吳相永

摘 要：建立高效液相色譜法測定硫酸氫氯吡格雷有關(guān)物質(zhì)的方法。根據(jù)文獻(xiàn)資料[4，5]，采用高效液相色譜法，以手性色譜柱，建立了硫酸氫氯吡格雷的有關(guān)物質(zhì)測定方法，方法簡便，準(zhǔn)確。采用ULTRONES-OVM（Analytical）手性柱（150mm×4.6mm，5μm），色譜填料為L57。以0.01mol/L磷酸二氫鉀溶液-乙腈（75∶25）為流動相，檢測波長為220nm。硫酸氫氯吡格雷和雜質(zhì)B1之間的分離度大于2.5，符合要求。本方法具有簡便、快捷、準(zhǔn)確、靈敏和專屬性強(qiáng)的特點(diǎn)，符合本品有關(guān)物質(zhì)的測定要求。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜法；硫酸氫氯吡格雷；有關(guān)物質(zhì)測定

1 引言

硫酸氫氯吡格雷（Clopidogrelhydrogensulfate）是一種血小板聚集抑制劑，臨床上用于預(yù)防和治療因血小板高聚集狀態(tài)引起的心、腦及其他動脈的循環(huán)障礙疾病[1-3]。由法國Sanofi-Aventis原研，1998年美國上市，2001年在我國批準(zhǔn)上市，商品名波立維（ Plavix）。根據(jù)文獻(xiàn)資料[4，5]，采用高效液相色譜法，以手性色譜柱，建立了硫酸氫氯吡格雷的有關(guān)物質(zhì)測定方法。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試藥

儀器 安捷倫1100高效液相色譜儀帶二極管陣列檢測器

ULTRONES-OVM手性色譜柱（ 15cm×4.6mm，5μm）

梅特勒-托利多MX205分析天平

試藥 硫酸氫氯吡格雷對照品（ 中國藥品生物制品檢定所），批號：100819-200601

雜質(zhì)A：USP對照品（批號：G0H250），用于雜質(zhì)定量分析。

雜質(zhì)B：USP對照品（批號：G1H047），用于雜質(zhì)定量分析。

雜質(zhì)C：USP對照品（批號：F2H215），用于雜質(zhì)定量分析。

2.2 方法的建立

2.2.1檢測波長的選擇

將本品、雜質(zhì)A、雜質(zhì)B和雜質(zhì)C制成適當(dāng)溶液后進(jìn)行紫外掃描，結(jié)果本品和已知雜質(zhì)的紫外吸收行為類似，均在270nm、277nm和低波長附近處有最大吸收。由于多數(shù)物質(zhì)在低波長處均有吸收，且本品與已知雜質(zhì)的低波長區(qū)吸收強(qiáng)度遠(yuǎn)高于270nm，因此為更多的檢出未知雜質(zhì)，同時(shí)參考USP31版中硫酸氫氯吡格雷測定的檢測波長220nm，選擇低波長220nm作為有關(guān)物質(zhì)的測定波長。

2.2.2色譜條件的確定

參考國家標(biāo)準(zhǔn)（WS1-（X-471）-2003Z）[4]和USP31版藥典[5]的有關(guān)物質(zhì)檢測方法，并進(jìn)行了對比研究，最終選擇了本品的有關(guān)物質(zhì)檢測條件：采用ES-OVM柱；以0.01mol/L磷酸二氫鉀溶液-乙腈（75：25）為流動相；檢測波長：220nm；進(jìn)樣量：10μl；流速：1.0ml/min。

2.2.3系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

按上述色譜條件進(jìn)行試驗(yàn)，取雜質(zhì)對照品溶液進(jìn)樣，記錄色譜圖，出峰順序分別為雜質(zhì)A、雜質(zhì)B第一個(gè)異構(gòu)體（雜質(zhì)B1）、硫酸氫氯吡格雷、雜質(zhì)B第二個(gè)異構(gòu)體（雜質(zhì)B2）和雜質(zhì)C；取系統(tǒng)適用性試驗(yàn)用溶液進(jìn)樣，雜質(zhì)B第一個(gè)異構(gòu)體與硫酸氫氯吡格雷分離度不小于2.5，實(shí)際測得結(jié)果為3.3。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證與結(jié)果

2.3.1專屬性試驗(yàn)

分別量取溶劑空白、未破壞樣品、酸破壞、堿破壞、熱破壞、光破壞溶液各10μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果本品在酸、堿、熱及強(qiáng)光照射條件下均有不同程度的破壞，新增大的降解峰主要為雜質(zhì)A和雜質(zhì)C，并且與硫酸氫氯吡格雷峰分離良好，可知本方法專屬性高，適合對本品有關(guān)物質(zhì)的檢測。

2.3.2最低檢測限、定量限

取硫酸氫氯吡格雷對照品、雜質(zhì)A、雜質(zhì)B和雜質(zhì)C貯備液各適量，分別加流動相稀釋至峰響應(yīng)值約為基線噪音水平3倍、10倍的濃度，精密量取各供試液10μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計(jì)算最低檢測限和定量限。結(jié)果見表1。

2.3.3進(jìn)樣精密度試驗(yàn)

取雜質(zhì)對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，考察雜質(zhì)A、雜質(zhì)B1、硫酸氫氯吡格雷和雜質(zhì)C的峰面積變化情況，結(jié)果雜質(zhì)A、雜質(zhì)B1、硫酸氫氯吡格雷和雜質(zhì)C峰面積的RSD分別為3.0%、3.3%、1.8%、2.8%，RSD均小于10，說明本方法進(jìn)樣精密度良好，符合雜質(zhì)定量測定的要求。

2.3.4重復(fù)性試驗(yàn)

取本品約100mg，精密稱定，置200ml量瓶中，用甲醇5.0ml溶解后加流動相稀釋成至刻度，搖勻，作為供試品溶液。分別配制6份供試品溶液，各精密量取10μl進(jìn)樣分析，以外標(biāo)法計(jì)算已知雜質(zhì)的量，考察測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果雜質(zhì)A、雜質(zhì)B1、雜質(zhì)C峰面積的RSD分別為3.9%、5.4%、1.8%，均小于10%，說明本法重復(fù)性良好。

2.3.5線性試驗(yàn)

分別精密量取硫酸氫氯吡格雷對照品、雜質(zhì)A、雜質(zhì)B和雜質(zhì)C貯備液適量，加流動相逐級稀釋，得硫酸氫氯吡格雷、雜質(zhì)A、雜質(zhì)B1和雜質(zhì)C的線性試驗(yàn)溶液。精密量取各溶液10?l分別進(jìn)樣，記錄色譜圖。

以峰面積A為縱坐標(biāo)、濃度c為橫坐標(biāo)做線性回歸，得雜質(zhì)A、雜質(zhì)C、硫酸氫氯吡格雷、雜質(zhì)B1的曲線分別為：A = 21.365c -1.4165，r=0.9981，A = 15.156c-0.2251，r=0.9979，A = 17.724c + 3.8769，r=0.9995，A = 19.711c -0.1161，r=0.9995。試驗(yàn)結(jié)果表明雜質(zhì)A在濃度0.41～4.88μg/ml，雜質(zhì)B1在濃度0.6～11.46μg/ml，雜質(zhì)C在濃度3.43～12.21μg/ml，硫酸氫氯吡格雷在濃度0.36～3.98μg/ml范圍內(nèi)，濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.3.6回收率試驗(yàn)

采用加樣回收的方法對雜質(zhì)A、B和C進(jìn)行了回收率試驗(yàn)研究。

雜質(zhì)A對照品母液的配制：取雜質(zhì)A適量，用甲醇溶解并稀釋至每1ml含雜質(zhì)A約40μg的溶液，即得。

雜質(zhì)B對照品母液的配制：取雜質(zhì)B適量，用甲醇溶解并稀釋至每1ml含雜質(zhì)B約120μg的溶液，即得。

雜質(zhì)C對照品母液的配制：取雜質(zhì)C適量，用甲醇溶解并稀釋至每1ml含雜質(zhì)C約200μg的溶液，即得。

供試品溶液的配制：取本品約100mg，置200ml量瓶中，加甲醇5.0ml溶解后加流動相稀釋至刻度，搖勻，作為樣品貯備母液；取5ml，置10ml量瓶中，分別加雜質(zhì)A對照品母液、雜質(zhì)B對照品母液和雜質(zhì)C對照品母液各0.8ml、1.0ml和1.2ml，得含有80%、100%和120%雜質(zhì)的供試品溶液，每份各平行配制三次。

精密量取上述供試品溶液各10μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以外標(biāo)法計(jì)算加入雜質(zhì)的含量，計(jì)算回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果雜質(zhì)A、雜質(zhì)B1、雜質(zhì)C回收率分別為106.7%、106.1%、101.6%，RSD分別為4.4%、5.8%、2.7%。由上述試驗(yàn)結(jié)果可知，雜質(zhì)A、雜質(zhì)B1和雜質(zhì)C的回收率良好，均在80%～120%之間，且RSD%均小于10，滿足已知雜質(zhì)定量測定的要求

2.3.7耐用性試驗(yàn)

在確定的有關(guān)物質(zhì)測定方法的基礎(chǔ)上，分別考察了流動相比例變化±5%、柱溫變化±5℃和流速變化±0.2 ml/min對有關(guān)物質(zhì)測定結(jié)果的影響。試驗(yàn)結(jié)果表面，當(dāng)溫度、流速和流動相比例發(fā)生略微改變時(shí)，有關(guān)物質(zhì)的測定結(jié)果基本不受影響。

2.3.8有關(guān)物質(zhì)測定的溶液穩(wěn)定性

取本品約100mg置200ml量瓶中，加甲醇5.0ml溶解后加流動相稀釋成至刻度，搖勻，室溫下放置，分別于0、2、4、8小時(shí)進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果表明本品的有關(guān)物質(zhì)溶液在8小時(shí)內(nèi)基本穩(wěn)定，滿足分析測定的需要。

3 討論

3.1 本文采用手性色譜柱，能使主成分及各雜質(zhì)有效分離，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，滿足測定要求；

3.2本法測定硫酸氫氯吡格雷有關(guān)物質(zhì)， 專屬性強(qiáng)， 結(jié)果準(zhǔn)確、 靈敏、 快速。為硫酸氫氯吡格雷的質(zhì)量控制提供了值得借鑒的方法。

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