KIM J C,HANSEN C F,MULLAN B P,et al.Nutrition and pathology of weaner pigs:nutritional strategies to support barrier function in the gastrointestinal tract[J].Animal Feed Science and Technology,2012,173(1/2):3-16.

[27]SMITH F,CLARK J E,OVERMAN B L,et al.Early weaning stress impairs development of mucosal barrier function in the porcine intestine[J].American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology,2010,298(3):G352-G363.

[28]ZHAO Y,QIN G X,SUN Z W,et al.Effects of soybean agglutinin on intestinal barrier permeability and tight junction protein expression in weaned piglets[J].International Journal of Molecular Sciences,2011,12(12):8502-8512.

[29]BERKES J,VISWANATHAN V K,SAVKOVIC S D,et al.Intestinal epithelial responses to enteric pathogens:effects on the tight junction barrier,ion transport,and inflammation[J].Gut,2003,52(3):439-451.

[30]WEILER F,MARBE T,SCHEPPACH W,et al.Influence of protein kinase C on transcription of the tight junction elements ZO-1 and occludin[J].Journal of Cellular Physiology,2005,204(1):83-86.

[31]宦海琳,白建勇,周維仁,等.抗菌肽對(duì)仔豬血清生化指標(biāo)、腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)及空腸上皮緊密連接蛋白基因相對(duì)表達(dá)量的影響[J].動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào),2015,27(12):3797-3804.

(責(zé)任編輯武海龍)

doi：10.3969/j.issn.1006-267x.2016.07.016

收稿日期：2016-01-21

基金項(xiàng)目：國(guó)家科技支撐項(xiàng)目(2012BAD39B01)；中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)(ASTIP-IAS07)

作者簡(jiǎn)介：龐敏(1990—)，女，山東淄博人，碩士研究生，從事單胃動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)研究。E-mail: pangmin_caas@163.com *通信作者：盧慶萍，副研究員，碩士生導(dǎo)師，E-mail: luqingping@sina.com

中圖分類(lèi)號(hào)：S828

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1006-267X(2016)07-2113-09

*Corresponding author, associate professor, E-mail: luqingping@sina.com

Effects ofClostridiumbutyricumon Growth Performance,Intestinal Morphology and Intestinal Permeability of Weanling Piglets

PANG MinLU Qingping*XIA BingZHANG Hongfu

(State Key Laboratory of Animal Nutrition, Institute of Animal Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China)

Abstract:The purpose of this study was to evaluate the effects of Clostridium butyricum on growth performance, intestinal morphology and intestinal permeability of weaning piglets. Eighteen ‘Duroc×Landrace×Yorkshire’ crossbred piglets with an average body weight of (5.35±1.33) kg were weaned at 21 days of age and randomly allocated into three groups: basal diet group (control group), basal diet+500 mg/kg Clostridium butyricum group (CB group) and basal diet+3 000 mg/kg zinc oxide group (ZnO group). Each group had six replicates, and each replicate had one piglet. The experiment lasted for 14 days. The results showed as follows: 1) there were no significant differences on average daily gain and feed to gain ratio among three groups (P>0.05). The diarrhea rate of weaning piglets in CB group and ZnO group was significantly lower than that in control group (P<0.05). 2) Compared with the control group, the crypt depth of weaning piglets in CB group and ZnO group significantly decreased (P<0.05), and the ratio of villus height to crypt depth significantly increased (P<0.01). 3) On the day 14, the serum endotoxin and D-lactic acid concentrations of weaning piglets in CB group and ZnO group significantly decreased compared with control group (P<0.05), and no significant difference between CB group and ZnO group was found (P>0.05). 4) Compared with the control group, the mRNA expression of Occludin in ileum and colon of weaning piglets in CB group and ZnO group significantly increased (P<0.05); compared with ZnO group, the mRNA expression of zonula occludens-1 (ZO-1) and Occludin in ileum and colon of weaning piglets in CB group had no significant difference (P>0.05). The results indicate that the dietary supplemented with Clostridium butyricum can decrease diarrhea rate and intestinal permeability, while improve intestinal mucosal morphology and tight junction protein expression. Dietary supplemented with Clostridium butyricum is comparable to the effect of the dietary supplemented with zinc oxide.[Chinese Journal of Animal Nutrition, 2016, 28(7)：2113-2121]

Key words:weaning piglets; Clostridium butyricum; zinc oxide; diarrhea; intestinal mucosal barrier