代鵬飛,舒　剛,林居純,鐘欽卿,鄧　林

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四川動物源大腸桿菌耐藥性、產β-內酰胺酶及血清型的檢測

代鵬飛1,舒剛2,林居純1,鐘欽卿1,鄧林1

1.四川農業(yè)大學動物醫(yī)學院新藥安全評價實驗室，溫江611130；2.四川農業(yè)大學動物醫(yī)學院藥物制劑實驗室，溫江611130

摘要：目的為了解四川地區(qū)動物源大腸桿菌臨床分離菌株耐藥性，產β-內酰胺酶以及產酶菌株血清型流行規(guī)律。方法采用微量肉湯稀釋法對467株臨床菌株進行了27種抗菌藥物的耐藥性檢測；采用CLSI推薦產ESBLs、AmpC和碳青霉烯酶檢測方法檢測了所有菌株產β-內酰胺酶情況；采用O抗原鑒定法對產酶菌株血清型進行了鑒定。結果467株菌對27種抗生素產生了不同程度耐藥性；菌株產ESBLs、AmpC和碳青霉烯酶檢出率分別為36.83%、13.70%和0.00%，產酶菌比非產酶菌具有更嚴重的耐藥性；176株產酶菌共檢測出31種血清型，以O131、O107、O78、O9、O127、O20和O157為優(yōu)勢血清型。結論本次檢測大腸桿菌ESBLs和AmpC檢出率較高，耐藥形勢嚴重，血清型復雜，應加強動物源大腸桿菌產β-內酰胺酶及血清型的監(jiān)測。

關鍵詞：大腸桿菌；耐藥性；β-內酰胺酶；血清型

Supported by the National Science and technology support program of China (No. 2012BAC01B06)

大腸桿菌是動物腸道內正常棲居菌，具有致病性，條件性和非條件性致病菌等特點。大腸桿菌抗原性復雜，血清型多樣。目前國內報道能致病血清型已有60多種，呈地區(qū)性和多樣性分布[1]。

β-內酰胺類藥物作為控制感染性疾病的一線用藥，其耐藥性呈逐年增長趨勢。在過去的30多年里，食品動物源大腸桿菌對青霉素類耐藥率從19.0%增長到81.3%[2]，已有研究顯示，產β-內酰胺酶是大腸桿菌重要的耐藥機制之一。當前最具有臨床意義的β-內酰胺酶是超廣譜β-內酰胺酶(extended-spectrum β-lactamases, ESBLs)、碳青霉烯酶和頭孢菌素水解酶(AmpC)[3-4]。新型β-內酰胺酶的出現(xiàn)導致菌株對抗生素高水平和多重耐藥，其編碼基因通過質?；蛘献拥瓤梢苿踊蛟?，使得耐藥基因在不同菌種間水平傳播的速度加快，存在暴發(fā)性流行危險，具有重要的流行病學意義[5]。

本次研究對獸醫(yī)臨床分離大腸桿菌菌株進行了耐藥性、產新型β-內酰胺酶及血清型的檢測，旨在了解產β-內酰胺酶大腸桿菌血清型流行病學規(guī)律，為大腸桿菌病的防控提供科學依據。

1材料與方法

1.1菌株來源于2006—2011年間于四川地區(qū)分離自臨床樣本大腸桿菌467株，其中雞源206株、鴨源55株、豬源198株和牛源8株。

表1　不同菌株對抗菌藥物的耐藥率

注：與β-內酰胺酶陰性菌耐藥率比較，*表示差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)

Note: Compared with β-lactamase negative strains, the * indicates a significant difference (P<0.05)

1.2藥品及藥敏紙片阿莫西林/克拉維酸(AMC)、氨芐西林(AMP)、頭孢氨芐(LEX)、頭孢唑啉(CFZ)、頭孢噻呋(CEF)、頭孢曲松(CRO)、頭孢他啶(CAZ)、頭孢噻肟(CTX)、頭孢吡肟(FEP)、頭孢西丁(FOX)、氨曲南(AZM)、亞胺培南(IPM)、鏈霉素(STR)、慶大霉素(GEN)、阿米卡星(AMK)、四環(huán)素(TET)、多西環(huán)素(DOX)、達氟沙星(DAN)、氧氟沙星(OFX)、磺胺異噁唑(SIZ)等藥品由中國農業(yè)大學獸醫(yī)藥理學教研室惠贈；阿莫西林(AMX)、氯霉素(CHL)、氟苯尼考(FLO)、諾氟沙星(NOR)、恩諾沙星(ENR)、甲氧芐啶(TMP)、復方新諾明(SXT)等藥品購自中國獸藥監(jiān)察所；頭孢他啶(CAZ)、頭孢他啶/克拉維酸(CAZ/CA)、頭孢噻肟(CTX)、頭孢噻肟/克拉維酸(CTX/CA)、頭孢西丁(FOX)、美羅培南(MEM)和Ⅰ型新德里金屬β-內酰胺酶(NDM-1)檢測盒等藥敏紙片均購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.3其他試劑36種大腸桿菌O抗原血清，購自中國獸藥監(jiān)察所；質控菌株大腸桿菌ATCC25922購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.4藥敏試驗及β-內酰胺酶檢測采用CLSI標準微量肉湯稀釋法測定大腸桿菌對抗菌藥物的MIC值[6]；采用CLSI推薦雙紙片確認法進行產ESBLs檢測[6]；采用CLSI推薦頭孢西丁紙片擴散試驗和三維試驗進行產AmpC檢測[7]；根據改良Hoged試驗檢測碳青霉烯酶[6]，采用Ⅰ型新德里金屬β-內酰胺酶檢測盒進行金屬酶檢測。

1.5大腸桿菌O抗原血清型鑒定對產β-內酰胺酶菌株，參照中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供的O抗原型血清鑒定說明書進行血清型鑒定。

2結果

2.1耐藥性檢測結果本次藥敏檢測結果顯示，除對亞胺培南100%敏感外，467株動物源大腸桿菌對其余26種抗菌藥物均表現(xiàn)出不同程度的耐藥性。菌株對青霉素類(阿莫西林、阿莫西林/克拉維酸和氨芐西林)、四環(huán)素類(四環(huán)素和多西環(huán)素)、氯霉素類(氯霉素和氟苯尼考)、磺胺類(磺胺異噁唑、甲氧芐啶和復方新諾明)、氟喹諾酮類的耐藥率較高(耐藥率接近或超過70%)；對氨基糖苷類除阿米卡星耐藥率(15.85%)較低外，對鏈霉素和慶大霉素耐藥率較高；對頭孢菌素類第一代、第三代的頭孢噻呋和頭孢曲松耐藥率較高，而對第三代的頭孢噻肟、頭孢他啶和第四代的頭孢吡肟耐藥率較低(見表1)。本次檢測菌株呈5耐～26耐的多重耐藥性，無優(yōu)勢耐藥譜型。

2.2菌株產β-內酰胺酶檢測及產酶陰性、陽性菌株耐藥性比較產酶檢測結果顯示，467株大腸桿菌除未檢出產碳青霉烯酶、金屬β-內酰胺酶外，檢出產ESBLs菌172株(檢出率36.83%)；產AmpC菌64株(檢出率13.70%)，其中4株為單產AmpC酶，60株同時產ESBLs和AmpC酶。產ESBLs、AmpC酶菌株分別對所檢測的20種、22種藥物耐藥率顯著高于陰性菌株(P<0.05)(表1)，且產酶菌呈更嚴重的多重耐藥性，其中ESBLs陽性菌多重耐藥以23耐(18.02%)和24耐(25.58%)為主，而陰性菌以19耐(11.86%)和20耐(10.51%)為主；AmpC陽性菌多重耐藥性以24耐(28.13%)為主，陰性菌主要為19耐(9.68%)和20耐(10.92%)。

表2　產β-內酰胺酶菌株O抗原血清型鑒定結果

2.3產β-內酰胺類酶菌株血清型鑒定對176株產β-內酰胺酶菌株(單產ESBLs 112株，單產AmpC 4株，同時產ESBLs和AmpC菌株共60株)進行了36種大腸桿菌標準抗“O”單因子血清型鑒定。鑒定結果顯示除1株自凝、23株未定型外，共鑒定出152株，涵蓋31種血清型，以O131(檢出率16.45%)、O107(9.87%)、O78(7.90%)、O9(6.58%)、O127(6.58%)、O20(5.92%)和O157(5.92%)為優(yōu)勢血清，共占被檢出菌株59.21%。6株產ESBLs菌株血清型檢測顯示為2種：O9/O107、O38/O101、O88/O93、O131/O157、O38/O107、O76/O141，說明存在一定的“O”抗原交叉反應現(xiàn)象。在所有產酶菌株中，單產ESBLs和產雙酶菌株的血清型分布非常相似，在相同產酶菌株中有不同血清型，在不同產酶菌中有相同血清型(表2)，表明菌株血清型與產酶類型無相關性。

3討論

青霉素類藥物如阿莫西林、氨芐西林等為我國臨床常用藥物，隨藥物的廣泛使用，耐藥菌株逐年增多，且呈交叉耐藥和多重耐藥之勢。本次467株臨床大腸桿菌對阿莫西林、氨芐西林的耐藥率超過90%，與其他報道一致[8-9]，且對阿莫西林/克拉維酸耐藥率達91.65%，遠遠高于2006年與2009年的報道(耐藥率6.6% ～10.0%)[8-9]，高于2011年報道的51.4 %[10]，說明隨用藥時間延長，菌株已突破β-內酰胺抑制劑的作用；本次菌株對頭孢菌素類藥物耐藥率分布范圍廣(16.70%～80.09%)，除對頭孢西丁、頭孢吡肟耐藥率較低外，對頭孢氨芐等耐藥率較高(超過30%)。以上耐藥表型分析可見，菌株對頭孢類的耐藥性與藥物使用時間相關，藥物使用時間越短，耐藥率越低。值得重視的是，除頭孢噻呋外，本實驗所檢測的其他頭孢類禁止在獸醫(yī)臨床使用，但耐藥性已較嚴重，可能與細菌對藥物的交叉耐藥性有關，也可能是與獸醫(yī)臨床違規(guī)使用藥物有關[8]；本次菌株對單環(huán)酰胺類氨曲南耐藥率已達61.88%，明顯高于其他報道[9]；對碳青霉烯類亞胺培南全部敏感，與相關文獻一致[8]。本實驗菌株對其他非β-內酰胺類藥物，除阿米卡星耐藥率較低(15.85%)外，對其余藥物耐藥現(xiàn)象十分嚴重，尤其對四環(huán)素類、酰胺醇類和磺胺類的耐藥率超過80%，所有受試菌株呈5耐～26耐的多重耐藥性。以上結論說明本次檢測菌株耐藥嚴重，耐藥譜型較廣，揭示了抗菌藥物在獸醫(yī)臨床上過量、高頻率的長期使用，故在獸醫(yī)臨床上應謹慎使用抗菌藥物，尤其應嚴格控制新一代頭孢菌素的使用。

本次產β-內酰胺酶檢測結果顯示，467株大腸桿菌除未檢出產碳青霉烯酶、Ⅰ型新德里金屬β-內酰胺酶外，172株菌產ESBLs，檢出率為36.83%，雖低于醫(yī)學臨床檢出率(59.0%～71.2%)和獸醫(yī)臨床檢出率(76.7%～80%)[9-11]，但高于歐美國家的檢出率(4.4%～14%)，說明產ESBLs大腸桿菌菌株在獸醫(yī)臨床廣泛存在。本次還檢出64株產AmpC菌株(檢出率13.70%)，高于獸醫(yī)臨床檢出率[14-15]，且其中60株菌為同時產ESBLs和AmpC酶，使得酶作用底物更加廣泛，水解抗菌藥物率更高，從而導致細菌產生更高水平和更廣泛的多重耐藥性，給臨床治療帶來相當大的困難。盡管本次檢出AmpC不能確定是染色體或質粒介導產生，但有關研究顯示，呈高水平、多重耐藥菌株耐藥表型檢出的AmpC菌株為質粒介導產生的[16]；結合本次產AmpC菌株對頭孢西丁100%耐藥，且呈18耐 ～ 25耐的多重耐藥性，說明本次產AmpC菌株極可能為質粒介導產生的，其耐藥基因具有廣泛的傳播性，需加以重視。

比較產酶菌與非產酶菌耐藥性可見，產酶菌除亞胺培南外，對其余β-內酰胺類耐藥率顯著高于非產酶菌(P<0.05)，說明ESBLs和AmpC酶是大腸桿菌耐β-內酰胺類的主要機制。此外，產酶菌株對氨基糖苷類、四環(huán)素類、酰胺醇類、氟喹諾酮類的多數(shù)藥物也呈更高水平耐藥，且產酶菌株多重耐藥譜型更廣，這一結果在其他報道可見[17]。這是因為介導新型β-內酰胺酶的耐藥基因常由可結合性大質粒編碼，后者可同時攜帶耐氨基糖苷類、喹諾酮類等多種抗菌藥物的耐藥基因，形成具有多種耐藥表型的多重耐藥菌。

血清型鑒定結果可見，176株產酶菌涵蓋31種血清型，其中25種血清型(占檢出血清型80.65%)是屬于我國流行的致病性大腸桿菌血清型[18-19]，31種血清型以O131、O107、O78、O9、O127、O20和O157為優(yōu)勢血清型，且血清型的分布與菌株產酶類型沒有相關性。以上結論說明，無論產ESBLs還是AmpC菌株都具有廣泛的致病性血清型，這帶來了潛在的發(fā)病危機，給疾病治療帶來更大威脅。

參考文獻：

[1]Song L, Ning YB, Zhang XY, et al. Comparative research on serotype distribution and antimicrobial resistance ofEscherichiacoliisolates from poultry in different areas of China[J]. Scientia Agricultura Sinica, 2005, 38(7): 1466-1473. (in Chinese)

宋立，寧宜寶，張秀英，等.中國不同地區(qū)家禽大腸桿菌血清型分布和耐藥性比較研究[J].中國農業(yè)科學，2005，38(7): 1466-1473.

[2]Song L, Ning YB, Shen JZ, et al. Comparative research on antimicrobial resistance ofEscherichiacoliisolates from foodproducing animals in different decades of China[J]. Scientia Sinica Vitae, 2009, 39(7): 692-698. (in Chinese)

宋立，寧宜寶，沈建忠，等. 中國不同年代食品動物大腸桿菌耐藥性調查研究[J]. 中國科學 C 輯:生命科學，2009，39(7): 692-698.

[3]Yusuf I, Arzai AH, Haruna M, et al. Detection of multi drug resistant bacteria in major hospitals in Kano, North-West, Nigeria[J]. Braz J Microbiol, 2014, 45(3): 791-798.

[4]Rubin JE, Pitout JD. Extended-spectrum β-lactamase, carbapenemase and AmpC producingEnterobacteriaceaein companion animals[J]. Vet Microbiol, 2014, 170(1/2): 10-18. DOI:10.1016/j.vetmic.2014.01.017

[5]Batchelor M, Threlfall EJ, Liebana E. Cephalosporin resistance among animal-associatedEnterobacteria: a current perspective[J]. Expert Rev Anti Infect Ther, 2005, 3(3): 403-417. DOI: 10.1586/14787210.3.3.403

[6]Clinical and laboratory Standards Institute. M100-S22 Performance standards for antimicrobial susceptibility testing, Twenty-second information supplement[R]. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute, 2012.

[7]Li JZ, Liu LP, Duan XB, et al. EDTA-cefoxitin-agar medium for laboratory detection of AmpC β-lactamases inEnterobacteriaceaeand its preliminary clinical application[J]. Lab Med, 2008, 23(2): 122-124. (in Chinese)

李金鐘，劉利平，段雄波，等.EDTA-頭孢西丁平板試驗檢測腸桿菌科細菌AmpC酶及其臨床應用[J].檢驗醫(yī)學，2008，23(2):122-124.

[8]Wei P. Study on mechanism of β-lactam antibiotic resistance in enteropathogenicE.colifrom chicken[D]. Jinan: Shandong Agricultural University, 2008. (in Chinese)

位朋.雞源性大腸桿菌對β-內酰胺類藥物的耐藥機制研究[D].濟南：山東農業(yè)大學，2008.

[9]Yuan L, Liu JH, Hu GZ, et al. Detection of extended-spectrum β-lactamases genotype and antibiotic resistance analysis among 30E.coliisolates from chicken[J]. Chin J Prev Vet Med, 2009, 6(31): 438-442. (in Chinese)

苑麗，劉建華，胡功政，等.30株雞大腸桿菌ESBLs基因型檢測及耐藥性分析[J]. 中國預防獸醫(yī)學報，2009，6(31):438-442.

[10]Lai J, Liu Y, Wang Y, et al. Surveillance of antimicrobial resistance amongEscherichiacoliisolates from different animals in Sichuan Province in 2007[J]. Chin J Vet Med, 2011, 47(4): 12-14. (in Chinese)

賴婧，劉洋，汪宇，等. 800株不同動物源大腸桿菌的耐藥性監(jiān)測[J]. 中國獸醫(yī)雜志，2011，47(4): 12-14.

[11]Zhang XL. 201 cases of infection caused by extended-spectrum β-lactamases-producing bacteria[J]. Chin J Infect Ctrl Vol, 2015, 14(4): 270-271. DOI: 10.3969/j.issn.1671-9638.2015.04.014 (in Chinese)

張秀玲. 201例產超廣譜β-內酰胺酶細菌感染病例分析[J].中國感染控制雜志，2015，14(4)：270-271.

[12]Xue Y, Chen JF, Zhang XY. Detection of extended-spectrum β-lactamases genotype and antibiotic resistance analysis amongE.coliisolates from chicken[J]. Chin J Vet Med, 2011, 4(47): 30-32. (in Chinese)

薛原，陳建飛，張秀英. 雞源大腸桿菌ESBLs基因型檢測及耐藥性分析[J].中國獸醫(yī)雜志，2011，4 (47):30-32.

[13]Harris PN, Tambyah PA, Paterson DL. β-lactam andβ-lactamase inhibitor combination in the treatment of extended-spectrumβ-lactamse producingEnterobacteriaceae: time for a reappraisal in the era of few antibiotic options?[J]. Lancet Infect Dis, 2015, 15(4): 475-485. DOI: 10.1016/S1473-3099(14)70950-8

[14]Tang D, Zhang HJ, Ji XW, et al. Prevalence of plasmid mediated ESBLs and AmpC-type β-lactamases amongE.coliisolated from sick food-producing animals in Guangdong[J]. Chin J Vet Sci, 2012, 32(2): 242-247. (in Chinese)

湯電，張浩吉，紀雪薇，等. 廣東地區(qū)患病食品動物源大腸桿菌ESBLs和AmpC酶流行分布調查[J]. 中國獸醫(yī)學報，2012，32(2): 242-247.

[15]Zhang ZZ, Wu JW, Wei SY, et al. Analysis of genotype ofEscherichiacoli-producing ESBLs and AmpC β-lactamases isolated from farm animals[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2009, 40(6): 898-903. (in Chinese)

張珍珍，吳俊偉，魏述永，等.動物源大腸桿菌超廣譜β-內酰胺酶與頭孢菌素酶基因型分析[J].畜牧獸醫(yī)學報，2009，40(6):898-903.

[16]Ghodousi A, Bonura C, Di Noto AM, et al. Extended-spectrum-lactamase, AmpC-producing, and fluoroquinolone-resistantEscherichiacoliin retail broiler chicken meat, Italy[J]. Foodborne Pathog Dis, 2015, 12(7): 619-625.

[17]Brolund A, Edquist PJ, Makitalo B, et al. Epidemiology of extended-spectrum β-lactamase -producingEscherichiacoliin Sweden 2007-2011[J]. Clin Microbiol Infect, 2014, 20 (6): 344-352. DOI: 10.1111/1469-0691.12413

[18]Wang XM, Jiang HX, Liao XP, et al. Prevalence of serotypes and virulence genes and antimicrobial susceptibility of pathogenicEscherichiacoliisolates from swine[J]. Scientia Agricultura Sinica, 2010, 43(19): 4109-4115. DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2010.19.025 (in Chinese)

王秀梅，蔣紅霞，廖小萍，等.豬源致病性大腸桿菌的血清型、毒力基因及抗菌藥耐藥性的調查[J]. 中國農業(yè)科學，2010，43(19): 4109-4115.

[19]Lu CP. Veterinary microbiology[M]. 3rd ed. Beijing: China Agriculture Press, 2001,215-218 (in Chinese)

陸承平. 獸醫(yī)微生物學[M].3版.北京：中國農業(yè)出版社，2001,215-218.

DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.04.018

通訊作者：林居純，Email: juchunlin@126.com

中圖分類號：R378.2

文獻標識碼：C 文章編碼：1002-2694(2016)04-0412-05

Corresponding author:Lin Ju-chun, Email: juchunlin@126.com

收稿日期：2015-07-20修回日期：2015-12-04

Surveillance of resistance, β-lactamase-producing and serotypes of E. coli isolates from animals in Sichuan Province, China

DAI Peng-fei1,SHU Gang2,LIN Ju-chun1,ZHONG Qin-qing1,DENG Lin1

(1.CollegeofVeterinaryMedicine,NewVeterinaryMedicineSafetyEvaluationLaboratoryofSichuanAgriculturalUniversity,Wenjiang611130,China2.CollegeofVeterinaryMedicineDepartementofPharmacy,SichuanAgriculturalUniversity(SICAI),Wenjiang611130,China)

Abstract:We investigated epidemiological characteristics of resistance, β-lactamase-producing and serotype of E. coli isolates in animals. Broth microdilution method was used to detect antimicrobial resistance; ESBLs, AmpC and carbapenemase production tests were performed on all isolates; O-antigen identification method was used to detect the serotypes of β-lactamase positive strains. The 467 isolates indicated different resistance to both β-lactam and non β-lactam; ESBLs, AmpC and carbapenemase were detected with the rates of 36.83%, 13.70% and 0.00%, respectively. β-lactamase positive isolates showed more serious resistance than negative isolates; 176 β-lactamase positive isolates belonged to 31 serotype and the major epidemic serotype were O131, O107, O78, O9, O127, O20and O157. The detection rate of ESBLs and AmpC was high in the isolates tested, the antibiotic resistance situation was serious, and the serotype of β-lactamase positive isolates was diversified, the surveillance of β-lactamase-producing and serotype of E. coli must be reinforced.

Keywords:E. coli; resistance; β-lactamase; serotype

國家科技支撐計劃(No.2012BAC01B06)