張莉　閻明　　江堤　　孫賢久　左海軍　劉美紅

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酒精對肝臟蛋白酶體成熟的影響

張莉1閻明2★江堤1孫賢久1左海軍1劉美紅1

[摘要]目的建立大鼠酒精性肝病模型，分析蛋白酶體成熟蛋白（proteasome maturation protein, POMP）的表達(dá)量，探討酒精對肝臟蛋白酶體成熟的影響。方法利用灌胃的方法建立大鼠酒精性肝病模型，分批于6、8、10、12周處死大鼠。采用熒光定量PCR方法測定POMP mRNA表達(dá)量。結(jié)果熒光定量PCR顯示蛋白酶體成熟蛋白POMP基因表達(dá)水平隨攝酒增多呈逐漸升高趨勢（P<0.05）。結(jié)論酒精攝入可影響蛋白酶體成熟，酒精導(dǎo)致的蛋白酶體成熟機(jī)制異?？赡茉诘鞍酌阁w功能下降機(jī)制中起重要作用。

[關(guān)鍵詞]大鼠；酒精性肝??；蛋白酶體；蛋白酶體成熟蛋白；蛋白質(zhì)氧化損傷

酒精性肝病發(fā)病率逐年升高，已成為我國僅次于病毒性肝炎的第二大肝病病因[1]。長期酒精攝入可導(dǎo)致氧化應(yīng)激，造成蛋白質(zhì)氧化損傷。蛋白酶體可降解細(xì)胞中絕大部分的氧化蛋白，是機(jī)體重要的抗氧化保護(hù)機(jī)制[2]，當(dāng)其功能受損時可導(dǎo)致氧化蛋白的蓄積，是肝細(xì)胞損傷的重要原因[3]。長期酒精攝入所導(dǎo)致的肝細(xì)胞損傷是否由于蛋白酶體成熟障礙引起其功能降低致氧化蛋白不能被有效清除尚不清楚，本文通過測定肝臟蛋白酶體成熟蛋白POMP的表達(dá)量，探討酒精對肝臟蛋白酶體成熟的影響。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物

成年健康雄性Wistar大鼠40只（4周齡），體重180~200 g，購自山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心。

1.1.2試劑

Trizol提取液（Invitrogen，美國），SYBR Pre?mix TaqTM（大連寶生物工程有限公司），M?MLV逆轉(zhuǎn)錄酶（Promega，美國），引物（上海英駿生物技術(shù)有限公司）。

1.2方法

1.2.1模型的建立

正常喂養(yǎng)1周后將大鼠隨機(jī)分為5組：對照組、模型組（共4組），各8只。模型組通過酒精灌胃方法建立動物模型：40%酒精5 g/kg至第4周末，隨后50%酒精7 g/kg至第8周末，60%酒精10 g/kg至第12周末，每日量分2次給予。對照組給予相同體積生理鹽水。大鼠分別于造模6、8、10、12周時處死[4]。

1.2.2實(shí)時熒光定量PCR檢測POMP基因含量

按Trizol說明書進(jìn)行肝組織RNA提取，紫外分光光度法定量后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系（總RNA 1 μL、M?MLV逆轉(zhuǎn)錄酶1 μL、逆轉(zhuǎn)錄緩沖液7 μL、隨機(jī)引物2 μL，加去RNase水補(bǔ)至20 μL），擴(kuò)增參數(shù)：37℃逆轉(zhuǎn)錄1 h，95℃滅活10 min。PCR反應(yīng)體系（SYBR熒光染料10 μL，上下游引物各0.6 μL，cDNA 1 μL，雙蒸水7.8 μL)。POMP上游引物序列為5′?CCCCTGAAGTTA?CAGGTGGA?3′,下游引物序列為5′?AGCGTAG CTCACCCATCAGT?3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為169 bp；內(nèi)參β?actin上游引物序列為5′?CGTTGACATCCG?TAAAGACC?3′,下游引物序列為5′?TAGAGC?CACCAATCCACACA?3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為176 bp。所有引物均采用Primer5.0設(shè)計(jì)并經(jīng)過NCBI Blast驗(yàn)證產(chǎn)物特異性。擴(kuò)增完成后根據(jù)Ct值計(jì)算相對表達(dá)量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)處理采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件，各組樣本均數(shù)的比較采用One?Way ANOVA方差分析。

2　結(jié)果

2.1肝組織病理學(xué)表現(xiàn)

灌酒6周時肝細(xì)胞排列尚整齊，部分肝細(xì)胞內(nèi)可見少量脂肪變性，肝小葉中央?yún)^(qū)域明顯；8周時肝細(xì)胞內(nèi)脂滴明顯增多，細(xì)胞核被推擠至細(xì)胞一側(cè)；10周時肝細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞腫脹，胞質(zhì)疏松，含有大量脂滴；12周時肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，肝細(xì)胞脂肪變進(jìn)一步加重，可見明顯腫脹及炎細(xì)胞浸潤（圖1）。

2.2血清生物化學(xué)指標(biāo)檢測

由表1可見，灌酒6、8、10、12周大鼠血清甘油三酯（triglyceride,TG）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase,ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate amino transferase,AST）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）等指標(biāo)均高于對照組，并呈逐漸增高趨勢，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1　血清生化指標(biāo)含量測定 （mmol/L）Table 1　The serum biochemical criterion（mmol/L）

2.3肝組織POMP基因熒光定量PCR熔解曲線分析

由表2結(jié)果可知，隨攝酒時間延長，模型各組肝組織POMP mRNA相對表達(dá)量（0.42±0.40、0.63± 0.44、3.48±2.50、4.22±3.31），模型組大鼠肝組織中POMP基因表達(dá)量逐漸升高，模型3組及4組與正常對照組相比有明顯差異（P<0.05）。

3　討論

酒精在肝臟內(nèi)的氧化代謝可產(chǎn)生大量的自由基，作用于氨基酸鏈，造成蛋白質(zhì)氧化損傷、功能喪失，造成細(xì)胞損傷[5]。受損的氧化蛋白不能被修復(fù)，只能通過蛋白酶體系統(tǒng)降解，如未能被降解，則互相交聯(lián)成為大分子，失去其原有功能，最終導(dǎo)致酒精性肝病[6]。

蛋白酶體介導(dǎo)的氧化蛋白降解是肝細(xì)胞對抗氧化應(yīng)激的重要機(jī)制，蛋白酶體系統(tǒng)可特異性的對病理蛋白進(jìn)行降解，維持細(xì)胞的正常功能[7]。有研究表明蛋白酶體（proteasomes，PS）可高效、高選擇性降解體內(nèi)絕大部分的氧化蛋白[9]，如該系統(tǒng)功能下降，則直接導(dǎo)致氧化蛋白累積并形成聚合體，使得細(xì)胞無法正常工作，誘導(dǎo)細(xì)胞壞死[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示灌酒6周時開始出現(xiàn)肝細(xì)胞形態(tài)改變及生化指標(biāo)損害，至12周時病變明顯。本實(shí)驗(yàn)的前期研究也表明隨攝酒增多，大鼠肝細(xì)胞氧化蛋白含量明顯升高，蛋白酶體活性亞基表達(dá)下降，表明酒精可造成蛋白酶體活性降低從而引起細(xì)胞氧化損傷，氧化蛋白蓄積，破壞細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，造成細(xì)胞損傷。

表2　各組大鼠蛋白酶體POMP基因表達(dá)情況（x±s）Table 2　Expression of POMP mRNA in different groups(x±s)

POMP在蛋白酶體的組裝過程中發(fā)揮重要作用，其只在前體中被檢測到，裝配完成后即降解掉。蛋白酶體前體包括α環(huán)、β環(huán)及POMP，裝配過程中POMP的存在使得β亞基活化位點(diǎn)被激活，從而無活性的前體被催化成活性中心顆粒[11]。有研究表明，向細(xì)胞內(nèi)加入蛋白酶體抑制劑MG132后可測得大量的POMP、未加工的前體成分，同時蛋白酶體活性下降。在敲除POMP基因的細(xì)胞內(nèi)也可觀察到α環(huán)、β環(huán)正常，但成熟的蛋白酶體明顯減少，表明POMP在蛋白酶體成熟過程中的重要作用［12］。本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)隨著酒精攝入時間的延長及攝入量的增加，蛋白酶體成熟蛋白POMP逐漸增多，蛋白酶體成熟障礙、功能下降從而使得肝細(xì)胞蛋白質(zhì)氧化損傷導(dǎo)致的氧化蛋白降解受損，造成氧化蛋白蓄積，即蛋白酶體活性的下降與POMP的表達(dá)密切相關(guān)。

綜上分析，酒精攝入可影響蛋白酶體成熟，使得蛋白酶體功能下降，造成氧化蛋白蓄積，導(dǎo)致細(xì)胞損傷。酒精導(dǎo)致的蛋白酶體成熟機(jī)制異常在蛋白酶體功能下降中起重要作用。對其機(jī)制的進(jìn)一步研究將有助于尋找改善蛋白酶體功能的新的途徑。

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2.山東大學(xué)齊魯醫(yī)院消化內(nèi)科，山東，濟(jì)南250012★通訊作者：閻明，E?mail：yanming011@126.com

基金項(xiàng)目：山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科研重點(diǎn)項(xiàng)目（2007Hz056）

作者單位：1.東莞東華醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東，東莞523000

Effect of alcohol on proteasome assembly in hepatic tissue

ZHANG Li1,YAN Ming2★,JIANG Di1,SUN Xianjiu1,ZUO Haijun1,LIU Meihong1
(1.Department of Gastroenterology,Donghua Hospital,Dongguan,Guangdong,China,523000;2.Department of Gastroenterology,Qilu Hospital,Shandong University,Jinan,Shandong,China,250012)

［ABSTRACT］ObjectiveTo evaluate the expression of proteasome maturation protein(POMP)in the rat models of alcoholic liver,and investigate the effect of alcohol on proteasome assembly.Methods Establish the rat models of alcoholic liver disease by gastric perfusion method,and kill the rats after 6,8,10,12 weeks.The expressions of mRNA for POMP were detected by fluorogenic quantitative polymerase chain reaction.ResultsThe expressions of mRNA for POMP increased gradually along with the increase of alcohol administration.ConclusionAlcohol administration resulted in the assembly of proteasome.Ethanol induced proteasome malfunction might be responsible for the obstacles of proteasome mature mechanism.

［KEY WORDS］Rat;Alcoholic liver disease;Proteasome;Proteasome maturation protein;Protein oxidative damage