程玉鵬，李天聰1，周永強1，林進(jìn)華1，陳琦1，馬愛萍1，李弘琨1

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1株具有抗肝癌活性的狹葉柴胡內(nèi)生真菌的鑒定

程玉鵬1，2，李天聰1，周永強1，林進(jìn)華1，陳琦1，馬愛萍1，李弘琨1

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江哈爾濱150040；2.哈爾濱師范大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150024）

摘要：目的對1株具有抗肝癌活性的狹葉柴胡內(nèi)生真菌CHS4進(jìn)行菌種鑒定，并對其抗肝癌活性進(jìn)行初步檢測。方法采用傳統(tǒng)分類學(xué)方法及電子顯微鏡觀察對CHS4進(jìn)行形態(tài)鑒定，并采用真菌鑒定通用引物V9D與LS266對其基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增得到ITS序列，將已經(jīng)測得的序列結(jié)果與GenBank中已知序列進(jìn)行Blast分析，從而進(jìn)行分子鑒定。利用MTT法對菌CHS4的乙醇粗提物進(jìn)行抗肝癌活性檢測。

結(jié)果內(nèi)生真菌CHS4經(jīng)鑒定為鏈格孢屬真菌互隔交鏈孢霉（Alternaria alternata）；該菌株發(fā)酵液的乙醇粗提物對肝癌細(xì)胞HepG-2的抑制作用與其濃度成正相關(guān)，且IC50值為75.11 μg/mL。結(jié)論從狹葉柴胡中分離到一株具有抗肝癌作用的內(nèi)生真菌CHS4，可作為生產(chǎn)抗肝癌藥物的候選資源。

關(guān)鍵詞：狹葉柴胡；內(nèi)生真菌；菌種鑒定；抗肝癌活性

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-05-23 11：10 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160523.1110.003.html

內(nèi)生真菌是指在其生活史的部分或全部階段生存在植物體內(nèi)而不引起明顯感染癥狀的真菌［1-2］，在與宿主植物共同進(jìn)化的過程中，其次生代謝產(chǎn)物十分豐富，具有多種藥理作用［3-5］。柴胡屬（Bupleurum L.）植物是傘形科（umbelliferae）植物中的大屬之一，《中國藥典》規(guī)定柴胡或狹葉柴胡為正品［6］。近代藥理研究表明，柴胡具有抗感染、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫、降血脂及抗腫瘤等功效［7］。自1993年，具有產(chǎn)紫杉醇能力的內(nèi)生真菌被發(fā)現(xiàn)后，利用植物內(nèi)生真菌生產(chǎn)藥效活性物質(zhì)引起了人們的廣泛重視［8］。而內(nèi)生真菌在發(fā)酵過程中，具有周期短、易生長的特性，因此對內(nèi)生真菌產(chǎn)活性物質(zhì)的深入研究具有十分重要的意義。在前期工作中，本課題組從狹葉柴胡中分離得到1株內(nèi)生真菌CHS4，本文對該菌株進(jìn)行了形態(tài)學(xué)鑒定以及分子鑒定，并對其抗肝癌活性進(jìn)行了初步研究，為后續(xù)活性產(chǎn)物的分離純化研究提供參考。

1 材料與儀器

1.1 材料

菌株來源：狹葉柴胡內(nèi)生真菌 CHS4由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院生物技術(shù)實驗室分離并保藏。

細(xì)胞來源：肝癌細(xì)胞HepG-2購買自ATCC細(xì)胞庫，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院生物技術(shù)實驗室傳代保種。

1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯蔗糖（瓊脂）培養(yǎng)基：包括質(zhì)量濃度分別為20%的馬鈴薯，2%的蔗糖，1.2%的瓊脂。將馬鈴薯洗凈去皮，切成小塊，加入適量水煮沸15 min，八層紗布濾過，向濾液中加入蔗糖，攪拌以加速蔗糖溶解，定容（固體培養(yǎng)基還需加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.2%的瓊脂），121℃滅菌20 min。

1.3 儀器

PH-71電熱恒溫培養(yǎng)箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；FA1204B電子天平（上海精科天美科學(xué)儀器有限公司）；RT-6000酶標(biāo)分析儀（深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司）；Milli-Q Biocel超純水儀（美國Millipore公司）；FL-30系列生物顯微鏡（江西楓林光學(xué)儀器有限公司）；JY-SPCT水平電泳槽（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）；Bio-Rad T100TMThermal Cycler（美國Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1 菌株的形態(tài)學(xué)鑒定

根據(jù)《真菌鑒定手冊》［9］方法，采用菌落形態(tài)觀察法和顯微結(jié)構(gòu)觀察法對CHS4進(jìn)行鑒定。接種于PDA固體平板上的菌落，觀察培養(yǎng)基中菌落的大小、顏色、菌落表面的紋飾、邊緣的形態(tài)與生長情況。插片培養(yǎng)的菌絲在電子顯微鏡下觀察有無分生孢子梗，產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)的形態(tài)特征，分生孢子的大小、形狀及聚集方式等。

2.2 菌株的分子鑒定

2.2.1 基因組DNA的提取與檢測 采用液氮研磨法提取真菌基因組DNA［10］，用適量去離子水溶解，-20℃保存。取少量模板DNA，分光光度法測定A260/A280的值，以確定模板純度及計算DNA的濃度。采用1×TAE作為電泳緩沖液，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測真菌基因組DNA模板，加樣量為5 μL，電壓120 V，電泳時間30 min。紫外燈下檢測真菌基因組DNA提取結(jié)果。

2.2.2 PCR擴(kuò)增 采用真菌鑒定通用引物V9D與LS266［11］，對內(nèi)生真菌進(jìn)行 ITS序列擴(kuò)增。引物由上海生物工程有限公司進(jìn)行合成。引物 V9D（5′-TTAAGTCCCTGCCCTTTGTA-3′）；引物 LS266（5′-GCATTCCCAAACAACTCGACTC-3′）。

反應(yīng)體系：10×PCR Buffer with MgCl27 μL，dNTP（2.5 mmol/L）10 μL，引物各2 μL，模板DNA 2 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.35 μL，加ddH2O 至50 μL。

PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán)，最后72℃延伸 10 min。反應(yīng)結(jié)束后，取擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL，經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.8%瓊脂糖凝膠電泳，鑒定目的條帶與預(yù)期大小是否相符。

2.2.3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的序列測定與數(shù)據(jù)處理 將PCR擴(kuò)增片段送上海生物工程有限公司進(jìn)行測序，以V9D、LS266為引物雙向測序。將已經(jīng)測得的序列結(jié)果與GenBank中已知序列進(jìn)行Blast分析，再從Genbank數(shù)據(jù)庫中獲取相關(guān)菌的種屬的ITS序列信息，應(yīng)用MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2.2.4 抗肝癌活性的檢測 從保存在PDA斜面培養(yǎng)基的內(nèi)生真菌中挑取菌絲，接種于裝有100 mL馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，25℃黑暗條件下，靜置發(fā)酵培養(yǎng)12 d。將得到的菌體烘干，稱定質(zhì)量，按照60 mL/g干菌體的比例加入體積分?jǐn)?shù)70%乙醇回流提取2次，每次2 h，濾過，合并濾液，50℃揮干乙醇，備用。

采用體外測定細(xì)胞毒活性的MTT（溴化四氮唑藍(lán)）法［12］，以阿霉素作為陽性藥，在570 nm波長下測定吸光度（A），按下列公式計算對肝癌細(xì)胞HepG-2的生長抑制率（I）：

I=（A對照組-A試驗組）/A對照組×100%。

3 結(jié)果與分析

3.1 CHS4菌株的鑒定

3.1.1 菌株的形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果 利用點植法在PDA固體培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)CHS4，可得到單一菌落，菌落生長迅速、平整，等徑生長，邊緣整齊。起初菌落為白色或灰白色，由于菌絲體產(chǎn)生色素，能夠擴(kuò)散到培養(yǎng)基中，之后漸漸轉(zhuǎn)變?yōu)樯钌?，菌落呈灰黑色，菌落背面為黑色。插片法可觀察到菌絲多細(xì)長，分枝分隔?？梢姺稚咦?，橫隔明顯，結(jié)果見圖1。對照《真菌鑒定手冊》［9］及《鏈格孢屬真菌現(xiàn)代分類方法研究》［13］將 CHS4初步歸屬為鏈格孢屬（Alternaria）。

A.內(nèi)生真菌CHS4的菌落形態(tài)；B.菌絲形態(tài)；C.分生孢子。圖1 內(nèi)生真菌CHS4的形態(tài)Figure 1 The morphology of endophytic fungus CHS4

3.1.2 菌株的分子鑒定結(jié)果 由圖2可以看出，內(nèi)生真菌的DNA模板在2.3 kb的位置有一清晰條帶，且無拖尾現(xiàn)象，證明所得基因組DNA完整，符合進(jìn)行下一步PCR擴(kuò)增條件。PCR電泳結(jié)果顯示，樣品ITS序列的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在約900 bp左右的位置有清晰條帶，分子質(zhì)量大小范圍與文獻(xiàn)［14］所述一致，且無其他雜質(zhì)存在，證明所得PCR產(chǎn)物為預(yù)期產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物經(jīng)測序，得到擴(kuò)增產(chǎn)物序列長度為920 bp，該序列包括部分18S序列，全部ITS1、5.8S、ITS2序列和部分28S序列，將所得序列提交至美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI），進(jìn)行Blast比對后構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，并提交測序結(jié)果獲得菌株CHS4GenBank登陸號為KJ082099。

選取GenBank中與KJ082099的ITS序列同源性高的系列菌株用于系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果表明與CHS4相似性較高的序列主要分布在鏈格孢屬。由圖 3可見，CHS4（KJ082099.1）與 GU797144.1 （Alternaria alternata）聚類在同一分支，組成一個單系類群（monophyletic group），親緣關(guān)系最為相近，其同源性達(dá)到99%，故可判斷該菌株為鏈格孢屬真菌互隔交鏈孢霉（Alternaria alternata）。

3.2 抗肝癌活性檢測

把內(nèi)生真菌CHS4的乙醇粗提物依次以5個不同質(zhì)量濃度（0.04、2、10、50、100 μg/mL）進(jìn)行給藥，選用廣譜抗腫瘤藥阿霉素作為陽性藥，分別測定各物質(zhì)對肝癌細(xì)胞HepG-2的抑制率，結(jié)果見圖4。可見，菌株CHS4發(fā)酵液的乙醇粗提物具有一定的抗肝癌作用，且對肝癌細(xì)胞HepG-2的抑制作用與其質(zhì)量濃度成正相關(guān)，IC50值為75.11 μg/mL。

A.基因組DNA；B.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。M.DNA Marker；1、2.基因組DNA；K.空白對照；P.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。圖2 基因組DNA及PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖片F(xiàn)igure 2 　Electrophoresis of genome DNA and PCR amplification product

圖3　根據(jù)ITS序列用MEGA5.0軟件生成的系統(tǒng)進(jìn)化樹Figure 3 The phylogenetic tree generated by ITS sequences analysis using MEGA5.0 program

A.陽性藥阿霉素；B.CHS4乙醇粗提物。圖4 阿霉素和CHS4乙醇粗提物對肝癌細(xì)胞HepG-2的抑制率Figure 4 The inhibition rate of positive drug doxorubicin and crude ethanol extracts of CHS4 on HepG-2 cells

4 討論

研究表明，柴胡具有抗腫瘤的藥理作用［15］。本研究對分離自狹葉柴胡內(nèi)生真菌的抗肝癌活性進(jìn)行初步檢測，結(jié)果表明內(nèi)生真菌CHS4具有一定的抗肝癌作用。在自然條件下，內(nèi)生真菌與宿主植物能夠協(xié)同進(jìn)化［16］。目前推測，可能由于基因的重組或二者之間長期進(jìn)行信息交流，使得內(nèi)生真菌獲得與宿主相同的代謝通路［17］，從而使內(nèi)生真菌具有產(chǎn)出與宿主植物相同或相似活性成分的能力，進(jìn)而具有與宿主植物相同的藥理作用［8］。這為利用內(nèi)生真菌大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)藥理活性物質(zhì)奠定了前期理論基礎(chǔ)。

在傳統(tǒng)的真菌鑒定方面，一直都是以形態(tài)特征為主要鑒定標(biāo)準(zhǔn)，而形態(tài)特征易受營養(yǎng)基質(zhì)和溫度、濕度、光、pH等條件的影響，有時候可能會難于準(zhǔn)確鑒定，具有一定的弊端。ITS序列分析能夠在分子水平給出菌株的相關(guān)屬、種的鑒定分離信息，并可選取同源性高的系列菌株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，具有一定的準(zhǔn)確性。應(yīng)用ITS序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建對菌株鑒定及真菌多樣性的研究來說不失為一種強有力工具，其快速準(zhǔn)確的優(yōu)點對于鑒定特征不明顯和難于培養(yǎng)的菌株來說更有意義。

據(jù)報道，鏈格孢屬是全球分布最廣，經(jīng)濟(jì)上重要的半知菌類真菌之一［18］。某些鏈格孢種高產(chǎn)纖維素酶是具有應(yīng)用潛力的生物資源［19］。除此之外，作為植物內(nèi)生真菌的鏈格孢可產(chǎn)生喜樹堿、紫杉醇等抗癌藥物［20-21］。本研究中的狹葉柴胡內(nèi)生真菌CHS4具有抗肝癌活性的結(jié)果也與這一理論基本符合，但其抗肝癌的活性成分還需進(jìn)一步分離。在今后的研究中，將深入對其抗肝癌的活性部位進(jìn)行篩選及分析，為進(jìn)一步分離得到其抗肝癌的活性成分及研究其抗肝癌的作用機(jī)制提供一定的依據(jù)。

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（責(zé)任編輯：陳翔）

中圖分類號：R284.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1006-8783（2016）03-0286-05

DOI：10.16809/j.cnki.1006-8783.2016030901

收稿日期：2016-03-09

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目（81573539）；黑龍江省自然科學(xué)基金項目（H2015042）

作者簡介：程玉鵬（1966—），男，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事中藥生物技術(shù)的研究工作，Email：yupengcheng@msn.com。

Identification of an endophytic fungus of Bupleurum scorzonerifolium Willd.with anti-hepatoma activity

CHENG Yupeng1，2，LI Tiancong1，ZHOU Yongqiang1，LIN Jinhua1，CHEN Qi1，MA Aiping1，LI Hongkun1
（1.School of Pharmacy，Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China；2.School of Life Science and Technology，Harbin Normal University，Harbin 150024，China）

AbstractObjective To identify an endophytic fungus of Bupleurum scorzonerifolium Willd.with antihepatoma activity and study its anti-hepatoma activity as well.Methods By using the traditional taxonomic methods the identification of morphological characters were performed.Primers V9D and LS266 were used to amplify the ITS sequence from genome DNA of CHS4.The amplified sequence was compared with known sequences in Blast of NCBI.Anti-hepatoma activity was detected by MTT assay.Results Fungus CHS4 from B.scorzonerifolium Willd. was classified as Alternaria alternate by the morphology and ITS identification. The ethanol crude extract of CHS4 had the ability to inhibit HepG-2 cell growth.There was a positive correlation between inhibition effect and concentration and IC50value was 75.11 μg/mL.Conclusion The strain CHS4 with anti-hepatoma activity can be regarded as alternative resource for producing anti-hepatoma drugs.

Key wordsBupleurum scorzonerifolium Willd. endophytic fungi strain identification anti-hepatoma activity