舒莉萍， 何志旭， 許　威， 丁可軍

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 組織工程和干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中心, 貴州 貴陽　550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心, 貴州 貴陽　550004； 3.貴州醫(yī)科大學(xué) 免疫學(xué)教研室, 貴州 貴陽　550004； 4.貴州醫(yī)科大學(xué) 兒科學(xué)教研室, 貴州 貴陽　550004)

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Irx5a在野生型斑馬魚早期發(fā)育中的表達(dá)*

舒莉萍1,2,3， 何志旭1,4**， 許威4， 丁可軍4

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 組織工程和干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中心, 貴州 貴陽550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心, 貴州 貴陽550004； 3.貴州醫(yī)科大學(xué) 免疫學(xué)教研室, 貴州 貴陽550004； 4.貴州醫(yī)科大學(xué) 兒科學(xué)教研室, 貴州 貴陽550004)

[摘要]目的： 觀測Irx5a基因在Tuebingen野生型斑馬魚胚胎發(fā)育過程中的表達(dá)。方法： 利用Trizol法提取斑馬魚胚胎的總RNA，應(yīng)用RT-PCR方法擴(kuò)增Irx5a 基因，將其克隆入pCS2+質(zhì)粒中，經(jīng)菌落PCR、雙酶切法及DNA測序鑒定正確后，利用體外轉(zhuǎn)錄體系制備Irx5a的反義mRNA探針；用該反義mRNA探針進(jìn)行斑馬魚全胚胎原位雜交。結(jié)果： 構(gòu)建和鑒定了Irx5a-pCS2+重組質(zhì)粒，經(jīng)斑馬魚全胚胎原位雜交檢測Irx5a基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)從3.7 hpf開始有表達(dá)，并且在胚胎神經(jīng)系統(tǒng)和造血系統(tǒng)都有明顯表達(dá)。結(jié)論： Irx5a基因可能參與了Tuebingen野生型斑馬魚胚胎發(fā)育早期的神經(jīng)系統(tǒng)和造血系統(tǒng)的發(fā)育。

[關(guān)鍵詞]Irx5a； pCS2+質(zhì)粒； DNA,重組； RNA探針； 全胚胎原位雜交技術(shù)

Irx基因(Iroquoisgene)是Bosse等[1]于1996年在研究果蠅的外部感知器官形成過程中最早發(fā)現(xiàn)的一類重要的同源盒基因家族，主要有Irx1、Irx2、Irx3、Irx4、Irx5和Irx6共6個(gè)家族成員，其中Irx5在早期胚胎發(fā)育過程中起重要作用，主要與肺組織分化及視網(wǎng)膜視錐細(xì)胞形成有關(guān)[2-3]。Irx5對(duì)小鼠的心肌發(fā)育也有重要作用[4]，但其作用機(jī)制尚不明確。本研究以斑馬魚作為研究對(duì)象，構(gòu)建pCS2+-Irx5a重組質(zhì)粒，通過體外轉(zhuǎn)錄獲得Irx5a基因的地高辛標(biāo)記的反義mRNA探針，并用全胚胎原位雜交技術(shù)(whole mount in situ hybridization，WISH)檢測了Irx5a基因在野生型Tuebingen斑馬魚發(fā)育過程中的基因表達(dá)，探討Irx5a基因在斑馬魚發(fā)育過程中的作用。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑

野生型Tuebingen斑馬魚系，養(yǎng)殖在帶有過濾消毒系統(tǒng)、(28±2)℃恒溫的循環(huán)水系統(tǒng), 光照時(shí)間12 h/d[5]，課題組自行繁育。pCS2+質(zhì)粒和DH5α菌株由本研究中心留存、PCR引物由北京三博遠(yuǎn)志生物有限公司合成，Trizol、First-strand plus kit購于Invitrogen公司；質(zhì)粒小抽試劑盒購于Axygen公司，DNA凝膠回收試劑盒購于上海申能公司，BamH I和EcoR I內(nèi)切酶、T4連接酶均購于FBI公司，KOD DNA聚合酶購于TOYOBO公司，T3 RNA polymease和spin column購于Ambion公司，地高辛RNA標(biāo)記和檢測試劑盒及NucAwaylM Spin Columns購于Ambion公司，BCIP/NBT購于VECTOR Lab。

1.2方法

1.2.1斑馬魚胚胎總RNA提取分別收集受精后0.75～72 h(hours post-fertilization，hpf)不同時(shí)相的Tuebingen野生型斑馬魚胚胎, 胚胎脫膜后,收集于1.5 mL的Epp管中，移入1 mL Trizol將其充分勻漿, 室溫下放置5 min，用酚氯仿法提取總RNA，75%乙醇洗滌,加入適量DEPC水溶解，冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2Irx5a基因擴(kuò)增采用逆轉(zhuǎn)錄-PCR(RT-PCR)方法，以抽提的斑馬魚總RNA為模板，利用SuperScriptTMⅢ First-Strand Systhesis System kit的隨機(jī)引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)在AG22331型熱循環(huán)儀(eppendorf公司)上按試劑盒說明操作步驟進(jìn)行。擴(kuò)增Irx5a目的基因，PCR上下游引物分別引入BamH I及EcoR I酶切位點(diǎn)。上游引物(F)序列為5′-CGGGATCCTATGGAGACCCAGCTT-3′，下游引物(R)序列為5′-CGGAATTCAGAACGGAGGGAGAGG-3′；以逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，進(jìn)行Irx5a的RT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：40 ℃ 30 min，94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸2 min，共30次循環(huán)，72 ℃最后延伸10 min， PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，以DNA膠回收試劑盒回收進(jìn)行膠Irx5a擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.2.3Irx5a體外轉(zhuǎn)錄載體的構(gòu)建將上述回收的Irx5aPCR產(chǎn)物片段及pCS2+質(zhì)粒分別用BamH I及EcoR I雙酶切，經(jīng)電泳割膠回收后，用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)。將連接產(chǎn)物運(yùn)用鈣轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)入大腸桿菌E.coliDH5α感受態(tài)，經(jīng)氨芐抗性篩選出陽性克隆并擴(kuò)增后，運(yùn)用堿裂解法提取Irx5a-pCS2+重組質(zhì)粒。

1.2.4Irx5a-pCS2+重組質(zhì)粒的鑒定分別用以下3種方法對(duì)Irx5a-pCS2+重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定：(1)用BamH I和EcoR I對(duì)Irx5a-pCS2+重組質(zhì)粒雙酶切后，瓊脂糖凝膠電泳鑒定；(2)加入1.2.2項(xiàng)下提及的引物，對(duì)陽性克隆進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增, 通過瓊脂糖凝膠電泳判斷擴(kuò)增產(chǎn)物大??；(3)將Irx5a-pCS2+重組質(zhì)粒DNA送北京三博遠(yuǎn)志公司進(jìn)行在測序鑒定。

1.2.5地高辛標(biāo)記的Irx5a反義mRNA探針制備將Irx5a-pCS2+重組質(zhì)粒用BamH I進(jìn)行單酶切，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，用DNA純化試劑盒割膠回收得到線性化的Irx5a-pCS2+重組質(zhì)粒。利用體外轉(zhuǎn)錄體系，以線性化的Irx5a-pCS2+重組質(zhì)粒DNA為模板，以地高辛標(biāo)記的寡核苷酸為原料，經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄得到地高辛標(biāo)記的Irx5a反義mRNA探針后，用NucAwayTMSpin Columns純化吸附柱回收Irx5a反義mRNA探針，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后,于-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6斑馬魚全胚胎原位雜交選取0.75～72 hpf不同時(shí)間點(diǎn)野生型斑馬魚胚胎進(jìn)行全胚胎原位雜交，用1×PBST溶液洗去固定液，甲醇進(jìn)行梯度脫水，將胚胎置于68 ℃雜交爐中進(jìn)行預(yù)雜交1 h，加入制備好的地高辛標(biāo)記的Irx5a反義mRNA探針，于68 ℃雜交爐中過夜，用不同濃度的SSCT將多余的探針洗去，加入地高辛標(biāo)記的抗體后過夜，用MABT將多余的抗體洗掉，加入BCIP/NBT染液對(duì)雜交胚胎進(jìn)行染色，在體視顯微鏡下觀察并記錄結(jié)果后，用固定液對(duì)雜交胚胎進(jìn)行再固定并且照相。

2結(jié)果

2.1Irx5a目的基因

經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，在500～600 bp處見一特異擴(kuò)增條帶，與預(yù)期511 bp片段大小一致(圖1)。

注：M為DNA Marker，1為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，2為空白對(duì)照?qǐng)D1　RT-PCR擴(kuò)增Irx5a基因瓊脂糖凝膠電泳Fig.1　Results of agarose gel electrophoresis of RT-PCR amplified Irx5a gene

2.2Irx5a-pCS2+重組質(zhì)粒鑒定

Irx5a-pCS2+重組質(zhì)粒DNA經(jīng)BamH I及EcoR I雙酶切后，酶切產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳得到一大小約為511 bp的片段,與RT-PCR產(chǎn)物大小一致，而另一片段大小與空質(zhì)粒酶切得到的片段大小一致(圖2)。將重組質(zhì)粒Irx5a-pCS2+作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，可見500～600 bp之間有一特異性條帶(圖3)，與預(yù)期的511 bp相符。重組質(zhì)粒Irx5a-pCS2+測序結(jié)果經(jīng)檢索比對(duì),與斑馬魚Irx5a的基因序列及方向正確，見圖4。

注:M為DNA Marker，1為 Irx5a-pCS2+重組質(zhì)粒經(jīng)BamH I及EcoR I雙酶切產(chǎn)物，2為空白對(duì)照?qǐng)D2　Irx5a-pCS2+重組質(zhì)粒經(jīng)BamH I及EcoR I雙酶切產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳Fig.2　Results of agarose gel electrophoresis of BamH I and ECOR I double enzyme digestion of recombinant plasmid Irx5a-pCS2+

注：M為DNA Marker，1為菌落PCR產(chǎn)物，2為空白對(duì)照?qǐng)D3　菌落PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳Fig.3　Bacterial colony PCR analysis of recombinant plasmid Irx5a-pCS2+

2.3斑馬魚全胚胎原位雜交

0.75～72 hpf的Tuebingen野生型斑馬魚胚胎的原位雜交結(jié)果顯示, 3.7 hpf可以觀察到Irx5a基因的表達(dá)信號(hào)(箭頭所示),9、12 hpf斑馬魚胚胎后腦神經(jīng)板及腹部中胚層可觀察到明顯的陽性雜交信號(hào)，18 hpf胚胎中腦、間腦、后腦、咽弓及側(cè)板中胚層可觀察到陽性雜交信號(hào)，24、30、36及48 hpf斑馬魚胚胎中腦、間腦、后腦、咽弓、脊索、耳泡囊及脊髓可見黑色的陽性雜交信號(hào)，72 hpf斑馬魚胚胎中腦、間腦、后腦、耳泡囊及視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層可見黑色的陽性雜交信號(hào)。見圖5。

圖4　Irx5a-pCS2+重組質(zhì)粒測序結(jié)果Fig.4　Gene sequencing analysis of recombinant plasmid Irx5a-pCS2+

圖5　0.75～72 hpf野生型斑馬魚胚胎Irx5a基因表達(dá)譜Fig.5　Expression pattern of Irx5a in 0.75～72 hpf of wild type zebrafish embryo

3討論

斑馬魚是從上世紀(jì)末開始新興的模式生物，其體外受精并發(fā)育，并且早期發(fā)育胚胎通體透明，有利于進(jìn)行胚胎動(dòng)態(tài)地活體觀察和科學(xué)研究[6-8]，這些重要優(yōu)勢(shì)為研究觀察生物早期組織器官的發(fā)生和形成，以及胚胎早期的生長發(fā)育提供便利。

本研究首先提取野生型斑馬魚胚胎總RNA，經(jīng)RT-PCR克隆得到Irx5a基因片段，通過限制性內(nèi)切酶將其定向插入到pCS2+載體中，經(jīng)菌落PCR、雙酶切及DNA測序鑒定，證實(shí)插入的Irx5a目的基因片段大小和方向正確無誤，成功獲得Irx5a-pCS2+重組質(zhì)粒。接著將Irx5a-pCS2+重組質(zhì)粒通過體外轉(zhuǎn)錄得到了地高辛標(biāo)記的Irx5a反義mRNA探針，通過WISH, 對(duì)Tuebingen野生型斑馬魚胚胎Irx5a基因的表達(dá)情況進(jìn)行了檢測和觀察。通過WISH從整體水平上反映了胚胎發(fā)育過程中Irx5a基因表達(dá)的時(shí)空順序。

Irx基因作為一個(gè)古老的基因家族在進(jìn)化過程中高度保守。Irx5基因在斑馬魚分為Irx5a、Irx5b兩個(gè)基因，分別定位于斑馬魚的第8和13號(hào)染色體。根據(jù)產(chǎn)物蛋白質(zhì)氨基酸序列近似性以及染色體定位分析，Irx5a與人類、小鼠的Irx5基因同源性更為接近。以往的研究提示，Irx5基因可能與小鼠神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、心肌發(fā)育、肺泡表面物質(zhì)的形成等都有密切的關(guān)系[9-12]，但是該基因在發(fā)育過程中確切的表達(dá)譜以及生物學(xué)功能迄今為止仍不清楚。鑒于此，本研究旨在了解Irx5a在斑馬魚發(fā)育過程中的表達(dá)情況。本研究發(fā)現(xiàn), 0.75 hpf斑馬魚胚胎細(xì)胞發(fā)生了第1次有絲分裂期，沒有觀察到Irx5a基因的表達(dá)，提示Irx5a基因可能未參與胚胎單細(xì)胞首次分裂為2細(xì)胞的過程；在3.7 hpf的胚胎中觀察到有表達(dá)，提示Irx5a基因可能是母源性基因， 6 hpf斑馬魚胚胎逐漸向三個(gè)胚層開始分化，9 hpf是斑馬魚第1個(gè)體節(jié)形成期，Irx5a基因持續(xù)有表達(dá)，其表達(dá)位置主要在腹部中胚層；斑馬魚原始造血初期(12 hpf)，Irx5a基因表達(dá)位置主要在后腦神經(jīng)節(jié)及腹部中胚層，而腹部中胚層是原始造血初期造血組織的重要起始位置； 18 hpf觀察到Irx5a基因在斑馬魚胚胎中腦、間腦、后腦、咽弓及側(cè)板中胚層高表達(dá)，以及在尾部的動(dòng)靜脈血管叢低表達(dá)，其中側(cè)板中胚層是早期巨噬細(xì)胞及其它髓系細(xì)胞的前體的起源區(qū)，與原始造血發(fā)育密切相關(guān)； 24、30及36 hpf斑馬魚胚胎的Irx5a基因主要在中腦、間腦、后腦等神經(jīng)組織中表達(dá)；在初步具有成魚相關(guān)組織形態(tài)及器官功能的48和72 hpf斑馬魚胚胎中Irx5a基因在中腦、間腦、后腦、耳泡囊表達(dá)強(qiáng)度較高，在72 hpf斑馬魚胚胎Irx5a基因在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層表達(dá)。綜上，Irx5a基因系母源性基因，其在胚胎發(fā)育過程中貫穿于整個(gè)神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育時(shí)期，其對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育可能發(fā)揮著重要作用；Irx5a基因同樣在原始造血過程中的重要造血組織中高表達(dá)，這就提示Irx5a基因可能參與斑馬魚原始造血的發(fā)育；同時(shí)，在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞開始發(fā)育的72 hpf斑馬魚胚胎Irx5a基因在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層的表達(dá)，結(jié)合與往的研究對(duì)視網(wǎng)膜雙極細(xì)胞分化影響的研究，充分說明Irx5a基因在促進(jìn)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞分化、發(fā)育過程中起重要作用，為進(jìn)一步研究Irx5a的功能奠定了重要的理論基礎(chǔ)。

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(2016-05-30收稿，2016-06-29修回)

中文編輯： 吳昌學(xué)； 英文編輯： 劉華

*[基金項(xiàng)目]國家自然科學(xué)基金(31260284); 貴州省科技基礎(chǔ)條件平臺(tái)項(xiàng)目[2009-4005 ]； 貴州省優(yōu)秀科技省長專項(xiàng)基金(S2008-4)

[中圖分類號(hào)]P321-33

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1000-2707(2016)07-0755-05

DOI:10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.07.003

Expression ofIrx5aGene in Early Development of Wide Type Zebrafish

SHU Liping1,2,3, HE Zhixu1,4, XU Wei4, DING Kejun4

(1.TissueEngineeringandStemCellResearchCenter,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China;2.ExperimentalAnimalCenter,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 3.DepartmentofImmunology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 4.DepartmentofPediatrics,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To observe the expression of Irx5a gene in early development of the wild type zebrafish embryo of with whole mount in situ hybridization(WISH). Methods: Total RNA of zebrafish embryos in different development stage was extracted by Trizol. The cDNA of Irx5a gene was amplified by RT-PCR, and then cloned into pCS2+vector by BamH I and EcoR I restrictive enzyme sites. The recombinant gene was identified and confirmed by bacterial colony PCR, double enzyme digestion and DNA sequencing. Antisense mRNA probes of Irx5a gene was prepared by in vitro transcription system and underwent whole mount in situ hybridization with zebrafish embryos. Results: Irx5a-pCS2+recombinant plasmid was constructed and identified. After whole mount in situ hybridization, it was observed that Irx5a mRNA was expressed from 3.7hpf and highly expressed in embryonic nervous system and hematopoietic system. Conclusion: Irx5a gene may be involved in the development of nervous system and hematopoietic system in the early stage of Tuebingen wild type zebrafish embryo development.

[Key words]Irx5a; pCS2+plasmid; DNA, recombination; RNA probe; whole mount in situ hybridization

**通信作者 E-mail:hzx@gmc.edu.cn

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-07-17網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160717.1318.046.html