姜烈君　陸曉旭　　黃華藝，2★

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下一代測(cè)序技術(shù)的臨床應(yīng)用規(guī)范化問題
——參考美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)會(huì)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)

姜烈君1陸曉旭1黃華藝1，2★

［摘要］下一代測(cè)序（next generation sequencing，NGS）技術(shù)已經(jīng)在臨床實(shí)驗(yàn)室中得到應(yīng)用。該技術(shù)的發(fā)展以及檢測(cè)規(guī)模和應(yīng)用范圍的擴(kuò)大，使基因檢測(cè)成本大大降低。NGS技術(shù)在臨床上的應(yīng)用在不斷地?cái)U(kuò)大，如疾病靶向基因組套檢測(cè)、個(gè)體外顯子組或全基因組分析等。同時(shí)，NGS技術(shù)也進(jìn)一步改善了治療決策和對(duì)某疾病高危人群的預(yù)測(cè)。然而，NGS技術(shù)的發(fā)展也充滿了挑戰(zhàn)性，包括測(cè)序平臺(tái)和技術(shù)更新帶來(lái)的選擇困惑、測(cè)序結(jié)果的臨床驗(yàn)證的不一致性問題等。為了幫助臨床實(shí)驗(yàn)室更好地了解NGS技術(shù)、解決臨床驗(yàn)證和正確選擇NGS測(cè)序平臺(tái)和方法，以及持續(xù)監(jiān)控NGS并保證高質(zhì)量的測(cè)序結(jié)果及其臨床解釋，本文結(jié)合美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和基因組學(xué)會(huì)（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）關(guān)于NGS技術(shù)在臨床上的應(yīng)用的專業(yè)標(biāo)準(zhǔn)和指南進(jìn)行歸納和討論，供我國(guó)分子診斷工作者制定國(guó)內(nèi)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)時(shí)參考。

［關(guān)鍵詞］美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和基因組學(xué)會(huì)；下一代測(cè)序；疾病靶向的基因組套測(cè)序；外顯子組測(cè)序；全基因組測(cè)序

下一代測(cè)序（next generation sequencing，NGS）技術(shù)是一種利用克隆擴(kuò)增或單分子模板技術(shù)進(jìn)行的大規(guī)模平行測(cè)序。NGS技術(shù)發(fā)展很快，目前已廣泛應(yīng)用于臨床。NGS技術(shù)具有高通量和低單堿基成本的特點(diǎn)，但至今為止，該技術(shù)用于臨床檢測(cè)仍存在許多問題。比如，測(cè)序流程的標(biāo)準(zhǔn)化、測(cè)序平臺(tái)和技術(shù)原理不同使用戶在選擇上產(chǎn)生困擾、測(cè)序結(jié)果中數(shù)據(jù)分析的差異性以及結(jié)果與臨床的不一致性問題等。為此，本文結(jié)合美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和基因組學(xué)會(huì)（American College of Medical Ge?netics and Genomics，ACMG）關(guān)于NGS技術(shù)的專業(yè)標(biāo)準(zhǔn)和指南進(jìn)行歸納和討論，供我國(guó)分子診斷工作者參考。

1　NGS分析概況

1.1NGS的3種分析水平

NGS技術(shù)按復(fù)雜度從低到高分為疾病靶向的基因檢測(cè)組套、外顯子測(cè)序（exome sequencing，ES）和基因組測(cè)序（genome sequencing，GS）3種。疾病靶向基因檢測(cè)組套用于檢測(cè)已知的疾病相關(guān)基因，它只對(duì)與某疾病相關(guān)的基因進(jìn)行測(cè)序，因此分析的靈敏度和特異性較高。在設(shè)備選擇方面，小型的臺(tái)式測(cè)序儀即可滿足此類檢測(cè)的要求，其所產(chǎn)生的數(shù)據(jù)量也較小，對(duì)數(shù)據(jù)存儲(chǔ)需求也不高。ES是一種檢測(cè)基因組中所有編碼區(qū)域的測(cè)序方法，該方法主要用于檢測(cè)已知疾病相關(guān)基因突變或發(fā)現(xiàn)新型致病基因。ES的測(cè)序能力和成本介于疾病靶向基因組套和GS之間，分析靈敏度低于大多數(shù)疾病靶向基因組套測(cè)序，分析的特異性也可能隨測(cè)序效率的減弱而相應(yīng)地降低，因此需要進(jìn)行Sanger測(cè)序確認(rèn)以排除假陽(yáng)性突變信號(hào)。GS是全基因組測(cè)序，覆蓋編碼和非編碼區(qū)域，其優(yōu)點(diǎn)是預(yù)測(cè)序樣品制備簡(jiǎn)單，不需要靶區(qū)域的PCR或雜交富集步驟。由于GS在非編碼變異體的解釋上不理想，所以通常先對(duì)編碼區(qū)進(jìn)行分析。如果未發(fā)現(xiàn)致病突變，那么可對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行重新分析尋找非編碼區(qū)域的調(diào)節(jié)區(qū)域是否有變異。另外，GS分析產(chǎn)生的數(shù)據(jù)龐大，數(shù)據(jù)分析費(fèi)時(shí)，結(jié)果差異大，目前廣泛應(yīng)用于臨床尚不成熟。

1.2NGS的操作流程

包括3個(gè)主要步驟：樣品制備、測(cè)序和數(shù)據(jù)分析。樣品制備包括患者樣本的采集處理、DNA提取、文庫(kù)構(gòu)建、生物分子標(biāo)簽（barcode）、目的區(qū)域/基因捕獲富集、連接和擴(kuò)增等；測(cè)序步驟即把制備好的標(biāo)本上機(jī)測(cè)序；數(shù)據(jù)分析即對(duì)測(cè)序完成后所產(chǎn)生的序列數(shù)據(jù)通過(guò)專門檢測(cè)DNA變異的計(jì)算機(jī)流水線進(jìn)行分析處理，這種數(shù)據(jù)分析的主要流程包括堿基識(shí)別、讀取對(duì)齊、變異識(shí)別和變異注釋。

2　開展測(cè)序工作應(yīng)考慮的因素

實(shí)驗(yàn)室開發(fā)NGS檢測(cè)分析的影響因素主要有：測(cè)序內(nèi)容、測(cè)序平臺(tái)和方法的選擇、數(shù)據(jù)分析工具的選擇、變異體過(guò)濾、同源區(qū)域測(cè)序及變異文件格式等，這些是開展測(cè)序工作前必須考慮的重要因素。

2.1測(cè)序內(nèi)容

在進(jìn)行NGS時(shí)，選擇與疾病高度相關(guān)的靶向基因組套來(lái)開展，即這些組套已經(jīng)有充足的科學(xué)證據(jù)證明其與該疾病的相關(guān)性。如果某靶向組套包含多重表型的基因，那么實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該向臨床醫(yī)生提供亞組套檢測(cè)來(lái)達(dá)到進(jìn)一步的針對(duì)性和減少實(shí)驗(yàn)分析的工作量。一般來(lái)說(shuō)，分析的區(qū)域越大，所得的與臨床表型相關(guān)的變異體數(shù)量也越多，數(shù)據(jù)分析的工作量也越大。

2.2測(cè)序平臺(tái)和方法的選擇

選擇測(cè)序平臺(tái)時(shí)，實(shí)驗(yàn)室須仔細(xì)考慮測(cè)序區(qū)域的大小、需要的覆蓋范圍、預(yù)計(jì)的樣本量、運(yùn)行時(shí)間要求以及成本等來(lái)決定購(gòu)買儀器的標(biāo)準(zhǔn)；也要根據(jù)要檢測(cè)的變異體數(shù)量和規(guī)模來(lái)選擇檢測(cè)平臺(tái)；測(cè)序模式有單向測(cè)序和雙向測(cè)序，雙向測(cè)序能使讀長(zhǎng)更明晰，尤其對(duì)重復(fù)區(qū)域堿基數(shù)據(jù)的讀取十分必要。

2.3數(shù)據(jù)分析工具

每個(gè)NGS檢測(cè)平臺(tái)均安裝特定的堿基識(shí)別運(yùn)算公式軟件，一般用Phred樣評(píng)分評(píng)估堿基識(shí)別的正確性。對(duì)于疾病靶向檢測(cè)和ES，建議以參考基因組進(jìn)行全長(zhǎng)校準(zhǔn)，以減少檢測(cè)組套以外的錯(cuò)誤測(cè)序信息產(chǎn)生，同時(shí)增加測(cè)序覆蓋度來(lái)提高變異體識(shí)別的準(zhǔn)確度；對(duì)于GS，序列比對(duì)后再進(jìn)行局部比對(duì)有助于發(fā)現(xiàn)插入或缺失突變信息。

2.4變異體過(guò)濾

實(shí)驗(yàn)室要設(shè)定變異體篩查方法，排除常見的良性變異，識(shí)別罕見疾病的分子。對(duì)于疾病靶向組套的NGS，實(shí)驗(yàn)室需要建立自動(dòng)分類工具，從罕見高外顯率變異體中過(guò)濾掉常見的良性變異?？捎脜⒖际褂玫臄?shù)據(jù)庫(kù)工具包括dbSNP、NHLBI外顯子組測(cè)序項(xiàng)目和1000基因組項(xiàng)目的自動(dòng)分類。而在ES或GS分析中，為識(shí)別罕見疾病的分子可采用適當(dāng)?shù)募彝コ蓡T作參照。同時(shí)實(shí)驗(yàn)室必須把握好過(guò)度排除與過(guò)低排除的度，過(guò)度排除導(dǎo)致無(wú)意中排除掉致病突變，過(guò)低排除導(dǎo)致需分析過(guò)多的突變體，增加工作量。實(shí)驗(yàn)室可循序漸進(jìn)，首先確定明確和明顯的病因，必要時(shí)可以重設(shè)篩選標(biāo)準(zhǔn)，擴(kuò)大搜索突變基因的范圍。

2.5同源區(qū)域測(cè)序

同源序列如假基因?qū)Χ套x測(cè)序法有干擾。當(dāng)讀取的序列被不正確地與同源區(qū)域?qū)R時(shí)，NGS序列讀取的有限長(zhǎng)度可能會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性變異應(yīng)答；但當(dāng)含突變的讀取與同源位點(diǎn)對(duì)齊時(shí)也可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果。因此，需找到在已知同源區(qū)域內(nèi)能檢測(cè)致病變異的方法，如用整體定位后再進(jìn)行局部定位或配對(duì)末端測(cè)序的方法。實(shí)際上，在某些情況下可用Sanger測(cè)序法及其特異的互補(bǔ)引物配對(duì)來(lái)確認(rèn)變異體所在區(qū)域。因此，實(shí)驗(yàn)室必須具備豐富的NGS技術(shù)相關(guān)經(jīng)驗(yàn)，充分意識(shí)到所用技術(shù)的局限性，必要時(shí)使用同類技術(shù)對(duì)所有疾病靶向或診斷性檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行確認(rèn)。Sanger測(cè)序法是最常使用的確認(rèn)性檢測(cè)方法。

2.6文件格式

NGS檢測(cè)產(chǎn)物應(yīng)遵守常用的格式（如.bam文件代表信號(hào)對(duì)合，.fastq文件記錄序列信息與堿基質(zhì)量），所采用的數(shù)據(jù)格式要易于轉(zhuǎn)換到標(biāo)準(zhǔn)格式。目前標(biāo)準(zhǔn)格式?變異檢出格式（.vcf）已被1000基因組項(xiàng)目使用。

3　NGS的運(yùn)行校驗(yàn)

NGS檢測(cè)的設(shè)備和試劑應(yīng)有合法的產(chǎn)品注冊(cè)證，其相關(guān)商品化產(chǎn)品需經(jīng)臨床實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證后才能成為診斷工具，其它未獲批準(zhǔn)的應(yīng)注明“僅用于探索性”、“僅用于研究”或“專一性分析試劑”；被視為實(shí)驗(yàn)室自行開發(fā)的項(xiàng)目，需要進(jìn)行一系列完整的批準(zhǔn)程序。

3.1測(cè)試驗(yàn)證和優(yōu)化

驗(yàn)證的內(nèi)容包括樣品制備、測(cè)序平臺(tái)和數(shù)據(jù)分析方法等。測(cè)試流程選定后，應(yīng)進(jìn)行反復(fù)操作直到所有的測(cè)定條件以及分析設(shè)置達(dá)到最優(yōu)化為止；實(shí)驗(yàn)室應(yīng)通過(guò)分析各種已知序列的變異體數(shù)據(jù)（例如：SNPs、小的插入/缺失、大的拷貝數(shù)變異和結(jié)構(gòu)變異）建立變異體識(shí)別操作規(guī)程。值得說(shuō)明的是，使用合成的突變體有助于創(chuàng)建大批量試驗(yàn)數(shù)據(jù)，可用于不同測(cè)序平臺(tái)的比較和優(yōu)化、設(shè)置各平臺(tái)閾值，因此，各實(shí)驗(yàn)室要建立測(cè)試的標(biāo)準(zhǔn)操作文件并嚴(yán)格執(zhí)行。另外，優(yōu)化過(guò)程應(yīng)包含臨床上所有的樣本類型（例如：全血、唾液、福爾馬林固定的石蠟包埋組織）。

實(shí)驗(yàn)室應(yīng)利用Sanger數(shù)據(jù)庫(kù)中存在的具有特征性的參考樣品來(lái)確定NGS的有效性，這些樣品不需包含特異的病理性突變，最好是可再生資源，用于設(shè)立基線數(shù)據(jù)，作為后續(xù)測(cè)試校準(zhǔn)的參照。對(duì)于疾病靶向基因檢測(cè)組套的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證應(yīng)包括基因與疾病的特異相關(guān)性，及廣譜的致病性突變基因。此外，還應(yīng)留意高度同源區(qū)域測(cè)序是否準(zhǔn)確。對(duì)于ES和GS，驗(yàn)證的重點(diǎn)在于高質(zhì)量的外顯子/基因組等指標(biāo)上，比如外顯子/基因組應(yīng)達(dá)到平均覆蓋率或所含堿基的百分比應(yīng)達(dá)到最小覆蓋閾值。實(shí)驗(yàn)室的任何變動(dòng)，需使用先前的實(shí)驗(yàn)樣本或特征性的參照樣本，進(jìn)行從頭到尾的測(cè)試驗(yàn)證。

3.2性能參數(shù)的驗(yàn)證

需要驗(yàn)證的性能包括分析的靈敏度、特異性、重復(fù)性和重現(xiàn)性。參數(shù)可以從技術(shù)層面開始制定，必須能反映整個(gè)測(cè)試的操作過(guò)程。

4　NGS分析的質(zhì)量控制

實(shí)驗(yàn)室必須制定質(zhì)量控制（quality control，QC）措施并用于監(jiān)測(cè)每個(gè)檢測(cè)，包括分析前、分析中及分析后的質(zhì)量監(jiān)測(cè)。監(jiān)測(cè)內(nèi)容包括樣本質(zhì)量、檢測(cè)參數(shù)、人員資質(zhì)、數(shù)據(jù)存儲(chǔ)、參考材料、能力驗(yàn)證。

4.1樣本質(zhì)量要求

運(yùn)行NGS的DNA可從多種樣本中提取。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)規(guī)定樣本類型、最小樣本量等。不同樣本類型的DNA質(zhì)量和突變檢測(cè)需求并不一樣，實(shí)驗(yàn)室需確定各種樣本類型的可接受指標(biāo)（例如樣本體積、組織量），制定實(shí)驗(yàn)室操作手冊(cè)與DNA提取和定量分析的質(zhì)量管理方案，并在患者報(bào)告中注明這些參數(shù)。對(duì)于不符合要求的樣品需重新采樣，若無(wú)法重新采樣，在實(shí)驗(yàn)室精通全基因組擴(kuò)增技術(shù)的前提下可行全基因組擴(kuò)增，在報(bào)告單上備注可能存在的固有偏差以便臨床醫(yī)生和患者能悉知該技術(shù)的局限性。在任何情況下，實(shí)驗(yàn)室都應(yīng)把操作時(shí)間、方法學(xué)選擇等內(nèi)容錄入實(shí)驗(yàn)室操作手冊(cè)中。

4.2檢測(cè)參數(shù)要求

實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立QC監(jiān)測(cè)點(diǎn)來(lái)進(jìn)行質(zhì)量保證監(jiān)控。QC監(jiān)測(cè)的內(nèi)容包括：DNA質(zhì)量、測(cè)序過(guò)程中錯(cuò)誤率的監(jiān)測(cè)、運(yùn)行后/分析前數(shù)據(jù)質(zhì)量的評(píng)估；QC操作記錄還應(yīng)包括使用的儀器和試劑批號(hào)。在驗(yàn)證過(guò)程中，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)記錄偏離標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程的偏差及糾正措施；還必須記錄NGS數(shù)據(jù)分析中的生物信息學(xué)操作流程，記錄分析操作流程中的特殊性數(shù)據(jù)的情況；完善分析系統(tǒng)，以便實(shí)驗(yàn)室追蹤軟件的版本及每個(gè)具體版本的特異性變化。

4.3人員資質(zhì)要求

從事NGS的技術(shù)人員應(yīng)該經(jīng)過(guò)專門的崗前培訓(xùn)并獲得資質(zhì)，在變異序列評(píng)估方面有豐富經(jīng)驗(yàn)；通曉疾病的發(fā)病機(jī)制及NGS技術(shù)性能。若實(shí)驗(yàn)室提供ES和GS服務(wù)，應(yīng)配備精通基因與突變及疾病表型之間關(guān)系的專家。

4.4數(shù)據(jù)存儲(chǔ)

NGS數(shù)據(jù)存儲(chǔ)方法應(yīng)遵循法規(guī)的要求，從而保證患者數(shù)據(jù)的可溯源性。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)在規(guī)程中明確標(biāo)明文件類型和確定每種類型的保存時(shí)間，建議實(shí)驗(yàn)室每種文件類型至少保存2年以上，以便可以追溯初始實(shí)驗(yàn)結(jié)果、分析流程改進(jìn)后重新分析的數(shù)據(jù)。此外，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)考慮記錄保留.vcf文件及相關(guān)變異亞型的最終臨床報(bào)告及解釋，條件允許時(shí)，可重新解釋突變基因與疾病相關(guān)的可能意義。

4.5參考材料

實(shí)驗(yàn)室應(yīng)使用具有廣泛特征性的參考材料（reference materials，RMs）作為測(cè)序和拷貝數(shù)變異檢測(cè)的參照。Coriell提供的人類細(xì)胞系具有高度特異的基因組區(qū)域和非共有區(qū)域，這些材料已用于GS實(shí)驗(yàn)，但要注意隨著時(shí)間推移基因組穩(wěn)定性降低的情況；此外，還有其他一些組織如美國(guó)病理家學(xué)會(huì)（College of American Pathologists，CAP），美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局用于評(píng)估儀器和測(cè)試性能的RMs。實(shí)際上，從全血中提取的基因組DNA是穩(wěn)定的，可通過(guò)全基因組擴(kuò)增技術(shù)，從少部分樣本中獲得大量可長(zhǎng)期使用的DNA。通過(guò)計(jì)算方法獲得模擬電子序列作為RM，可以和QC或能力驗(yàn)證的過(guò)程整合。這類模擬序列用于解決某一個(gè)特定區(qū)域的問題，如重復(fù)序列、已知的插入和缺失及SNPs。

4.6能力驗(yàn)證

根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室改進(jìn)修訂（Clinical Labo?ratory Improvement Amendments，CLIA）的要求，必須建立能力驗(yàn)證（proficiency testing）操作程序并且定期進(jìn)行能力驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)室須采用當(dāng)前公認(rèn)的能力驗(yàn)證方法來(lái)進(jìn)行，若沒有其他實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行平行的NGS測(cè)試，則需要實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部自定的能力驗(yàn)證方法來(lái)驗(yàn)證。

5　測(cè)序申請(qǐng)單、報(bào)告格式和結(jié)果解釋

5.1測(cè)序申請(qǐng)單

基因檢測(cè)項(xiàng)目的申請(qǐng)要求開單醫(yī)生提供患者的詳細(xì)臨床資料，如患者的臨床特征、家族史及體格檢查等來(lái)申請(qǐng)遺傳學(xué)檢測(cè)，以便實(shí)驗(yàn)室判斷檢測(cè)出的基因變異與患者一系列臨床癥狀、體征是否相符，以及對(duì)患者預(yù)后進(jìn)行評(píng)估。實(shí)驗(yàn)室則根據(jù)醫(yī)生的要求進(jìn)行基因測(cè)試和報(bào)告所檢測(cè)的基因中潛在的致病變異，并說(shuō)明檢測(cè)方法和每個(gè)檢測(cè)的操作參數(shù)。

5.2報(bào)告格式

實(shí)驗(yàn)室主任確定報(bào)告的細(xì)節(jié)，報(bào)告必須清晰、簡(jiǎn)明地闡明任何相關(guān)結(jié)果及其臨床意義，以便醫(yī)生對(duì)檢測(cè)結(jié)果的理解，并對(duì)所使用方法的優(yōu)點(diǎn)和局限性進(jìn)行描述。

所有NGS報(bào)告必須包括已鑒定的突變列表，以人類基因組變異協(xié)會(huì)命名指南進(jìn)行注釋，并根據(jù)ACMG指南進(jìn)行臨床分類（該指南定期更新，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)關(guān)注該指南的變更情況）；另外，基因命名應(yīng)遵循人類基因組組織基因命名的命名法進(jìn)行。報(bào)告中需要詳細(xì)列出每個(gè)變異位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)錄物的外顯子編號(hào)、任意突變、方法學(xué)、引用的互聯(lián)網(wǎng)站。建議實(shí)驗(yàn)室以結(jié)構(gòu)形式來(lái)報(bào)告突變體數(shù)據(jù)，報(bào)告中還應(yīng)提供靶向區(qū)域、外顯子組或基因組有效區(qū)域水平的技術(shù)參數(shù)與分析檢測(cè)中的局限性；對(duì)于伴隨發(fā)現(xiàn)結(jié)果的報(bào)告，在符合公認(rèn)的醫(yī)學(xué)實(shí)踐和道德倫理的基礎(chǔ)上，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)制定相關(guān)的方案來(lái)決定某些類型的伴隨發(fā)現(xiàn)是否應(yīng)該報(bào)告、什么時(shí)候報(bào)告。

5.3結(jié)果解釋

根據(jù)ACMG指南，在疾病靶向基因檢測(cè)組套報(bào)告中每一種突變鑒定都需進(jìn)行評(píng)估并歸類，應(yīng)包括與疾病相關(guān)突變基因功能和基因產(chǎn)物可能性的循證評(píng)估。ES和GS測(cè)試中得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，除了鑒定變異是否會(huì)改變基因或蛋白質(zhì)功能外，還應(yīng)評(píng)估已知的基因斷裂表型與患者臨床表型是否相關(guān)；如果檢測(cè)到具有潛在臨床意義的多聯(lián)突變體，在解釋中應(yīng)討論每個(gè)突變體與患者的表型可能存在的相關(guān)性，并排列突變的優(yōu)先次序；ES和GS測(cè)試的報(bào)告中，對(duì)無(wú)任何疾病關(guān)聯(lián)的基因變異，即與診斷無(wú)關(guān)、意義未明的變異（variants of un?certain significance，VUSs），實(shí)驗(yàn)室應(yīng)制定關(guān)于如何報(bào)告VUSs的規(guī)程，并且如實(shí)客觀地報(bào)告檢測(cè)中的首次發(fā)現(xiàn)，直至找到基因與疾病有關(guān)聯(lián)的證據(jù)，也鼓勵(lì)實(shí)驗(yàn)室存儲(chǔ)臨床測(cè)序數(shù)據(jù)到公共數(shù)據(jù)庫(kù)中。

實(shí)驗(yàn)室應(yīng)就遺傳學(xué)檢測(cè)結(jié)果數(shù)據(jù)再分析，及再分析是否另外收費(fèi)等相關(guān)問題制定明確的政策。建議實(shí)驗(yàn)室定期與臨床溝通，并告知VUSs的相關(guān)知識(shí)是否已經(jīng)更新。測(cè)序結(jié)果的解釋必須慎重，實(shí)驗(yàn)室必須與臨床保持充分溝通以避免產(chǎn)生不合理的解釋。

6　總結(jié)

探究遺傳異質(zhì)性疾病的病因是一項(xiàng)長(zhǎng)期艱苦的工作，NGS克服了傳統(tǒng)Sanger測(cè)序中無(wú)法大規(guī)模測(cè)序的缺點(diǎn)。然而，從與疾病相關(guān)的基因組套到整個(gè)基因組，NGS在產(chǎn)生高質(zhì)量序列數(shù)據(jù)的同時(shí)，還面臨著許多難題，包括處理大量信息的障礙，生物學(xué)上的解釋和數(shù)據(jù)的引用參考等等。未來(lái)關(guān)于該技術(shù)的具體臨床應(yīng)用還需要進(jìn)一步完善。

參考文獻(xiàn)

［1］Rehm HL，Bale SJ，Bayrak?Toydemir P，et al.Work?ing Group of the American College of Medical Genetics and Genomics Laboratory Quality Assurance Com?mitee.ACMG clinical laboratory standards for next?gen?eration sequencing［J］.Genet Med，2013，15（9）:733?747.

2.羅斯維爾帕克癌癥研究所腫瘤外科，美國(guó)，紐約，布法羅14263★通訊作者：黃華藝，E?mail:Huayi.Huang@Roswellpark.org

作者單位：1.廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣西，南寧530021

The standardization of the next generation sequencing technologies in clinical application：in reference to the ACMG clinical laboratory standards for next?generation sequencing

JIANG Liejun1，LU Xiaoxu1，HUANG Huayi1，2★
（1.Department of Laboratory Medicine，the People’s Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region，Nanning，Guangxi，China，530021；2.Department of Surgical Oncology，Roswell Park Cancer Institute，Elm &Carlton Streets，Buffalo，New York，USA，14263）

［ABSTRACT］Next?generation sequencing(NGS)technologies have been utilized in clinical laboratories. The advancement of technologies and expansion of the test scales and applications led to significant reductions in the cost of NGS test.The NGS technologies are still advancing in clinical laboratories,such as disease targeted gene panel,exome,and the whole genome sequencing.NGS technologies are also enhancing further advances in therapeutic decision making and disease prediction for populations who are at high risk of a potential disease.Nevertheless,the advancement of NGS is full of challenges in clinical applications including the fast update of platform and technologies leading to confusion in platform selection,the difficulties in clinical verification of sequencing data,etc.In order to help clinical laboratories with the validation of NGS methods and platforms,the ongoing monitoring of NGS testing to ensure quality results,and the interpretation and reporting of variants obtained using these technologies,this paper briefly summarized and discussed the standard and guidelines of NGS technologies in clinical applications in reference to the American College of Medical Genetics and Genomics to serve as a reference guidelines in establishing a local standard and guidelines for clinical laboratories in China.

［KEY WORDS］American College of Medical Genetics and Genomics；Next?generation sequencing；Disease?targeted gene panels;Exome sequencing；Genome sequencing