李曉云　于曉輝　王維　戴飛　武承鳳　孫延榮

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肝細胞肝癌患者外周血中T細胞亞群和NK細胞的變化

李曉云于曉輝王維戴飛武承鳳孫延榮

730050甘肅蘭州蘭州軍醫(yī)蘭州總醫(yī)院醫(yī)務(wù)部(李曉云，孫延榮)，消化科(于曉輝，王維，武承鳳)，統(tǒng)計室(戴飛)

【摘要】目的探討肝細胞肝癌(HCC)外周血中T細胞亞群及NK細胞含量的變化，進一步了解HCC患者的免疫功能狀況。方法收集181例HCC患者作為試驗組，其中小HCC 39例、中等HCC 64例、大HCC 46例、巨塊型HCC 32例；有肝硬化基礎(chǔ)的HCC 150例，其中乙型肝炎肝硬化96例、丙型肝炎肝硬化49例、酒精性肝硬化3例、自身免疫性肝硬化2例。無肝硬化基礎(chǔ)的HCC 31例，其中乙型肝炎病毒感染20例、丙型肝炎病毒感染8例、無原因的3例。對150例有肝硬化基礎(chǔ)的患者按Child-Pugh分成A、B、C三級，其中A級37例、B級47例、C級66例。選擇46名健康人群作為正常對照組。采用流式細胞儀檢測兩組患者血清中CD3+T細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞和NK細胞的含量。結(jié)果隨著HCC體積的增大，外周血中CD3+T細胞、CD4+T細胞和NK細胞的含量明顯降低，而CD8+T細胞含量升高，與正常對照組比較，其差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；有肝硬化基礎(chǔ)的HCC患者，隨著Child-Pugh分級的增加， CD3+T細胞、CD4+T細胞和NK細胞的含量也明顯降低，而CD8+T細胞含量升高，與正常對照組比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)論HCC患者的T細胞和NK細胞的變化不但與腫瘤大小相關(guān)，還與HCC的肝硬化背景及分級相關(guān)。HCC患者機體免疫狀況的變化，對判斷HCC患者的免疫功能、病情及預后具有重要的臨床意義。

【關(guān)鍵詞】肝細胞肝癌；CD3+T細胞；CD4+T細胞；CD8+T細胞；NK細胞

肝細胞肝癌(HCC)在我國是惡性腫瘤導致死亡的主要疾病之一。HCC多有病毒性肝炎背景，而病毒性肝炎患者多存在免疫功能紊亂等狀況，如T淋巴細胞亞群比例失調(diào)，容易并發(fā)嚴重的繼發(fā)感染，加重肝功能損害易導致病情惡化或死亡。本研究就針對181例HCC患者外周血中CD3+T細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞和NK細胞的含量進行檢測，從而進一步了解HCC的大小、肝硬化背景與患者機體免疫狀況的關(guān)系，對指導臨床治療、病情評估及預后具有重要參考價值。

資料和方法

一、一般資料

全部病例來源于2005年11月-2015年11月蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院消化科、肝膽外科及腫瘤科的住院患者，收集181例HCC患者作為試驗組，其中小HCC 39例、中等HCC 64例、大HCC 46例、巨塊型HCC 32例。有肝硬化基礎(chǔ)的HCC 150例，其中乙型肝炎肝硬化96例、丙型肝炎肝硬化49例、酒精性肝硬化3例、自身免疫性肝硬化2例。無肝硬化基礎(chǔ)的31例，其中乙型肝炎病毒感染20例、丙型肝炎病毒感染8例、無原因的3例。對150例有肝硬化基礎(chǔ)的患者按Child-Pugh分成A、B、C三級，其中A級37例、B級47例、C級66例。試驗組男101例，女39例，年齡25～79歲，平均年齡(50.0±7.5)歲。選擇46名健康人群作為正常對照組，男38例，女8例，年齡20～61歲，平均年齡(48.0±6.3)歲。所有患者均排除患有其他疾病，如糖尿病、腎病、硬皮病等；對照組系在消化科工作的醫(yī)護人員志愿者，均無心、肝、腎等重要臟器疾患，無肝炎、血吸蟲病史。

二、儀器

FACS Cali bur 流式細胞儀為美國Becton- Kickin-son (BD) 公司生產(chǎn)，激發(fā)波長188 nm。

三、試劑

鼠IgG1-FITC/Ig GPE (陰性對照)，CD4-FITC/CD8-PE，CD3-FLTC，pH7.2磷酸鹽緩沖溶液(PBS)，均為北京中衫金橋公司產(chǎn)品。

四、方法

所有患者均在晨起空腹抽取靜脈血5 mL 管，以EDTA-Na2(乙二胺四乙酸二鈉) 抗凝，利用 FACS Calibur流式細胞儀及 Cell Quest 軟件(均由 BD 公司提供)對血樣進行測定和分析。

五、統(tǒng)計學處理

結(jié)果

隨著HCC體積增大及Child-Pugh分級增加，外周血中CD3+T細胞、CD4+T細胞和NK細胞的含量明顯降低，而CD8+T細胞含量升高，與正常對照組比較，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。但小HCC和Child-Pugh A級患者外周淋巴細胞含量與正常對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1和表2。

討論

HCC占原發(fā)性肝癌的90%以上， 其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)居第6位，而死亡率高居第3 位[1]。我國HCC的發(fā)病人數(shù)約占全球的50%以上[2]。HCC起病隱匿、早期臨床癥狀不顯著，大部分HCC確診時已進展至中晚期，已失去根治性手術(shù)治療時機，多選擇微創(chuàng)介入或保守性病灶切除聯(lián)合化療、放療等姑息性治療措施，以期能夠提高生存率，改善患者預后。在患者病程中有較多因素可影響預后，如肝臟原發(fā)病灶大小、肝功能Child-Pugh分級、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及血管浸潤，同時機體免疫狀況變化對HCC的療效和預后也有重要影響[3]。

正常情況下，機體的免疫監(jiān)控機制可消滅大多數(shù)異常的細胞。而HCC在生長過程中會釋放多種細胞因子，這些細胞因子能夠減弱或阻斷機體對腫瘤細胞的免疫識別、清除，獲得免疫逃逸能力，從而促進腫瘤細胞的生長、增殖，腫瘤細胞增殖進而分泌更多的細胞因子影響機體免疫功能，通過多種手段調(diào)控機體的免疫應(yīng)答[4]。淋巴細胞是免疫系統(tǒng)的重要組成成分，在免疫反應(yīng)過程中各司其職，維持正常的免疫功能，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中既有殺傷型免疫細胞，如NK 細胞、CD3+T細胞、CD4+T細胞能直接或通過分泌細胞因子殺傷腫瘤細胞，抑制腫瘤生長；也有某些抑制型免疫細胞，如CD8+T細胞不但不能清除腫瘤細胞，反而在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中抑制其他效應(yīng)細胞的抗腫瘤作用[5]。研究表明HCC患者外周血中CD3+T細胞、CD4+T細胞、NK細胞數(shù)量明顯減低，CD8+T細胞的數(shù)量卻顯著升高，經(jīng)射頻消融或手術(shù)治療后檢測發(fā)現(xiàn)CD4+T細胞、NK細胞的數(shù)量較治療前有所增加，CD8+T細胞的數(shù)量減低，CD4+T/CD8+T也有升高[6]。同樣，臨床研究[7-11]顯示在肺癌、乳腺癌、卵巢癌患者外周血及胃腸腫瘤患者腹水中CD4+T細胞、NK細胞增加與病情嚴重程度密切相關(guān)，CD8+T細胞減少也與病情相關(guān)，在治療過程中監(jiān)測可發(fā)現(xiàn)CD4+T細胞、NK細胞數(shù)量逐漸升高，而CD8+T細胞數(shù)量減少。研究表明[12-13]，特異性阻斷CD8+T細胞表達可增強機體的抗腫瘤免疫能力，提示CD8+T細胞可作為腫瘤免疫治療的新靶點。

表1　HCC患者外周血CD3+T細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞和NK細胞的檢測結(jié)果(±s)

注：*P<0.05，▲P>0.05 (*表示中等、大及巨塊HCC與正常對照組比較，▲表示小HCC與正常對照組比較)

表2　Child-Pugh分級的HCC患者外周血CD3+T細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞和NK細胞的檢測結(jié)果(±s)

注：*P<0.05，▲P>0.05 (*表示Child-Pugh B、C級肝硬化與正常對照組比較，▲表示Child-Pugh A級肝硬化與正常對照組比較)

本研究顯示隨著HCC病灶的增大及Child-Pugh分級的增加，外周血中CD3+T細胞、CD4+T細胞和NK細胞的含量明顯降低，而CD8+T細胞含量升高，與正常對照組比較，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。但小HCC和Child-Pugh A級患者外周淋巴細胞含量與正常對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。HCC病灶越大腫瘤細胞數(shù)量更大，分泌更多的細胞因子影響機體免疫調(diào)控，使得CD4+T細胞和NK細胞數(shù)量減低，而CD8+T細胞含量升高，進一步加劇了機體失調(diào)的免疫調(diào)控機制，加重免疫損傷，進而可能促進病情進展。Child-Pugh分級B、C級患者肝功能差，機體免疫力低下，免疫功能紊亂表現(xiàn)更為顯著，CD4+T細胞、NK細胞及CD8+T細胞數(shù)量發(fā)生改變，也能發(fā)揮免疫逃逸作用，促進腫瘤細胞生長、增殖。而通過調(diào)節(jié)免疫功能的輔助治療在一定程度上有助于減輕HCC患者肝臟免疫損傷，改善肝功能，進而可能提高其治療有效率、生存率，改善預后等。因此除外目前手術(shù)、介入、化療及放療等治療方法，免疫治療也是一種重要的輔助治療手段。

綜上所述，HCC的發(fā)生、發(fā)展、治療及預后均與機體免疫調(diào)控密切相關(guān)，消除HCC患者體內(nèi)抑制性T細胞如CD8+T細胞在腫瘤患者的異常增殖，消除其抗腫瘤免疫作用將成為免疫治療領(lǐng)域的重要研究方向，免疫治療的重要性不可忽視，因此需要開展進一步實踐與研究，以期獲得更為確切及規(guī)范的治療，為 HCC患者生存及預后提供更多保障。

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(本文編輯：賴榮陶)

通信作者：于曉輝，Email: yuxiaohui528@126.com

(收稿日期：2014-12-10)

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