歐志英　吳韶清　尹應(yīng)先　李麗霞　周榮　徐翼　龔四堂

?

一種初步快速甄別總腸道病毒的基因分型方法

歐志英★吳韶清尹應(yīng)先李麗霞周榮徐翼龔四堂

［摘要］目的建立并驗(yàn)證總腸道病毒5′?非編碼區(qū)（5′?non coding region,5′?NCR）PCR擴(kuò)增測序并在NCBI數(shù)據(jù)庫比對進(jìn)行生物信息分析的方法，為手足口病的早期快速診斷提供敏感、高效的總腸道病毒分子分型檢測方法。方法收集165例臨床檢測陽性的標(biāo)本，提取總RNA擴(kuò)增人腸道病毒A、B、C和D型5′端非編碼區(qū)用于總腸道病毒初步基因分型，PCR產(chǎn)物測序并在Genbank中進(jìn)行BLAST分析。結(jié)果成功從臨床咽拭子標(biāo)本中擴(kuò)增了5′?NCR用于基因分型。165例總腸道病毒陽性標(biāo)本中鑒定出12種腸道病毒類型，有77例人腸道病毒（enterovirus type 71，EV?71），37例人柯薩奇病毒（coxsackievirus，CV）CV?A16，31例CV?A4，20例其它型別。結(jié)論5′?NCR PCR測序是總腸道病毒基因分型和監(jiān)測的敏感、簡單、早期、快速的檢測方法。

［關(guān)鍵詞］手足口??；腸道病毒；分子流行病學(xué)；分子分型

手足口病是常見的兒童急性感染性疾病，主要由腸道病毒（enterovirus,EV）感染引起［1］，過去幾十年在亞太地區(qū)很常見，曾在馬來西亞、臺(tái)灣、新加坡、中國大陸爆發(fā)流行［2?3］，導(dǎo)致成千上萬兒童死亡，大多數(shù)患者癥狀較輕，為一過性自限疾病，少數(shù)癥狀嚴(yán)重。感染后大部份患者會(huì)出現(xiàn)發(fā)燒，體溫超過38.5℃［4］，并伴有手、足、口腔部位皮疹、皰疹、潰瘍?yōu)榈湫捅憩F(xiàn)［5］，個(gè)別重度感染可引起肺水腫、病毒性腦膜炎或腦膜腦炎、皰疹性咽峽炎、病毒性心肌炎甚至死亡［6］。

腸道病毒在分類上屬微小核糖核酸（RNA）病毒科，人腸道病毒由至少72個(gè)血清型組成，種類有人脊髓灰質(zhì)炎病毒、人柯薩奇病毒（coxsacki?evirus，CV）A組、B組、?？刹《荆‥cho）和新型腸道病毒。人柯薩奇病毒A組有1~22型和24型，B組有1~6型，新型腸道病毒有68~72型［7-8］。大多數(shù)手足口病是人柯薩奇病毒和新型腸道病毒感染引起［5］，人柯薩奇病毒A16型和EV?71是最常見類型。

近些年手足口病發(fā)病有上升趨勢，呈普遍性、爆發(fā)性流行，危害兒童健康發(fā)展。臨床上手足口病感染無特異、高效的疫苗和治療藥物，只能對癥支持治療，積極防止發(fā)生并發(fā)癥。早確診、早治療是該病愈后的關(guān)鍵。目前手足口病實(shí)驗(yàn)室檢測的方法有病毒分離培養(yǎng)、血清學(xué)實(shí)驗(yàn)、核酸分子檢測，確診的金標(biāo)準(zhǔn)仍然是病毒分離培養(yǎng)。病毒分離培養(yǎng)和血清學(xué)實(shí)驗(yàn)耗時(shí)較長，核酸分子檢測一般針對EV?71和/或CV?A16進(jìn)行檢測，不利于疾病診斷、監(jiān)測和治療，亟待開發(fā)簡單、高效、快速診斷的對總腸道病毒進(jìn)行檢測和分型的試劑。本研究的目的是建立并驗(yàn)證總腸道病毒5′?非編碼區(qū)（5′?non coding region，5′?NCR）PCR擴(kuò)增測序并在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行生物信息比對分析的方法，為手足口病的早期快速病原診斷提供敏感、高效的總腸道病毒分子分型檢測方法。

1　材料與方法

1.1臨床標(biāo)本及RNA提取

2008年5月至7月在廣州市婦女兒童醫(yī)療中心收集165例臨床檢測陽性的手足口病門診患者的咽拭子標(biāo)本。取200 μL咽拭子浸出液，用RNA提取試劑盒QIAamp Viral RNA Mini kit（Qiagen，美國）提取總RNA，最后溶解在無菌、無RNA酶的DEPC水中。

1.2引物設(shè)計(jì)

通過生物信息比對分析，在NCBI數(shù)據(jù)庫中找出所有腸道病毒核酸序列，在其保守區(qū)，即5′?NCR設(shè)計(jì)了一對簡并引物：上游引物PEF：5′?AYCYTT?GTRCGCCTGTTTT?3′，下游引物PER：5′?CCCA AAGTGTCGGTTCCGC?3′（圖1）。血清型包括CV?A1~A24型、B1~B6型，EV?71的Taiwan、Shenzhen、Korea、Singapore病毒株，?？刹《?~7、9、11~17、19~22、24~26和29~33型。

1.3RT?PCR

50 μL一步法RT?PCR擴(kuò)增體系包含：1×一步法RNAPCR緩沖液、上下游引物濃度分別為0.3μM、1.5 mM MgCl2、200 μM dNTP、40 U Rnase抑制劑、5 U AMV逆轉(zhuǎn)錄酶XL、5 U AMV Taq DNA聚合酶、8 μL RNA模板。逆轉(zhuǎn)錄條件為：94℃預(yù)變性2 min，50℃30 min；PCR擴(kuò)增條件94℃變性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸45 s；共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳、0.5 mg/mL EB染色。

1.4PCR產(chǎn)物純化和測序分析

PCR產(chǎn)物膠分離后用割膠純化試劑盒QIA?quick Gel Extraction kit（Qiagen，美國）純化。測序試劑盒為ABI PRISM Big Dye Terminator Cycle Se?quencing Ready Kit（Applied Biosystems Inc.，美國），測序儀為Genetic Analyzer 377（Applied Bio?systems Inc.，美國）。

1.5序列解讀

每個(gè)臨床標(biāo)本5′?NCR PCR?測序所得序列都與NCBIGenBank（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/ Blast.cgi）中的各型人腸道病毒血清型序列兩兩比對，根據(jù)查詢覆蓋得分和同一性得分得出各標(biāo)本的血清型。本研究中501 bp的5′?NCR序列一致性得分大于91%時(shí)被視為同一腸道病毒血清型。

1.6敏感性和特異性

EV?71病毒標(biāo)準(zhǔn)株純化培養(yǎng)用于檢測本方法的靈敏性，病毒滴度分別稀釋為1×106、1×105、1× 104、1×103、1×102、1×101和1×100拷貝數(shù)/μL，RNA分別提取并用一步法擴(kuò)增。同時(shí)用EV?71和CV?A16的陽性標(biāo)本、非腸道病毒標(biāo)本流感A、流感B、呼吸道合胞病毒、皰疹病毒檢測了本方法的特異性。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)評價(jià)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，P<0.05被視為有顯著差異。

2　結(jié)果

2.1一步法RNA PCR

簡并引物成功地?cái)U(kuò)增了臨床標(biāo)本，具有特異、有效的特點(diǎn)，擴(kuò)增片段長度為501 bp，符合我們的設(shè)計(jì)（圖2）。

2.2手足口病患者血清型分布

本研究165例腸道病毒感染陽性，其中77例EV?71（46.67%）、31例CV?A4（18.79%）、37例CV?A16（22.42%）、20例（12.12%）其他腸道病毒血清型，序列同源性基本達(dá)到97%以上（表1）。5′?NCR PCR產(chǎn)物測序成功，獲得12種腸道病毒血清型。

2.3敏感性和特異性

用EV?71病毒檢測本方法靈敏性，結(jié)果表明本方法能成功擴(kuò)增1×108拷貝數(shù)/μL、1×107拷貝數(shù)/ μL、1×106拷貝數(shù)/μL、1×105拷貝數(shù)/μL、1×104拷貝數(shù)/μL、1×103拷貝數(shù)/μL，PCR條帶的亮度隨病毒滴度下降而變?nèi)酰▓D3），本方法能有效擴(kuò)增EV?71和CV?A16，其他病原體流感A、流感B、腺病毒、呼吸道合胞病毒、皰疹病毒未擴(kuò)增出任何條帶（圖4）。

3　討論

手足口病是一類伴發(fā)熱的疾?。w溫大于37.5℃），是相對溫和的自限性疾病，過去幾十年頻繁爆發(fā)，而且呈現(xiàn)出上升趨勢，也有重癥死亡的病例，成為亞太地區(qū)重要的公共衛(wèi)生問題，手足口病重癥致死與腸道病毒血清型有關(guān)，主要是腸道病毒A型感染引起。CV?A16、EV?71、Echo和CV?B組是最常見的病因［9-11］。CV?A16最早于1957年在加拿大分離獲得［12］，1968至1974年日本爆發(fā)手足口病主要是CV?A16引起［13］。20世紀(jì)70年代以后EV?71成了手足口病的主要病因［14］。本文提供了總腸道病毒同時(shí)檢測的方法，2008年5月至7月在我們醫(yī)院就診患者中手足口病爆發(fā)時(shí)檢出EV?71和CV?A16為主（表1），EV?71感染可引起病毒性腦炎或腦膜腦炎，CV?A16感染可引起病毒性心肌炎，因此結(jié)合臨床癥狀，早期病原監(jiān)測為患者爭取更多的時(shí)間用于臨床治療意義重大。

腸道病毒鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)是病毒分離和培養(yǎng)，隨后用中和實(shí)驗(yàn)確定血清型。這一傳統(tǒng)的診斷方法有其缺點(diǎn)：（1）耗時(shí)、費(fèi)力，時(shí)間長；（2）64種血清型抗體庫中只有40種抗體，有時(shí)存在交叉反應(yīng)；（3）全球范圍30年前制備的抗血清有限；（4）毒株或抗原變異導(dǎo)致抗體凝集［15-16］；（5）有些腸道病毒在細(xì)胞中復(fù)制能力較差難以分型；（6）當(dāng)需要更深入地了解更多詳細(xì)的病毒特征時(shí)，需要同時(shí)接種多種細(xì)胞株進(jìn)行病毒分離培養(yǎng)，找出敏感的細(xì)胞株，耗時(shí)費(fèi)力，工作量非常大［17］。

腸道病毒分子流行病學(xué)分析通常是以衣殼蛋白VP1為基礎(chǔ)分析，VP1具有型特異性［15-16，18］，在疾病爆發(fā)早期能繞過病毒分離培養(yǎng)，有助于集中有限的資源，快速鑒定病例之間的流行病學(xué)關(guān)聯(lián)分析。VP1基因分析方法只針對一種血清型設(shè)計(jì)，一次分析無法針對所有的腸道病毒血清型，而且擴(kuò)增效率不高，擴(kuò)增片段短，簡并引物不適合直接PCR產(chǎn)物測序、VP1基因序列存在復(fù)雜變異等缺點(diǎn)限制了VP1在總腸道病毒分析中的應(yīng)用，總腸道病毒基因分型需要多對引物和多個(gè)反應(yīng)才能完成，目前沒有快速有效的針對總腸道病毒進(jìn)行基因分型的方法。在疾病爆發(fā)時(shí)總腸道病毒分析變得復(fù)雜，單個(gè)的VP1基因分析不足以監(jiān)測和甄別不同類型的總腸道病毒。研究表明5′?NCR的系統(tǒng)發(fā)生與腸道病毒血清型無直接關(guān)系［19］。但我們通過對所有腸道病毒序列比對分析表明，5′?NCR存在高度同源性，但各血清型之間也存在差異性，于是在總腸道病毒的保守區(qū)設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增，確保單管單反應(yīng)能擴(kuò)增出所有腸道病毒血清型，我們的結(jié)果表明該方法能特異地?cái)U(kuò)增總腸道病毒，以不同病毒滴度的EV?71驗(yàn)證本方法的靈敏度，1×103拷貝數(shù)/μL的標(biāo)本能成功擴(kuò)增，方法學(xué)上達(dá)到了目前PCR方法的靈敏度標(biāo)準(zhǔn)。

表1　手足口病病例和腸道病毒血清型分布Table 1　Distribution of HFMD case and enterovirus serotypes

腸道病毒血清型鑒定對臨床患者管理有一定的意義，分子分型還可以在疾病監(jiān)測方面提供有價(jià)值的流行病學(xué)信息。通過我們建立的PCR?測序方法從臨床樣本中鑒定了CV A型、CV B型、EV?71的不同分離株和?？刹《尽难芯拷Y(jié)果可知有12種腸道病毒與2008年手足口病爆發(fā)有關(guān)，其中EV?71 和CV占的比例最大，可能是引起此次爆發(fā)的主要病原。

我們所建立的方法優(yōu)點(diǎn)在于，首先是基于單管單反應(yīng)，其次是一步法RT?PCR擴(kuò)增測序獲得了501 bp的擴(kuò)增片段，含746核苷酸的5′?NCR是腸道病毒基因組的重要區(qū)域，負(fù)責(zé)起始RNA合成、病毒蛋白表達(dá)調(diào)節(jié)，是一個(gè)相對穩(wěn)定的區(qū)域，對病毒宿主反應(yīng)和致病性至關(guān)重要，具有91%以上同源性的序列分析表明501 bp擴(kuò)增片段可以保證血清分型的準(zhǔn)確性和特異性。獲取臨床標(biāo)本后，1 h內(nèi)完成RNA提取，RT?PCR擴(kuò)增2 h內(nèi)完成，測序也在3 h內(nèi)完成，所以一旦有手足口病疫情，不管是哪一種腸道病毒引起，一天之內(nèi)就可以出具分析報(bào)告，指導(dǎo)臨床治療和衛(wèi)生決策。綜上所述，本方法具有快速、方便、準(zhǔn)確、高效的特點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)

［1］Ooi MH，Wong SC，Mohan A，et al.Identification and validation of clinical predictors for the risk of neu?rological involvement in children with hand，foot，and mouth disease in Sarawak［J］.BMC Infect Dis，2009，9：3.

［2］Yap MS，Tang YQ，Yeo Y，et al.Pluripotent human embryonic stem cell derived neural lineages for in vitro modelling of enterovirus 71 infection and therapy［J］. Virol J，2016，13：5.

［3］Xing W，Liao Q，Viboud C，et al.Hand，foot，and mouth disease in China，2008?12：an epidemiological study［J］.Lancet Infect Dis，2014，14（4）：308?318.

［4］Lee DS，Lee YI，Ahn JB，et al.Massive pulmonary hemorrhage in enterovirus 71?infected hand，foot，and mouth disease［J］.Korean J Pediatr，2015，58（3）：112?115.

［5］Grist NR，Bell EJ，Assaad F.Enteroviruses in human disease［J］.Progress in Medical Virology.Fortschritte Der Medizinischen Virusforschung.Progres En Virolo?gie Medicale，1978，24：114-157.

［6］Tao Z，Wang H，Li Y，et al.Molecular epidemiology of human enterovirus associated with aseptic meningi?tis in Shandong province，China，2006-2012［J］. Plos one，2014，9（2）：e89766.

［7］Fauquet CM，Mayo MA，Maniloff J，et al.Virus tax?onomy：eighth report of the international committee on taxonomy of viruses［M］.San Diego：Elsevier Aca?demic Press，2005.

［8］Brown BA，Pallansch MA.Complete nucleotide se?quence of enterovirus 71 is distinct from poliovirus［J］. Virus research，1995，39（2-3）：195-205.

［9］Itagaki A，Ishihara J，Mochida K，et al.A clustering outbreak of hand，foot，and mouth disease caused by Coxsackie virus A10［J］.Microbiology and immunolo?gy，1983，27（11）：929-935.

［10］Lum LC，Chua KB，mcMinn PC，et al.Echovirus 7 associated encephalomyelitis［J］.Journal of clinical vi?rology，2002，23（3）：153-160.

［11］Chan YF，AbuBaker S.Recombinant human enterovi?rus 71 in hand，foot and mouth disease patients［J］. Emerging infectious diseases，2004，10（8）：1468-1470.

［12］Drebot MA，Campbell JJ，Lee SH.A genotypic char?acterization of enteroviral antigenic variants isolated in eastern Canada［J］.Virus research，1999，59（2）：131-140.

［13］Hosoya M，Kawasaki Y，Sato M，et al.Genetic diver?sity of coxsackievirus A16 associated with hand，foot，and mouth disease epidemics in Japan from 1983 to 2003［J］.Journal of clinical microbiology，2007，45 （1）：112-120.

［14］Brown BA，Oberste MS，Alexander JP，et al.Molecu?lar epidemiology and evolution of enterovirus 71 strains isolated from 1970 to 1998［J］.Journal of virology，1999，73（12）：9969-9975.

［15］Oberste MS，Maher K，Kilpatrick DR，et al.Typing of human enteroviruses by partial sequencing of VP1 ［J］.Journal of clinical microbiology，1999，37（5）：1288-1293.

［16］Oberste MS，Maher K，F(xiàn)lemister MR，et al.Compari?son of classic and molecular approaches for the identifi? cation of untypeable enteroviruses［J］.Journal of clini?cal microbiology，2000，38（3）：1170-1174.

［17］Nix WA，Oberste MS，Pallansch MA.Sensitive，seminested PCR amplification of VP1 sequences for di?rect identification of all enterovirus serotypes from original clinical specimens［J］.Journal of clinical mi?crobiology，2006，44（8）：2698-2704.

［18］Li J，Sun Y，Du Y，et al.Characterization of cox?sackievirus A6?and enterovirus 71?associated hand foot and mouth disease in Beijing，China，from 2013 to 2015［J］.Front Microbiol，2016，7：391.

［19］Siafakas N，Markoulatos P，Stanway G.Molecular classification of coxsackie A viruses on the basis of the 5′?UTR：structural and evolutionary aspects［J］.J Mol Evol，2002，55（6）：638-652.

★通訊作者：歐志英，E?mail：ou_zhiying@qq.com

基金項(xiàng)目：廣東省自然科學(xué)基金（S2012010009538,2016A030313501）；廣州市婦女兒童醫(yī)療中心博士啟動(dòng)基金（2008031）

作者單位：廣州市婦女兒童醫(yī)療中心，廣東，廣州510623

A rapid genotyping assay for primary total enterovirus screening

OU Zhiying★,WU Shaoqing,YIN Yingxian,LI Lixia,ZHOU Rong,XU Yi,GONG Sitang
(Guangzhou Women and Children′s Medical Center,Guangzhou,Guangdong,China,510623)

［ABSTRACT］ObjectiveTo establish and verify an anaytical method for total enterovirus genotyping.Through 5’?non coding regions PCR amplification,sequencing and Blast in NCBI databases,this method aims to provide a sensitive,efficient and early rapid genotyping detection for hand,foot and mouth disease.MethodsThroat swab samples from 165 cases of HFMD are collected for RNA extraction.Direct total enterovirus genotyping was carried out by amplifying the 5′?non coding region of human enterovirus species group A,B,C and D.PCR products were sequenced and blasted in Genbank.ResultsThe 5′?non coding region was successfully amplified for total enterovirus genotyping.12 types of enterovirus were successfully identified from 165 positive clinical cases.There are 77 cases of EV?71,37 cases of CV?A16,31 cases of CV?A4,20 cases of other types.ConclusionThe 5′?non coding region PCR?sequencing is a sensitive,simple, early,and rapid method for HFMD pathogen genotyping and surveillance.

［KEY WORDS］Hand,foot and mouth disease(HFMD);Enterovirus;Molecular epidemiology; Genotyping