潘智然，王騰華，朱首倫，任之堯，張靖，2

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基于超高壓液相色譜-高分辨多級質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的中藥淡竹葉化學(xué)成分分析

潘智然1，王騰華1，朱首倫1，任之堯1，張靖1，2

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510120；2.廣東省中醫(yī)藥科學(xué)院，廣東 廣州510006）

摘要：目的建立基于超高壓液相色譜-電噴霧-高分辨多級質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（UHPLC-ESI-HR MSn）的中藥淡竹葉醇提物的化學(xué)成分快速定性分析研究方法。方法液相采用Phenomenex kinetex C18色譜柱，乙腈-0.1%（體積分?jǐn)?shù)）甲酸系統(tǒng)梯度洗脫，質(zhì)譜采用電噴霧-離子阱-靜電場軌道阱組合質(zhì)譜技術(shù)，以負(fù)離子模式采集，線性離子阱內(nèi)碰撞誘導(dǎo)解離獲取多級質(zhì)譜數(shù)據(jù)，軌道阱內(nèi)測定高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)。將獲取的對照成分的質(zhì)譜裂解數(shù)據(jù)、液相和多維質(zhì)譜信息進(jìn)行分析總結(jié)并進(jìn)行在線結(jié)構(gòu)解析。結(jié)果 本法對淡竹葉醇提物中的主要成分峰分離良好，根據(jù)精確分子量和二級質(zhì)譜碎片信息，結(jié)合對照品質(zhì)譜裂解途徑，從淡竹葉中快速鑒定了21個化學(xué)成分。結(jié)論本方法具有高效、高靈敏度的檢測優(yōu)勢，能較全面地反映出淡竹葉醇提物的化學(xué)成分，可實(shí)現(xiàn)黃酮碳苷、黃酮及酚酸類等不同結(jié)構(gòu)類型化合物鑒別，為深入闡明中藥淡竹葉藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供高效可靠的檢測手段。

關(guān)鍵詞：淡竹葉；液質(zhì)聯(lián)用；黃酮碳苷；化學(xué)成分

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-05-24 15：28 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160524.1528.001.html

中藥淡竹葉為禾本科（Gramineae）淡竹葉屬植物淡竹葉（Lophatherum gracile Brongn.）的干燥莖葉，主產(chǎn)于湖南、廣東、安徽、浙江、福建等地，在1977年以來的歷版《中國藥典》中均有收載，為嶺南地區(qū)常用道地藥材［1-2］。淡竹葉味甘性寒，具清熱、除煩、利尿等功效，多用于熱病心煩、口舌生瘡、牙齦腫痛、尿路炎癥等癥，民間常用于治療呼吸道感染所引起的感冒、發(fā)熱等疾?。?］。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示，淡竹葉具解熱、利尿、抗菌、抗腫瘤、升高血糖等多種藥理作用［4-6］，為衛(wèi)生部公布的藥食兩用中藥之一，在大健康產(chǎn)品領(lǐng)域如醫(yī)藥、保健品、功能性飲料、食用品、天然防腐劑等多方面均有較廣泛的應(yīng)用前景。前期的化學(xué)成分研究顯示［7-8］，淡竹葉中含有黃酮、酚酸及三萜類等多種成分，其中黃酮碳苷類為其主要化學(xué)結(jié)構(gòu)類型。藥理試驗(yàn)表明，6位單糖取代的黃酮碳苷類成分具有顯著的體外抗呼吸道合胞病毒（RSV）活性［9］。

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（液質(zhì)聯(lián)用，LC-MS）具有樣品預(yù)處理簡單、分析速度快、靈敏度高及專屬性高等特點(diǎn)。近年來，隨著對中藥復(fù)雜體系分析要求的不斷提高及液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的不斷更新發(fā)展，LCMS在中醫(yī)藥多研究領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。由線性離子阱（linear ion trap quadrupole，LTQ）和靜電場軌道離子阱（orbitrap）結(jié)合而形成的組合式質(zhì)譜儀是近年來質(zhì)譜技術(shù)發(fā)展的杰出代表，具有卓越的分辨率、多種掃描和碎裂組合［10］，可同時實(shí)現(xiàn)母、子離子的高分辨采集及多級質(zhì)譜碎裂信息獲取，不僅可以鑒定已知化合物，還可以通過不同化合物的裂解規(guī)律及特征碎片離子來推斷未知化合物。該組合質(zhì)譜技術(shù)可為中藥小分子化學(xué)成分的鑒定及分析提供更多、更準(zhǔn)確的信息［11-12］，并能有效地指導(dǎo)中藥化學(xué)成分，尤其是微量未知成分的選擇性提取和分離試驗(yàn)。

本文采用超高壓液相色譜-電噴霧-高分辨多級質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（UHPLC-ESI-HR MSn）技術(shù)開展淡竹葉的化學(xué)成分的質(zhì)譜分析研究，建立快速、高效、準(zhǔn)確的質(zhì)譜分析方法，實(shí)現(xiàn)黃酮碳苷、黃酮及酚酸類等不同結(jié)構(gòu)類型化學(xué)成分的快速識別，為中藥淡竹葉藥材質(zhì)量研究、新藥研發(fā)提供有利的分析依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

液相采用Thermo Accela超高壓液相色譜儀（美國Thermo-fisher公司），由四元高壓泵、自動進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器組成。液相部分通過電噴霧離子源（ESI）與LTQ-Orbitrap XL線性離子阱軌道離子阱組合式質(zhì)譜儀連接（美國Thermo-fisher公司），數(shù)據(jù)采集及處理軟件為Xcalibur 2.1（美國Thermo-fisher公司）。

AB135-S型十萬分之一電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司），3K15高速冷凍離心機(jī)（德國sigma公司），AS 20500A超聲波清洗儀（頻率40 Hz，功率250 W，天津奧特賽恩斯儀器有限公司），步琪R-210型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士Buchi公司），DK-S26電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.2 試藥

淡竹葉藥材購自廣東省中醫(yī)院藥房，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院黃志海主任中藥師鑒定為禾本科淡竹葉屬植物淡竹葉 Lophatherum gracile Brongn.的干燥莖葉，樣品現(xiàn)保存于廣東省中醫(yī)院中藥制劑研究室樣品室。

對照品葒草苷、異葒草苷、牡荊素、異牡荊素為本實(shí)驗(yàn)室從淡竹葉醇提物中分離得到（質(zhì)量分?jǐn)?shù)均高于95%），其結(jié)構(gòu)經(jīng)MS、NMR、UV等波譜學(xué)確認(rèn)。

高效液相色譜級甲醇、乙腈（美國Sigma公司）；質(zhì)譜級甲酸（美國Thermo-fisher公司）；超純水由Milli-Q制水機(jī)（Millipore公司）制得。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品、供試品溶液的制備

分別稱取葒草苷、異葒草苷、牡荊素、異牡荊素對照品約0.10 mg，分別用70%（體積分?jǐn)?shù)，下同）甲醇溶解并定容于10 mL容量瓶中，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，制得上述4種對照品質(zhì)量濃度分別為10 μg/mL的各對照品溶液。

精密稱取淡竹葉粉末（過60目篩）2.0 g，置于250 mL圓底燒瓶中，用70%甲醇溶液50 mL加熱回流2 h，濾過，濃縮至干。用70%甲醇溶解轉(zhuǎn)移，并定容于25 mL容量瓶中，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液為供試品溶液。

2.2 色譜條件

色譜柱為Phenomenex Kinetex C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）色譜柱；流動相為0.1%（體積分?jǐn)?shù)，下同）甲酸（A）、乙腈（B）梯度洗脫：0～10 min（5%B→26%B），10～18 min（26%B→42%B），18～22 min （42%B→90%B）；柱溫：25℃；流速：300 μL/min；進(jìn)樣體積：2 μL。

2.3 質(zhì)譜條件

采用電噴霧離子源負(fù)離子模式，離子源參數(shù)設(shè)置如下：鞘氣（N2）=3.033 8×105Pa，輔助氣（N2）3.447 5×104Pa，噴霧電壓2.7 kV，毛細(xì)管溫度350℃，管透鏡電壓-130 V，毛細(xì)管電壓-38 V；樣品先采用高分辨質(zhì)譜全掃描，質(zhì)量范圍為m/z 150～1 500；分辨率為FS 30 000，MS/MS 6 000；二級質(zhì)譜采用動態(tài)數(shù)據(jù)依賴性掃描，碰撞能量設(shè)為35%，多級質(zhì)譜選取上一級最高峰離子掃描碰撞誘導(dǎo)解離碎片。

2.4 條件優(yōu)化

2.4.1 提取溶劑的選擇 針對淡竹葉化學(xué)成分特點(diǎn)，對提取溶劑進(jìn)行選擇。分別考察了體積分?jǐn)?shù)50%、70%及100%甲醇的提取效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)70%甲醇獲得的色譜峰峰容量最大，故采用70%甲醇回流提取。

2.4.2 洗脫條件的優(yōu)化 分別考察了甲醇-水、乙腈-水系統(tǒng)的洗脫效果，結(jié)果顯示乙腈洗脫時效果優(yōu)于甲醇，各色譜峰的分離效果更佳。在流動相中加入0.1%甲酸可提高質(zhì)譜信號響應(yīng)，并改善峰形，故選用乙腈-0.1%甲酸為流動相梯度洗脫。見圖1。

A.乙腈-0.1%甲酸系統(tǒng)；B.甲醇-0.1%甲酸系統(tǒng)；C.乙腈-0.1%乙酸系統(tǒng)。圖1 3種不同流動相下淡竹葉醇提物的LC-MS總離子流圖Figure 1 The LC-MS total ion chromatograms of the ethanolic extract from L.gracile in three different chromatographic conditions

2.5 淡竹葉醇提物的測定

按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按照“2.2”和“2.3”項(xiàng)下色譜及質(zhì)譜條件，用 UHPLCLTQ-Orbitrap-MSn法對淡竹葉中化學(xué)成分進(jìn)行定性分析，得供試品溶液的（-）ESI-MS總離子流（TIC）圖見圖2，觀察可得知淡竹葉醇提物各色譜峰之間實(shí)現(xiàn)較好的分離。通過檢測得到的各化學(xué)成分峰的保留時間和精確分子量，并結(jié)合二級質(zhì)譜裂解碎片信息及與對照品、數(shù)據(jù)庫及相關(guān)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)比對其中的21個化學(xué)成分峰進(jìn)行確認(rèn)，結(jié)果見表1。

圖2　淡竹葉醇提物的（-）ESI-MS總離子流圖Figure 2 The total ion chromatogram of the ethanolic extract from L.gracile in negative ion mode

2.6 黃酮碳苷對照品質(zhì)譜裂解規(guī)律的研究

采用質(zhì)譜直接進(jìn)樣方法（direct infusion），分別對4種黃酮碳苷成分葒草苷、異葒草苷、牡荊素、異牡荊素在LTQ-Orbitrap質(zhì)譜中的裂解規(guī)律進(jìn)行研究。結(jié)果表明黃酮碳苷類成分在負(fù)離子質(zhì)譜模式下均能形成穩(wěn)定的［M-H］-準(zhǔn)分子離子峰，進(jìn)一步對該離子峰進(jìn)行MS2-MS4裂解發(fā)現(xiàn)，4種黃酮碳苷成分質(zhì)譜裂解途徑具有高度相似性和特征性，并能和一般黃酮苷類成分明顯區(qū)別，可以用于黃酮碳苷類成分的分析和鑒定，以下將以葒草苷為例，具體闡述黃酮碳苷類成分的質(zhì)譜裂解規(guī)律。

葒草苷在LTQ-Orbitrap高分辨多級質(zhì)譜中形成m/z 447.092 0（C21H19O11，Δ=-0.42）的［M-H］-準(zhǔn)分子離子峰，進(jìn)一步碎裂形成2個非常明顯的子離子m/z 327.050 0（C17H11O7，Δ=0.28）、357.060 4 （C18H13O8，Δ=-0.21），高分辨質(zhì)譜顯示分別失去C4H8O4和C3H6O3的中性分子，推測該裂解發(fā)生在糖殘基上。同時觀察到微弱的連續(xù)失去3個H2O的中性分子形成了 m/z 429.080 4、411.070 7、393.060 2碎片離子。其中m/z 327.050 0的基峰在MS3質(zhì)譜中進(jìn)一步碎裂形成m/z 299.055 1（C16H11O6，Δ=0.55）和284.031 7（C15H8O6，Δ=0.71）的2個主要子離子，其中m/z 299為黃酮母核中脫去CO的碎片離子，而m/z 284為碳苷鍵發(fā)生均裂形成的奇電子離子碎片（odd electron，OE）。在m/z 299的MS4譜中，進(jìn)一步于黃酮母核內(nèi)部發(fā)生一般黃酮類特征碎裂脫去CO2形成m/z 255.065 6的碎片。見圖3。

表1 淡竹葉中21個主要化學(xué)成分LC-ESI-MS/MS數(shù)據(jù)Table 1 LC-ESI-MS/MS data of 21 major compounds from L.gracile

圖3　黃酮碳苷的質(zhì)譜裂解途徑（葒草苷）Figure 3 The MS fragment pathways of the flavone C-glycoside（orientin）

異葒草苷的苷元結(jié)構(gòu)與異葒草苷一致，僅為碳苷的取代不同，如上所述，黃酮碳苷的特征裂解主要發(fā)生在碳苷內(nèi)部，因此二者的特征質(zhì)譜等同。同理，牡荊素、異牡荊素的特征質(zhì)譜主要發(fā)生在糖的內(nèi)部，均在二級質(zhì)譜形成特征的［M-H-C3H6O3（90）］-、［M-H-C4H8O4（120）］-等碎片離子，由于質(zhì)譜裂解途徑相同，不再一一贅述。

2.7 黃酮碳苷類成分ESI-MS/MS分析

目前從淡竹葉中分離得到的黃酮碳苷主要分為以下幾類：類型1，C-6位或C-8位單糖碳苷取代，如化合物11～13，16～18；類型2，7-O位單糖氧苷取代同時C-6位或C-8位單糖碳苷取代，如化合物10；類型3，C-6位糖醛酸連接單糖鏈碳苷取代，如化合物9、14及19。其中，通過與對照品保留時間和質(zhì)譜行為的比較，化合物11、12、16、17分別鑒定為異葒草苷、葒草苷、牡荊素、異牡荊素。

類型1中黃酮碳苷類的負(fù)離子模式二級質(zhì)譜圖中，可觀察到［M-H-C4H8O4］-、［M-H-C3H6O3］-的黃酮碳苷特征峰，此外還觀察到［M-H-78］-、［MH-60］-及［M-H-18］-的碎片離子。這些離子來源于糖環(huán)的開環(huán)反應(yīng)，是這一類化合物的特征碎片離子，其相對豐度遠(yuǎn)高于碳苷鍵裂解形成的碎片離子，黃酮碳苷的C—C鍵鍵能較氧苷中的C—O鍵較高，所以碳苷類化合物以糖環(huán)內(nèi)部斷裂的裂解方式為主［13］。

類型2中化合物10的高分辨質(zhì)譜給出準(zhǔn)分子離子峰m/z 579.132 8［M-H］-（C26H28O15），MS2譜圖給出m/z 489、459、417、399、357及327等碎片峰，分別為碳苷糖環(huán)開環(huán)及脫去氧苷的碎裂產(chǎn)物，其碎裂方式見圖4。結(jié)合其精確分子量和文獻(xiàn)報道，推測化合物10為木犀草素7-O-β-D-葡萄糖基-6-C-α-L-阿拉伯糖苷。

類型3中化合物9，14和19的MS2譜圖中，首先均可觀察到2個基峰，分別為m/z 447、417、401 ［M-H-176］-及m/z 429、399、383［M-H-194］-，為脫去六碳糖醛酸（葡萄糖醛酸或半乳糖醛酸）的特征碎片。此外，化合物9的MS2譜圖中可觀察到m/z 357［M-H-176-90］-、m/z 327［M-H-176-120］-及m/z 285［M-H-176-162］-等峰，為葡萄糖開環(huán)裂解碎片?；衔?4和19的MS2譜圖中可觀察到m/z 357、341［M-H-176-60］-、m/z 327、311［M-176-90］-及m/z 285、269［M-H-176-132］-等峰，為五碳糖阿拉伯糖的開環(huán)裂解碎片。經(jīng)與文獻(xiàn)［9］數(shù)據(jù)對照，推斷化合物19為芹菜素6-C-β-D-半乳糖醛酸基（1→2）-α-L-阿拉伯糖苷，化合物9和14尚未見文獻(xiàn)報道。

2.8 羥基酚酸類成分的ESI-MS/MS鑒定

據(jù)文獻(xiàn)報道，淡竹葉含有酚酸類成分，如綠原酸、咖啡酸、香草酸等［3］?；衔?、3和5均給出準(zhǔn)分子離子峰 m/z 353.09［M-H］-及精確分子式C16H18O9，提示為同分異構(gòu)體，結(jié)合數(shù)據(jù)庫初步判定為單咖啡?？崴幔╟affeoyl-quinic acid，CQA）類成分，三者的MS2譜圖分別給出基峰為m/z 191、191 和173，表明化合物1和3易脫去單咖啡?；纬煽崴?，化合物5易從4位羥基位置斷裂形成烯醇基結(jié)構(gòu)（碎裂方式見圖5），通過與對照品比對確定化合物3為3-CQA（綠原酸），5-CQA與3-CQA的二維結(jié)構(gòu)相同，但立體構(gòu)型上存在較大差別，體現(xiàn)在質(zhì)譜中的差異為二者的二級碎裂信號相似，但在相對豐度上有明顯差異，其中5-CQA的m/z 179碎裂信號遠(yuǎn)高于3-CQA。4-CQA與3-CQA的極性相近，但在反相色譜中4-CQA的保留時間更長［14］，結(jié)合文獻(xiàn)［15］數(shù)據(jù)，確定化合物1、5分別為5-CQA（新綠原酸）和4-CQA（隱綠原酸）。

圖4　化合物10的MS2質(zhì)譜圖Figure 4 MS2spectra of compound 10

圖5　化合物1，3和5的MS2質(zhì)譜圖及主要裂解途徑Figure 5 MS2spectra of compound 1，3，5 and their major fragmentation pathways

化合物2、7和 8的準(zhǔn)分子離子峰均為 m/z 337.09［M-H］-（C16H17O8），其二級譜基峰分別為m/z 163、163和173，其裂解途徑與單咖啡?？崴岢煞窒嗨?，經(jīng)與文獻(xiàn)［16］數(shù)據(jù)對照，推斷其結(jié)構(gòu)分別為 5-pCoQA、3-pCoQA和 4-pCoQA（p-coumaroylquinic acid，對香豆酰奎尼酸）。此外，可檢測到微量的游離羥基酚酸類成分，如咖啡酸（化合物6），其MS2譜圖中可看到脫CO2的離子m/z 135。

3 討論

與正離子模式比較，淡竹葉供試品溶液在負(fù)離子模式下所得成分峰較多，信號響應(yīng)佳，故采用以負(fù)離子檢測的分析模式，能實(shí)現(xiàn)大多數(shù)化合物的結(jié)構(gòu)確證。在ESI負(fù)離子模式下，各化學(xué)成分峰高分辨一級質(zhì)譜圖主要以［M-H］-準(zhǔn)分子離子峰存在，依靠ESI-MSn圖譜可獲取有效的結(jié)構(gòu)碎裂信息。

結(jié)果顯示，淡竹葉醇提物中主要含有羥基酚酸類、黃酮碳苷類及其他黃酮類成分。高分辨質(zhì)譜給出的精確分子式信息，結(jié)合多級質(zhì)譜提供的特征碎片離子及裂解途徑分析策略，為淡竹葉藥材的物質(zhì)基礎(chǔ)研究、質(zhì)量控制提供了快速、準(zhǔn)確的檢測手段，并為進(jìn)一步尋找微量成分提供重要的參考。

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（責(zé)任編輯：劉曉涵）

中圖分類號：R284.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1006-8783（2016）03-0300-07

DOI：10.16809/j.cnki.1006-8783.2016031802

收稿日期：2016-03-18

基金項(xiàng)目：廣東省中醫(yī)藥管理局建設(shè)中醫(yī)藥強(qiáng)省科研項(xiàng)目（20152136）；國家自然科學(xué)基金（81402887）

作者簡介：潘智然（1983—），男，主管藥師，從事中藥材質(zhì)量控制研究，Email：1055478879@qq.com；通信作者：張靖（1983—），女，博士，助理研究員，從事中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)量控制研究，電話：020-39318571，Email：ginniezj@163.com。

Identification of chemical constituents from Lophatherum gracile Brongn.by UHPLC-LTQ-Orbitrap HR MSn

PAN Zhiran1，WANG Tenghua1，ZHU Shoulun1，REN Zhiyao1，ZHANG Jing1，2
（1.The Second College of Clinic Medicine，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510120，China；2.Guangdong Province Institute of Chinese Medicine，Guangzhou 510006，China）

AbstractObjective To establish a method for qualitative analysis of chemical components from Lophatherum gracile Brongn.by UHPLC-ESI-HR MSnspectrometry.Methods A Phenomenex kinetix C18column and a gradient elution of acetonitrile-0.1%formic acid were applied for UHPLC separation.An orbitrap mass analyzer combined with a linear ion trap were used for high resolution mass spectrometry and subsequent collision-induced dissociation.Results High separation efficiency was achieved with UHPLC on constituents from L.gracile.According to the high-resolution mass information and MS/MS fragmentation behaviors 21 compounds were tentatively identified.Conclusion This work set a good example for rapid qualitative analysis of different classes of constituents from L.gracile which might be helpful for its further phytochemical study and quality control.

Key wordsLophatherum gracile UHPLC-ESI-HR MSnflavone C-glycosides chemical constituents