張　婷,龍　艷,張緒富,胡貴方，戴迎春

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我國GII.4型諾如病毒Sydney株P顆粒的表達及其組織血型抗原結合特征

張婷1,龍艷2,張緒富2,胡貴方1，戴迎春1

1.南方醫(yī)科大學公共衛(wèi)生與熱帶醫(yī)學學院，廣州510515；2.南方醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院，廣州510515

摘要：目的表達我國新發(fā)現GII.4型諾如病毒優(yōu)勢流行株—Sydney株的P顆粒，并探究其結合人類組織血型抗原(HBGAs)受體特征及變化規(guī)律。方法擴增SH 2012_05株中的P區(qū)域序列，構建進化樹分析其氨基酸序列，并在原核表達系統(tǒng)中表達P顆粒。目的重組蛋白經Western blot確定其特異性，并采用ELISA法檢測P顆粒結合HBGAs的能力及方式。結果SH 2012_05毒株 P區(qū)域與Sydney/2012原型株同源性為99.1%，為GII.4/Sydney基因簇。SDS-PAGE電泳和Western blot分析驗證SH 2012_05株P顆粒具有特異性。其結合HBGAs受體方式與以往流行的基因簇一致，即與A、B、O、AB型分泌型唾液均能結合，其中與B型抗原親和力最高。結論成功表達了我國新發(fā)現GII.4型諾如病毒Sydney株的P顆粒，明確了Sydney株能結合分泌型HBGAs受體的特征。本研究為諾如病毒疫苗株選擇提供了技術儲備，這將為GII.4型諾如病毒的預防和控制提供科學基礎。

關鍵詞：諾如病毒；GII.4型；Sydeny株；P顆粒；人類組織血型抗原

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Correspondence authors:Hu Gui-fang,Email:guif-hu@sina.com；Dai Ying-chun, Email: yingchun78@hotmail.com.

諾如病毒(Norovirus, NoV)具有基因多樣性，分為5個不同的基因型GI-GV，其中GII.4型是全球優(yōu)勢流行株，每隔1～3年就有新的GII.4變異株出現，包括95/96US株(1995-1996年)、Farmington Hills株(2002-2004年)、Hunter株(2004-2006年)、2006a株和2006b株、Osaka株(2007年)New Orleans株(2009年)和Sydney株(2012年)。NoV以株別特異性的方式識別人組織血型抗原(Histo-blood antigens,HBGAs)[1-2],HBGAs是一類復合糖，不僅存在于血細胞、腸道粘膜細胞表面，也以游離的形式存在于乳汁、唾液中。NoV與HBGAs抗原結合模式主要分為3組：H抗原、A/B抗原和Lewis抗原結合模式[3-4]。

自2012年9月起，歐洲NoV監(jiān)測網絡發(fā)現全球NoV胃腸炎患者呈現大幅度上升，經過后期基因分析證實，NoV胃腸炎的暴發(fā)增加與一種新型GII.4型變異株有關，該變異株被命名為Sydney株。GII.4型Sydney變異株首先在丹麥等地的散發(fā)病例中發(fā)現，隨后引起疫情暴發(fā)造成世界范圍內的大流行[5]。2012年底至2013年初，我國北京、香港、廣州、江蘇省等地區(qū)均有GII.4型Sydney株的流行[6-9]。本研究表達了NoV Sydney株的受體結合區(qū)(P區(qū)域)并制備P顆粒，研究了Sydney株P顆粒與HBGAs之間的結合模式，確定其感染的宿主范圍，為豐富我國GII.4型諾如病毒進化規(guī)律及GII.4型諾如病毒的預防和控制提供科學基礎。

1材料與方法

1.1病毒株和唾液標本GII.4型NoV SH 2012_05株來自上海市金山區(qū)疾病預防控制中心2012年的腹瀉樣本[11]，唾液標本為本研究室保存，HBGAs表型已明確[12]。

1.2試劑Roche(羅氏)病毒RNA提取試劑盒，QIAGEN OneStep RT-PCR Kit、Takara高保真酶、感受態(tài)細胞Top10及BL21購自TIANGEN,CloneJET PCR Cloning Kit、小量質粒提取試劑盒和瓊脂糖切膠回收試劑盒購自Thermo Scientific公司，限制性內切酶BamHI和NotI購自Fermentas公司，GST-Resin購自上海七海復泰生物科技有限公司，Thrombin酶購自GE公司，表達載體PGEX-4T-1為本實驗室保存。

1.3病毒核酸提取采用PBS液(pH=7.4)將糞便樣本制備成10%的懸液,按照羅氏病毒RNA提取試劑盒的說明操作提取RNA樣本，-80 ℃保存。1.4SH 2012_05株P區(qū)域基因克隆根據GII.4/Sydney株ORF2序列設計擴增P區(qū)域的特異性引物Sydney F/R，如表1所示。以上述提取的病毒株SH 2012_05 RNA為模板，RT-PCR反應參數：50 ℃逆轉30 min；95 ℃預變性15 min；94 ℃ 1 min；50 ℃ 1 min；72 ℃ 1 min，40個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，擴增條帶大小約1 kb。將PCR產物連接到T-easy載體上，通過測序進行鑒定，根據測序結果，利用Mega 6.0軟件，選取具有代表性的NoV GI和GII型參考株共16株構建NoV P區(qū)域的進化樹，采用Clustal W和Neighbor-joining法進行比對和構建。

表1GII.4型NoV Sydney株P區(qū)基因片段擴增所用引物

Tab.1Primers used for the P region genes of GII.4 NoV Sydney

PrimerSequence(5'-3')SydneyFTCAAGAACTAAACCATTCTCSydneyRTTATAGTGCACGTCTACGCSydney(p)FGCACGGATCCTCAAGAACTAAACCAT-TCTCSydney(p)RGCATGCGGCCGCTTAGCAAAAG-CAATCGCCACGGCAATCGCATAGTG-CACGTCTACGC

1.5重組P顆粒表達載體構建設計的擴增P區(qū)的特異性引物，其上下游引物中分別引入BamHI和NotI限制性內切酶酶切位點，并在下游引物C末端加入CDCRGDCFC修飾氨基酸序列以促進P顆粒的形成[13]，粗體標記為限制性內切酶酶切位點BamHI和NotI，斜體標記為CDCRGDCFC修飾氨基酸序列，見表1。以SH 2012_05株RNA為模板進行RT-PCR擴增，將擴增產物連接到T-easy載體上。重組P區(qū)域克隆和表達載體PGEX-4T-1分別用BamHI和NotI雙酶切，將產物進行回收純化后連接并將連接產物轉化至TOP10感受態(tài)細菌。通過酶切和測序確定重組質粒中插入的序列。

1.6SH 2012_05株P顆粒制備經鑒定的重組質粒轉化到BL21(DE3)進行原核表達，通過SDS-PAGE電泳鑒定重組融合蛋白。利用GST蛋白瓊脂糖4B親和純化柱對重組融合蛋白純化，純化后利用凝血酶除去融合蛋白的標簽部分。將純化的目的蛋白洗脫下來后用于Western blot鑒定和結合HBGAs受體的特性研究。

1.7P顆粒的Western blot鑒定分析取10 μL樣品于SDS-PAGE凝膠電泳，轉印至硝酸纖維素膜，膜依次用5 %脫脂奶封閉、鼠抗NoV多抗血清(1∶1 000)、羊抗鼠辣根過氧化物IgG(1∶3 000)孵育、PBST充分洗滌，最后HRP-DAB底物顯色。

1.8ELISA法檢測P顆粒與HBGAs受體的結合特性將唾液標本用PBS(pH=7.4)按1∶1 000稀釋，包被于96孔酶聯(lián)板(100 μL/孔)過夜，5 %脫脂奶封閉1 h，將SH 2012_05株和GII.4/2004株 (本實驗室保存)P顆粒用PBS稀釋成20 μg/mL，37 ℃孵育1 h，每孔加入鼠抗NoV多抗血清(1∶1 000)100 μL，37 ℃孵育1 h，再加入羊抗鼠辣根過氧化IgG(1∶3 000)37 ℃孵育1 h，加入TMB避光顯色10 min，最后加入2 mol H3PO4終止顯色，酶標儀450 nm波長處測定OD值。

2結果

2.1P區(qū)域基因擴增及氨基酸序列進化樹構建獲得NoV P區(qū)域基因片段，大小為1 kb，片段連接至T-easy載體。進化樹結果顯示：SH 2012_05株和SH 2012_06株與GII.4型NoV參考株在同源性上達到88%～99.1%，與Sydeny/2012原型株同源性達到99.9%，且劃分為同一分支，系統(tǒng)進化樹見圖1，結合氨基酸序列分析2012年上海市金山區(qū)NoV暴發(fā)現場分離的病毒株屬于NoV新型變異株 GII.4/Sydeny/2012。

圖1　NoV P區(qū)域氨基酸序列進化樹構建Fig.1　Phylogenic tree of amino acid sequences of NoV P domain

2.2重組P顆粒表達載體的建立選用SH 2012_05株用于P顆粒的表達。重組質粒酶切電泳鑒定，1 %瓊脂糖電泳酶切后的P區(qū)域片段和線性PGEX-4T-1載體，大小分別為1 kb和4.9 kb，證明已將SH 2012_05株 P區(qū)域成功導入表達載體PGEX-4T-1，完成了重組表達載體的構建。

注：M:蛋白分子量標準；1～4：P顆粒；5：GST-P融合蛋白M: Protein marker; 1-4: P particle; 5: GST-P fusion protein.圖2　GST融合P顆粒大腸桿菌表達及P顆粒的純化Fig.2　Production of P-GST fusion protein and purification of the P particle

2.3SH 2012_05株P顆粒的誘導表達根據SDS-PAGE電泳如圖2所示，重組融合蛋白大小為63 kD，經凝血酶除去GST標簽蛋白后，獲得約為36 kD的目的蛋白，與預期P顆粒大小一致。為了進一步驗證原核表達系統(tǒng)表達P顆粒的特異性，將SDS-PAGE凝膠分離的目的蛋白轉印到PVDF膜上，經特異性抗體進行Western blot分析，在大小為36 kD位置顯示條帶見圖3,證明了研究所用的原核表達系統(tǒng)BL21(DE3)表達的重組P顆粒具有特異性。2.4GII.4型 NoV Sydney株唾液結合模式SH 2012_05 Sydney株與唾液HBGAs的結合模式，如圖4所示SH 2012_05株基因簇毒株與A、B、O、AB型分泌型唾液均能結合，其中結合B型抗原親和力最高[4]；與非分泌型唾液不結合。

注：M：蛋白分子量標準；1：GST-P融合蛋白；2：P顆粒蛋白M: Protein marker; 1: GST-P fusion protein; 2: P particle.圖3　重組SH 2012_05株P顆粒的Western blot印跡分析Fig.3　Western blot analysis of re-combinant P particle of SH 2012_05 strain

圖4　Sydney株P顆粒與唾液HBGAs受體結合能力Fig.4　Binding activity of Sydney strain with HBGAs receptor

3討論

NoV結構蛋白VP1是主要的抗原決定簇，研究表明在NoV P區(qū)域C末端加入CDCRGDCFC修飾氨基酸序列可以促進P顆粒的形成。由于人類NoV至今尚不能在細胞中有效的培養(yǎng)，也沒有合適的感染動物模型，作為候選亞單位疫苗的P顆粒[10]已同時成為研究NoV與受體結合模式研究的重要手段。

自20世紀90年代確認GII.4 型NoV導致絕大部分NoV胃腸炎暴發(fā)以來，GII.4一直為全球優(yōu)勢流行株。其傳染性強極易引起暴發(fā)流行，帶來了沉重的疾病負擔。2012年底，新出現的GII.4/2012基因簇(代表株Sydney株)，亦蔓延至歐美、亞洲造成新一輪的世界大流行，已至少造成幾百萬人感染。GII.4型NoV的疫苗研究是預防和控制NoV的重要手段，其疫苗株的選擇和儲備是當前研究的熱點。本研究成功的表達了Sydney株的P顆粒，為疫苗株的選擇及亞單位疫苗研制開發(fā)提供了技術儲備。

GII.4型NoV每隔2～3年形成新的基因簇，并導致新一輪的全球流行。其進化的分子機制對于理解NoV的流行病學，尤其是制定疫苗研制策略至關重要。目前，GII.4型NoV的分子進化機制尚不明確，初步認為宿主受體識別、宿主免疫、序列空間及復制動力學這4個因素可能是影響其進化方向和速度的重要因素；其中宿主受體的識別機制及宿主免疫壓力被認為是最主要因素[14-15]。

HBGAs是一類具有高度多態(tài)性的糖類抗原，廣泛分布于紅細胞、呼吸道，泌尿生殖和消化道粘膜上皮細胞表面。北美和歐洲人群中，分泌型人群約占80%，而中國人群中，分泌型的人群占80%～90%。近30年來，GII.4型一直是全球流行的主要病毒株，我們前期研究表達了除Sydney以外GII.4不同基因簇的P顆粒，結果表明1987-2012年近20年間不同基因簇P顆粒結合HBGAs的親和力存在差異，但結合模式相似，即與A、B、O型分泌型結合，與非分泌型不結合[4,16]。本研究表達了我國的Sydney株P顆粒，與前期結果一致。Sydney株保持了GII.4能識別所有分泌型HBGA受體的能力，進一步表明了Sydeny株能廣譜的易感宿主是成為新的世界流行株的重要原因之一。

本研究成功表達了我國新現GII.4 NoV優(yōu)勢流行株Sydney株，為我國進一步研制開發(fā)NoV疫苗提供了技術儲備；研究進一步豐富了我國GII.4型NoV進化規(guī)律，這將為GII.4型諾如病毒的預防和控制提供科學基礎。

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DOI：10.3969/j.issn.1002-2694.2016.04.006

通訊作者：胡貴方，Email:guif-hu@sina.com；

中圖分類號：R373.9

文獻標識碼：A

文章編號：1002-2694(2016)04-0344-05

收稿日期：2015-10-09修回日期：2016-01-23

Expression of NoV GII-4 Sydney strain P particle and analysis of its binding activity with HBGAs receptor in China

ZHANG Ting1, LONG Yan2, ZHANG Xu-fu2, HU Gui-fang1,DAI Ying-chun1

(1.DepartmentofEpidemiology,SchoolofPublicHealthandTropicalMedicine,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China;2.SchoolofTraditionalChineseMedicine,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China)

Abstract:There was a newly emerging predominant GII.4 norovirus, Sydney variants, in China. To explore its binding patterns with HBGAs receptor, we cloned the P domain genes of norovirus SH 2012_05 and constructed recombinant plasmid. After that we expressed P particle by prokaryotic system and determined its binding profile by using ELISA saliva method. Like former studies, results showed that SH 2012_05 P particle could bind to saliva of all kind of secretors, including A-group, B-group, AB-group, O-group, in which it showed stronger binding affinity to B-group. In the present study, technical reserve of P particle was stored as a choice for vaccine candidate, which provides a scientific basis to prevent and control GII.4 norovirus.

Keywords:norovirus; GII.4 genotype; Sydney strain; P particle; human histo-blood group antigen

國家自然科學基金 (No.81473402)；廣東省自然科學基金(No.2014A030313332)和南方醫(yī)科大學公共衛(wèi)生與熱帶醫(yī)學學院第十期院長基金(No.GW201503)聯(lián)合資助

戴迎春，Email: yingchun78@hotmail.com