鄒慧琴　劉亞蘭　　余夢杰　王海鵬　　王毓　　謝寶剛　張守華

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游離金雀異黃素和大豆苷元大鼠尿液排泄動力學研究

鄒慧琴1劉亞蘭1余夢杰1王海鵬1王毓1謝寶剛1張守華2★

［摘要］目的建立大鼠尿液中游離金雀異黃素（genistein，GT）和大豆苷元（daidzein，DD）同時定量的分析方法，獲得其口服后大鼠尿液排泄動力學參數(shù)，為大豆異黃酮生物利用度研究和評價提供新的方法。方法大鼠單次灌胃給予GT和DD混懸液（15.0 mg/kg），在給藥后不同時間段收集尿液，尿液經(jīng)冷凍干燥后，加1.0 mL甲醇溶解提取目標化合物。采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）法測定游離GT和大DD的濃度，采用Krommasil C18色譜柱，以甲醇?水（52∶48）為流動相，流速1.0 mL/min柱溫為30℃，檢測波長254 nm。結果建立的高效液相色譜法?紫外法（HPLC?UV）方法專屬性強，在0.5~10.0 μg/mL濃度范圍內具有良好的線性關系，良好的精密度及較高的準確度。尿液排泄動力學曲線圖上第4.5 h和13.5 h別顯示小腸和肝腸循環(huán)2個吸收峰，游離GT和DD清除半衰期分別為（7.5±0.59）h和（8.5±1.2）h，72 h尿液累積量分別為（45.2±7.2）μg和（56.1±12.2）μg。結論所建立的方法可靠，簡便快速，可用于比較和評價大豆異黃酮類制劑的口服吸收生物利用度和代謝動力學研究。

［關鍵詞］游離金雀異黃素和大豆苷元；高效液相色譜；尿液排泄動力學；生物利用度

大豆異黃酮是一種重要的植物雌激素，它能通過與雌激素受體（estrogen receptor，ER）競爭性地結合從而干擾雌激素功能，發(fā)揮其生物學作用［1-2］。金雀異黃素（genistein，GT）和大豆苷元（daidzein，DD）是大豆異黃酮的主要活性成分，具有輕度雌激素樣作用，無明顯副作用，是一種安全的天然植物雌激素。近年來，許多研究表明，這2種化合物具有抗氧化、抗癌、預防骨質疏松癥、預防心血管疾病、改善婦女更年期障礙、抗衰老等諸多生理功能［3?6］。歐洲一個大型流行病學調查發(fā)現(xiàn)，在男性血液中，擁有更高濃度GT的人患前列腺癌的幾率更小［7］。目前國外各種大豆異黃酮的醫(yī)藥制品和保健食品正在積極開發(fā)，并已有相關品種上市銷售。

在體內，GT和DD發(fā)揮其雌激素樣功能的物質基礎可能其游離形式［8?9］，然而，血液中GT和DD主要以他們的代謝物如葡萄糖醛酸及硫酸酯代謝物存在，其游離形式不足總量的5%［1，10］。因此，以血液為樣品的藥代動力學研究大多是測定血中總的GT和DD含量。迄今為止，國內外關于GT和（或）DD在大鼠或人體內藥代動力學研究較多，但關注體內游離GT和DD排泄動力學方面的研究很少。鑒于此，本文建立樣品預處理簡單、重復性好的對大鼠尿液中游離GT和DD進行同時定量的HPLC?UV分析方法，在此基礎上，獲得大鼠口服GT和DD后的尿液排泄動力學參數(shù)，為大豆異黃酮各種制劑口服吸收生物利用度研究和評價提供新的方法。

1　材料與方法

1.1儀器與試藥

高效液相色譜儀（島津10A?VP系統(tǒng)，配備雙波長紫外檢測器，日本島津公司）；冷凍干燥機（LGD?10D，北京四環(huán)科學儀器廠）；CQ?250型超聲波清洗儀（上海中船七院七二六所）；Sartorious BP211D型十萬分之一電子天平（德國沙多利斯公司）。GT和DD購自上海融禾生物科技發(fā)展有限公司（純度大于98%，GT和DD批號分別為：20140708和20140904）；另取大約5 g GT和DD 80℃真空干燥至恒重后作為對照品使用。色譜純甲醇（上海陸都有機化學試劑有限公司），水為自制三重蒸餾水。

1.2實驗動物

Sprague?Dawley（SD）大鼠由南昌大學實驗動物中心提供，合格證書：醫(yī)動字第021?9602號，不含大豆成分飼料喂養(yǎng)，實驗過程自由進食和水。

1.3HPLC色譜分析條件

采用Krommasil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm，迪馬科技有限公司）色譜柱。以甲醇?水（52：48，v/v）為流動相，等度洗脫。流速1.0 mL/min，柱溫為30℃，進樣20 μL，檢測波長254 nm。

1.4給藥方案

8只SD大鼠，體重(200±20)g，不銹鋼代謝籠單獨飼養(yǎng)，每天光照12 h，室溫（22~24℃），室內相對濕度30%~70%。適應喂養(yǎng)3 d后，第4天上隨機收集2只大鼠21：00~9：00夜間12 h尿液，作為空白尿樣。上述收集尿樣馬上于5 000 rpm離心10 min 于-20℃冷凍保存。分別稱取GT和DD約50.0 mg，用0.2%CMC?Na溶液配制濃度為3.0 mg/mL的混懸溶液，第5天大鼠灌胃給藥，第3 h、6 h、9 h、12 h、15 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h后分別收集其尿液，5 000 rpm離心，取上清置于-20℃冰箱備用。

1.5尿液樣品的處理

所收集的尿液樣品自然解凍后，間隔3 h樣品（大約2~4 mL）全部用來冷凍干燥；間隔12 h樣品由于量較大，準確測定體積后取4.0 mL進行冷凍干燥。凍干粉末每管加1.0 mL甲醇，漩渦振蕩、超聲約2 min，于10℃14 000 rpm離心10 min，取0.5 mL 于1.5 mL離心管中，再加0.5 mL蒸餾水，HPLC進樣20 μL測定游離GT和DD的含量。

1.6對照品溶液的配制

一定濃度的GT和DD對照品溶液用水稀釋使其終濃度為100.0 μg/mL和102.5 μg/mL的工作液。分別取5、10、20、40、80、100 μL到不同的EP管中，編號。各管分別加入3.0 mL空白尿液，凍干，按樣品處理方法同樣提取后分別進樣色譜分析，以目標色譜峰面積與標準品濃度作圖，得到尿樣工作曲線。

2　結果

2.1色譜條件的優(yōu)化和方法的專屬性

本實驗色譜分離條件的優(yōu)化主要考察流動相的組成和檢測波長2個因素對樣品分離效果的影響?？疾炝?個pH值（2.5，4.0，6.0）的10 mM乙酸銨溶液以及蒸餾水作為水相，甲醇或乙腈作為有機相的流動相對尿樣提取物中GT和DD分離。結果表明實驗的幾種流動相對2種化合物均能達到基線分離，且色譜峰型對稱?？紤]到實驗成本和流動相配制的方便，本實驗選用甲醇?水溶液為流動相。鑒于尿樣提取物樣品較為復雜，8 min前有一定的干擾，流動相定為52%的甲醇，此時2種化合物出峰時間在8.5 min和12.0 min左右。鑒于GT和DD的最大吸收波長分別為260 nm和248 nm，考慮到需同時在尿液中檢測GT和DD，故選擇檢測波長為254 nm定量，以獲得較高的檢測靈敏度。

分別取空白尿液、空白尿液加入GT和DD對照品，以及大鼠給予GT和DD后所收集尿液，按建立的尿樣處理方法和HPLC方法操作和進樣，所得的色譜圖見圖1。從圖上可看出，在建立的HPLC條件下及樣品提取處理條件下，樣品中的內源性成分及檢測物質代謝物等對目標成分的含量測定沒有干擾，說明該方法具有良好的專屬性。

2.2工作曲線的建立

按照上述尿液樣品處理方法，配制含有GT和DD系列濃度的尿液對照品溶液，分別進行HPLC分析。以GT和DD的峰面積對應其濃度進行線性回歸，得到對尿液樣品中GT和DD定量的工作曲線。GT和DD的回歸方程分別為：A=91 344C+9 168.2和A= 76 402C+16 879（其中A為峰面積，C為濃度），2種化合物在0.5~10.0μg/mL濃度范圍內的線性相關系數(shù)均大于0.99，表明他們的濃度和色譜峰面積信號具有良好的相關性，滿足定量的要求。根據(jù)色譜信號信噪比大于3∶1的最低濃度為檢測限，10∶1為定量限的方法計算。逐步稀釋標準品溶液，結果顯示GT和DD 2種化合物的檢測限分別為0.014 μg/mL和0.030 μg/mL，定量限分別為0.06μg/mL和0.07μg/mL。

2.3精密度

分別以空白尿液加終濃度為10.4 μg/mL的GT 和12.2 μg/mL的DD對照品溶液在同一天（及第2天）重復進樣5次，計算相關色譜峰的峰面積標準偏差表示日內（日間）精密度。GT精密度為日內2.12%，日間精密度為2.74%。DD日內精密度為1.88%，日間精密度為3.3%。

2.4穩(wěn)定性

從以上日間精密度實驗數(shù)據(jù)可以看出，2種化合物在24 h內濃度變化相對標準偏差（relative stan?dard deviation，R.S.D.）。小于5.0%，說明樣品比較穩(wěn)定。上述樣品4℃放置一個月后按同樣方法測定，以原來的標準溶液（4℃保存）建立新的工作曲線，計算其濃度分別為9.9 μg/mL和11.6 μg/mL，變化R.S.D.仍小于5.0%，表明實驗樣品具有良好的短和長期穩(wěn)定性。

2.5樣品提取回收率及方法加樣回收率

把含19.6 μg/mL的GT和20.4 μg/mL的DD對照品溶液尿液凍干粉用甲醇一次提取后，不溶物離心，沉淀再用0.5 mL甲醇溶解，溶解物進行HPLC分析，此時檢測不到目標化合物的存在，說明加入1.0 mL甲醇一次提取就可以基本完全提取目標化合物。

按上述建立的方法，分別測定已知GT和DD含量的樣品，得到色譜圖，以及該樣品加一定量對照品（1.0 μg/mL、3.0 μg/mL、6.0 μg/mL 3個濃度）的色譜圖，以工作曲線計算相應的濃度，得到加樣回收率的數(shù)據(jù)。GT和DD樣品加樣回收率分別分別（100.6±5.8）%（n=3）和（102.6±4.5）%（n=3）。

綜合以上實驗結果可知，應用HPLC?UV方法在尿樣中同時定量GT和DD專屬性強，在一定的濃度范圍內具有良好的線性關系，良好的精密度及較高的準確度。

2.6尿液游離GT和DD排泄動力學

圖2是單位時間藥物排泄量（Du/dt）對時間作圖，從該圖明顯可以看出，GT和DD在給藥后4.5 h、13.5 h 2個時間點出現(xiàn)一大一小2個吸收峰。異黃酮藥代動力學實驗表明在給藥后2 h及7 h左右，血液中出現(xiàn)2個吸收峰［10］，分別代表小腸和肝腸循環(huán)吸收。由于腎排泄的滯后性，因此在排泄動力學曲線圖上給藥后第4.5 h（3~6 h中點）、13.5 h（12~15 h中點）2個時間點出現(xiàn)2個峰，表明用尿液排泄動力學方法與血液藥代動力學方法具有很好的相關性。

本實驗以單位時間藥物排泄量（LogDu/dt）與時間作圖，對消除相線性回歸，求得直線斜率K，以T1/2＝0.693/K計算GT和大豆苷元在體內的消除半衰期，相應的尿液排泄動力學參數(shù)列于表1。尿液72小時累積游離GT和DD分別為（45.2±7.2）μg和（56.1±12.2）μg。

表1　口服金雀異黃素和大豆苷元尿樣排泄動力學參數(shù)（mean±S.E.，n=6?8）Table 1　The urinary pharmacokinetic parameters of genistein and daidzein after their oral administration（mean±S.E.，n=6?8）

3　討論

GT和DD體內外檢測方法文獻報道較多，經(jīng)過萃取、酸化等前處理過程，Uif?lean等［11］以0.1%乙酸和乙腈為流動性，利用HPLC?UV方法同時檢測了大豆保健品中GT、DD和大豆黃素，線性范圍為5.0~80 μg/mL。Magiera［12］以0.05%三氟醋酸和乙腈為流動相，利用超高效液相色譜UHPLC?UV技術同時在中草藥保健品中同時檢測了GT、DD及其他14種化合物。GT和DD檢測限為0.05 μg/ mL。本文利用冷凍干燥的方法先處理尿液樣品，然后直接用甲醇提取，這樣可以保證有效提取GT 和DD的基礎上消除尿液中蛋白的影響，樣品用水適當稀釋后直接進樣；另外HPLC?UV方分離GT 和DD等化合物，文獻大多采用較為復雜的流動相，流動相中如果含有三氟醋酸、三乙胺等化合物在HPLC過程中可能影響基線的穩(wěn)定、提高方法的檢測限。而對于生物樣品的分析來說，降低方法的檢測限是非常有必要的，本實驗結果表明，直接用水和乙腈體系就能很好的在尿液樣品中分離這2種代謝物，該方法對GT和DD 2種化合物的檢測限分別為0.014 μg/mL和0.030 μg/mL。當然，提高方法靈敏度的另外一種方法就是采用質譜檢測器，如經(jīng)酶解、固相萃取等前處理過程，利用HPLC?MS技術［13］，包括GT和DD在內的13種植物雌激素可以同時在人體血液和尿液中定量，尿中GT和DD檢測限小于1.0 ng/mL，具于MS的檢測技術需要貴重的儀器，樣品前處理復雜，分析成本高等缺點。經(jīng)方法學確證，本文建立的在尿樣中同時定量GT和DD的HPLC?UV方法，樣品前處理簡單、專屬性強、檢測限彽，在0.5~10.0 μg/mL濃度范圍內具有良好的線性關系，良好的精密度及較高的準確度，適應于含GT和DD制劑大鼠的排泄動力學研究。

人體口服大豆異黃酮后，血液中主要是GT和DD的葡萄糖醛酸及硫酸酯代謝物，其游離形式不足總量的5%［1，10］，含量極低，一般低于HPLC?UV方法的檢測限。因此，以血液為樣品的藥代動力學研究大部分得先酶解，然后測定血中總的GT和DD含量，獲得GT和DD的藥動學參數(shù)。然而，許多實驗結果［8，9，14］表明，GT和DD在體內發(fā)揮其雌激素樣功能的物質基礎是其游離形式，因此獲得游離GT和DD的藥動學參數(shù)可能更有利于不同制劑的評價。鑒于GT和DD為小分子化合物，且主要由腎臟排泄，其尿中的含量與體內血中的濃度具有一定的相關性［5］，因此本文建立了游離GT和DD在大鼠尿液中的HPLC?UV檢測方法，并獲得他們的排泄動力學參數(shù)。本文結果顯示，口服GT和DD尿液清除半衰期為8 h左右，大鼠單次給予GT和DD后尿樣中游離GT和DD的變化滿足單室一級排泄動力學模型，與文獻報道結果一致［10，14］。本實驗結果顯示單次口服給予大鼠GT 和DD混懸劑（15.0 mg/kg），其尿液72 h累積游離GT和DD分別為（45.2±7.2）μg和（56.1±12.2）μg。由于尿液累積排泄總量與血漿藥物濃度—時間曲線下面積（AUC）成正相關，因此可用尿液中累積異黃酮量評價不同的異黃酮制劑的生物利用度。

總之，異黃酮的口服吸收生物利用度與其預防和治療疾病的藥理作用作用密切相關，到目前為止，以尿液為樣品的游離GT和DD排泄動力學研究的報道很少。因此，本文建立了操作簡單、重復性好的對大鼠尿液中游離GT和DD進行同時定量的HPLC?UV分析方法，實驗結果表明該方法專屬性強，在一定的濃度范圍內具有良好的線性關系，良好的精密度及較高的準確度。本文研究結果顯示基于尿液排泄動力學的分析方法可用于比較和評價大豆異黃酮類制劑的口服吸收生物利用度；亦可用于大豆異黃酮在中國居民的體內代謝動力學研究，為進行慢性病治療、預防提供直接的理論數(shù)據(jù)。

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2.江西省兒童醫(yī)院普外科，江西，南昌330006★通訊作者：張守華，E?mail：zshouhua416@163.com

基金項目：國家自然科學基金資助項目（81560631）

作者單位：1.南昌大學藥學院，江西，南昌330006

Investigation of urinary pharmacokinetics of free genistein and daidzein in rats

ZOU Huiqin1，LIU Yalan1，YU Mengjie1，WANG Haipeng1，WANG Yu1，XIE Baogang1，ZHANG Shouhua2★
（1.School of Pharmaceutical Science，Nanchang University，Nanchang，Jiangxi，China，330006；2.Department of General Surgery，Jiangxi Children’s Hospital，Nanchang，Jiangxi，China，330006）

［ABSTRACT］ObjectiveTo offer an alternative approach to evaluate the bioavailability of isoflavone by urinary excretion,establishing an HPLC method for the determination of free genistein and daidzein in rat urine and obtaining the parameters of urinary pharmacokinetics after their oral administration.MethodThe rats were orally administered with a single dose of genistein and daidzein（15 mg/kg）.Urine samples were collected from different time periods.The samples were lyophilized and then extracted ultrasonically by 1.0 mL methanol.HPLC analysis was performed by a reversed?phase HPLC column(Kromasil 100A,C18).The elution conditions for HPLC were methanol and water at the ratio of 52%（v/v）for isocratic elution,the column was maintained at 40℃,flow rate was 1.0 mL/min,and detection was set to 254.0 nm.ResultsAn excellent liner relationship was obtained by developed HPLC?UV method in the range of 0.5~10.0 μg/mL with high specificity, good precision and high accuracy.A plot of urinary isoflavone concentration versus time suggests that there were two peaks at 4.5 h and 13.5 h related to absorption in intestine and enterohepatic circulation.The half?time in urine was found to be(7.5±0.59)h and(8.5±1.2)h for genistein and daidzein respectively.The cumulative excretions of genistein and daidzein for 72 h were(45.2±7.2)μg and(56.1±12.2)μg,respectively.ConclusionThe method is reliable,simple,rapid and suitable for comparison and evaluation of oral bioavailability of isoflavone pharmaceutics as well as pharmacokinetic study.

［KEY WORDS］Free geinistein and daidzein;High performance liquid chromatography(HPLC); Urinary pharmacokinetics;Oral bioavailability