李研東，李肖莉，金世清，王振來，韓 雪（.河北省獸藥監(jiān)察所，石家莊 050035；.河北科技大學，石家莊 050000）

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液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜內(nèi)標法測定牛奶中三聚氰胺的不確定度分析*

李研東1，李肖莉1，金世清1，王振來1，韓 雪2
（1.河北省獸藥監(jiān)察所，石家莊 050035；2.河北科技大學，石家莊 050000）

摘 要：根據(jù)國家標準GB/T 22388-2008第二法，采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜內(nèi)標法測定了牛奶中三聚氰胺含量，對整個測量過程的不確定度來源進行了分析，并對不確定度各分量進行了評定和合成。結(jié)果顯示，重復性測量不確定度分量對總不確定度的影響不明顯。因此，該實驗室牛奶中三聚氰胺含量的內(nèi)標測定方法準確性較高，達到國家相關(guān)標準規(guī)定的要求。

關(guān)鍵詞：牛奶中三聚氰胺 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜 內(nèi)標法 測量不確定度

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀：Acquicy UPLC Xevo Tq-S，美國Waters公司；三聚氰胺標準品：純度大于99%；三聚氰胺內(nèi)標：純度大于99%；固相萃取凈化柱：MCX型，美國Waters公司；電子分析天平：BP221S型，感量0.1 mg，德國Sartorius公司；電子天平：JJ2000型，感量0.01 g，上海精密科學儀器有限公司。

乙腈使用色譜純乙腈，默克公司；水使用超純水，屈臣氏公司。乙酸銨、三氯乙酸使用分析純試劑。

1.2 測量方法

試樣用三氯乙酸溶液一乙腈提取，經(jīng)陽離子交換固相萃取柱凈化后，用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進行測定，內(nèi)標法定量。測定步驟見圖1。

2 數(shù)學模型

待測樣品中三聚氰胺含量按公式計算（1）：

式中：X——待測樣品中三聚氰胺含量，mg/kg；

c——待測樣品中三聚氰胺濃度，μg/L；

V——待測樣品最終定容體積，ml；

m——樣品質(zhì)量，g；

f——稀釋倍數(shù)。

引入內(nèi)標校準因子進行計算（2）：

式中：A1——標準中三聚氰胺內(nèi)標峰面積；

A2——三聚氰胺標準對照品峰面積；

d2——標準中內(nèi)標液濃度；

d1——三聚氰胺標準液濃度；

3 識別和分析不確定度來源

LC-MS/MS內(nèi)標法測定三聚氰胺含量，其不確定度的來源包括以下幾個方面：（1）重復性測定引入的不確定度。（2）檢測方法引入的不確定度。（3）標準（內(nèi)、外標）工作溶液引入的不確定度：包括標準樣品引入的不確定度、標準樣品稱量引人的不確定度、標準工作溶液配制引入的不確定度、標準溶液添加引入的不確定度。（4）待測樣品溶液定容體積引入的不確定度。（5）待測樣品稱量引入的不確定度。（6）其它不確定度來源。充分考慮所有不確定度貢獻因素。

圖1 三聚氰胺測定過程

4 測量不確定度評定

4.1 重復測定引入的不確定度評定

實驗按照標準對同一牛奶樣品中的三聚氰胺采取10次平行測定，測定結(jié)果見表1。

計算重復性測量不確定度：

相對不確定度：

1.2 檢測方法引入的不確定度評定

通過測定加標樣品回收率的偏差分析來進行方法引入的不確定度評定。回收率結(jié)果見表2。

結(jié)果計算了20個樣品的平均回收率為90%，回收率標準偏差為16%。標準不確定度采用平均值的標準偏差：

檢測統(tǒng)計數(shù)據(jù)t用下式來計算：

這個數(shù)據(jù)與95%置信度，n-1自由度的雙邊臨界值tcrit比較（其中n=20是用來評估（Rec的測試結(jié)果的數(shù)目），t大于或等于tcrit值，說明Rec與1有顯著性差異。

4.3 標準工作溶液引入的標準不確定度。

標準溶液不確定度主要由標準品的純度和標準液移取、稀釋和定容等操作引起。

4.3.1 三聚氰胺標準品（內(nèi)標）的純度

4.3.2 標準樣品稱量引入的相對標準不確定度

用準確至0.1 mg的電子分析天平稱取100 mg三聚氰胺標準品，不確定度主要由環(huán)境、天平校準、稱量線性所產(chǎn)生。固體稱量受環(huán)境影響一般可忽略，而稱量線性在重復性中已經(jīng)評定，因此稱量過程中所引入的不確定度來自天平校準。天平最大誤差為0.1 mg，兩次減量法稱量引入的不確定度屬于B類不確定度。按均勻分布處理，其標準不確定度為：

標準樣品稱量引入的相對標準不確定度：

4.4 標準溶液配制引入的標準不確定度

標準工作溶液引入的相對標準不確定度為：

內(nèi)標與外標純度一致，配置方法一致，所以內(nèi)標引入的相對標準不確定度也是0.01。

4.5 待測樣品溶液定容引入的標準不確定度

該方法中待測樣品溶液的最終定容體積為1.0 ml，1 ml A級移液管的最大誤差為0.008 ml，按均勻分布處理，待測樣品溶液定容引入的標準不確定為urel（V樣）=0.004 6。

4.6 待測樣品稱量引入的不確定度

4.7 樣品中加入內(nèi)標溶液引入的不確定度

樣品中加入內(nèi)標溶液的測量不確定度與4.4的不確定度評定多了0.1 ml分度移液管的不確定度，少了一個10 ml容量瓶引起的不確定度，0.1 ml分度移液管容量允差為0.002 ml，經(jīng)計算得urel（V0.1）=0.012，因此樣品中加入內(nèi)標溶液引入的不確定度為：

表1 樣品中三聚氰胺測定的結(jié)果 　mg/kg

表2 加標樣品測定的回收率結(jié)果

4.8 串聯(lián)質(zhì)譜儀引入的不確定度

4.9 其它不確定度因素：牛奶樣品中三聚氰胺分布不均勻引入的不確定度

不均勻性是樣品的一種基本屬性，它體現(xiàn)了樣品各特性量值存在的分散性。當這種分散性相對于特性量值測量的分散性可以忽略時，認為樣品是均勻的。通過一個修正因子來反映的數(shù)學期望值應為1，但其不確定度卻不為零。而奶樣經(jīng)過搖勻處理，使其不均勻性降到最小，通過重復性測量已經(jīng)把不均勻性引入的不確定度包含在內(nèi)，因此不再單獨考慮。

5 合成不確定度

以上各不確定度分量互不相關(guān)，則三聚氰胺檢測結(jié)果的相對不確定度為：

6 擴展不確定度與測定結(jié)果的表示

參考文獻

［1］ GB/T 22388—2008 原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法

［2］ JJF 1059.1—2012測量不確定評定和表示

［3］ JJG 196—1990玻璃儀器檢定規(guī)程

*資助項目：河北省科技計劃項目（15277107D）；河北省自然科學基金（C2014208064）；河北省畜牧獸醫(yī)局科技項目（2014-1-03）