尹田鵬+俞靜+王家鵬

[摘要] 目的 從黃草烏的根部分離鑒定內(nèi)生真菌。 方法 利用PDA培養(yǎng)基進(jìn)行黃草烏根部?jī)?nèi)生真菌的分離與純化，根據(jù)菌落的形態(tài)特征并結(jié)合真菌的ITS序列進(jìn)行菌株鑒定。 結(jié)果 從黃草烏根部共分離到內(nèi)生真菌52株，鑒定為20屬34種，絕大部分屬于子囊菌門，其中鐮刀菌屬和青霉菌屬為優(yōu)勢(shì)屬。 結(jié)論 黃草烏根部的內(nèi)生真菌具有多樣性，可作為潛在的資源供藥物篩選。

[關(guān)鍵詞] 黃草烏；內(nèi)生真菌；鐮刀菌屬；青霉屬

[中圖分類號(hào)] R927 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2016）10（c）-0009-04

[Abstract] Objective To isolate and identify the entophytic fungal in the roots of Aconitum vilmorinianum. Methods PDA medium was used to isolate and purify the endophytic fungi in the roots of Aconitum vilmorinianum. The purified strains were identified by morphology together with ITS sequence. Results Fifty-two strains of endophytic fungi were isolated and identified belonging to 34 species， 20 genera. Most of the isolated fungi are belong to the Ascomycota. Fusarium and Penicillium are the dominant families. Conclusion The entophytic fungi in the roots of Aconitum vilmorinianum are diverse， which can serve as potential resource for drug screening.

[Key words] Aconitum vilmorinianum； Entophytic fungal； Fusarium； Penicillium

黃草烏（Aconitum vilmorinianum Kom.）是毛茛科（Ranunculaceae）多年生草本植物，俗稱大草烏、昆明烏頭，主要分布在云南中部、四川會(huì)理及貴州西部，生長(zhǎng)于海拔2100～2500 m間山地灌叢中。黃草烏在云南素有“大補(bǔ)藥”之稱，是云南白藥的主要原料之一，可治跌打損傷、風(fēng)濕等癥[1-2]。黃草烏野生資源豐富，且易栽培，已有人工種植基地。黃草烏根部富含二萜生物堿成分[3-4]，該類成分具有復(fù)雜的化學(xué)結(jié)構(gòu)和顯著的藥理活性[5-7]。

植物內(nèi)生真菌（endophyte fungi）是非常重要的微生物資源，幾乎所有植物組織內(nèi)都存在內(nèi)生真菌，其發(fā)酵產(chǎn)物具豐富的化學(xué)多樣性和廣泛的生物活性[8-9]。自Strierle等[10]發(fā)現(xiàn)紅豆杉的內(nèi)生真菌紫衫霉可產(chǎn)紫杉醇后，引發(fā)了利用內(nèi)生真菌來替代原植物的研究熱潮。很多植物中都發(fā)現(xiàn)了能夠產(chǎn)和宿主相同結(jié)構(gòu)的活性次生代謝產(chǎn)物的內(nèi)生真菌，如白喉烏頭根部的內(nèi)生真菌芽枝狀枝孢（Cladosporium cladosporioides）可產(chǎn)烏頭堿[11]。為保護(hù)黃草烏野生植物資源，緩解我國中藥資源日益減少與需求量不斷增加之間的矛盾，本研究對(duì)黃草烏根部的內(nèi)生真菌進(jìn)行了分離與鑒定，為黃草烏的中藥資源保護(hù)和開發(fā)利用提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃草烏新鮮健康植株于2015年10月采集于云南省昆明市盤龍區(qū)，由昆明醫(yī)科大學(xué)楊淑達(dá)副教授鑒定，標(biāo)本（2015-yc-1）保存于云南大學(xué)化學(xué)科學(xué)與工程學(xué)院。葡萄糖、瓊脂粉、NaClO購于上海泰坦科技股份有限公司（上海），青霉素及卡那霉素購于阿拉?。ū本?，酒精購于天津化學(xué)試劑有限公司（天津）。

1.2 內(nèi)生真菌的分離與培養(yǎng)

1.2.1 分離培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g煮沸30 min，加入葡萄糖20 g，瓊脂粉12 g，紗布過濾，濾液定容至1000 mL，pH自然，121°C滅菌30 min。

1.2.2 分離與培養(yǎng) 黃草烏的根用自來水沖洗干凈，截成6～8 cm長(zhǎng)條，晾干水分后于5% NaClO溶液漂洗60 s，無菌水沖洗三次，然后于75%酒精漂洗60 s，最后無菌水沖洗三次則表面消毒處理完畢。無菌狀態(tài)下將根切成2 mm3小塊，置于分離平板培養(yǎng)基（28±1）°C靜止培養(yǎng)，培養(yǎng)基需預(yù)先加入青霉素（100 mg/L）和卡那霉素（100 mg/L）以抑制細(xì)菌生長(zhǎng)。3～7 d后培養(yǎng)基中可見菌落形成，挑取組織周圍的菌落轉(zhuǎn)接入PDA斜面。采用平板梯度稀釋法純化分得的內(nèi)生真菌，根據(jù)其主要菌落形態(tài)特征（菌落大小、顏色、表面特征和質(zhì)地）和菌體個(gè)體形態(tài)特征（菌絲、子實(shí)體和孢子形態(tài)），按微生物分類的不同將同一類群進(jìn)行歸類。最后將已純化和歸類的菌株分別轉(zhuǎn)入PDA斜面，在（28±1）°C下培養(yǎng)。

1.3 內(nèi)生真菌的鑒定

采用插片培養(yǎng)方法對(duì)分離的內(nèi)生真菌進(jìn)行顯微形態(tài)特征的觀察、鑒定，在顯微鏡下觀察子實(shí)體特征，結(jié)合培養(yǎng)特性，將菌株鑒定到屬。然后依據(jù)不同屬的分類標(biāo)準(zhǔn)，參照文獻(xiàn)的方法進(jìn)行種的鑒定[12]。

1.4 分子生物學(xué)信息分析

在PDA平板上恒溫培養(yǎng)內(nèi)生真菌5 d后在無菌條件下用刀片刮取菌絲至1.5 mL離心管收集菌絲體。在研缽中用液氮充分研磨菌絲體至粉末狀，立即裝入1.5 mL離心管中，用真菌DNA提取試劑盒提取基因組DNA，置于-20°C冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｌ崛』蚪MDNA后，用引物ITS4進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物交由昆明碩擎生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果進(jìn)行Blast比對(duì)。

2 結(jié)果

從黃草烏的根部共分離得到52株內(nèi)生真菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)和ITS分子測(cè)定鑒定為20屬34種見表1。從表1中可以看出，分離得到的黃草烏的根部?jī)?nèi)生真菌絕大部分分布在子囊菌門（Ascomycota）（44株29種）。子囊菌門的菌株在綱、目、科、屬等分類水平上具有豐富的多樣性，分離鑒定的真菌包括子囊菌門的4綱、7目、9科、16屬，其中地絲霉屬（Geomyces）和漆斑菌屬（Myrothecium）在科的水平上未分類[13]。屬于接合菌門的菌株僅有4株2種，都為接合菌綱毛霉菌目毛霉菌科毛霉菌屬。另外有4株3種的真菌屬于擔(dān)子菌門，分布于擔(dān)子菌門的1綱、2目、3科、3屬中。在綱的分類水平上，糞殼菌綱有24株，占分離總數(shù)的46.2%，包括10屬13種。其次為散囊菌綱，有15株，包括2屬12種。在目的分類水平上，優(yōu)勢(shì)目為肉座菌目，具有18株9種的內(nèi)生真菌，其次為散囊菌目，有15株12種。叢赤殼科和發(fā)菌科為黃草烏的優(yōu)勢(shì)菌群，分別有14株6種和15株12種。從屬的層面上看，鐮刀菌屬共分離得到12株4種，是黃草烏內(nèi)生真菌的優(yōu)勢(shì)屬種；其次是青霉菌屬，有11株9種，曲霉屬有4株3種見表2。

3 討論

李治瀅等[14]曾報(bào)道從黃草烏的根和莖中分到12個(gè)屬的內(nèi)生真菌，主要有鐮刀菌屬、毛殼菌屬（Chaetomium）、黑孢屬和青霉屬等。本研究對(duì)黃草烏根部?jī)?nèi)生真菌菌群的分析，從中鑒定了19屬34種的內(nèi)生真菌，其中有14屬的真菌首次從黃草烏中分離得到。

本研究所得黃草烏根部的內(nèi)生真菌類群普遍被認(rèn)為腐生性較強(qiáng)，但是所采集的樣本全部來自健康植株，宿主未表現(xiàn)受到傷害或感染病害的癥狀，應(yīng)該不會(huì)給腐生性真菌提供生長(zhǎng)基質(zhì)。因此認(rèn)為這些真菌是內(nèi)生的或至少是部分內(nèi)生且不引起植物病害，它們符合植物內(nèi)生真菌的有關(guān)定義[15-16]。本研究還發(fā)現(xiàn)鐮刀菌屬是黃草烏根部?jī)?nèi)生真菌的優(yōu)勢(shì)屬種，在本實(shí)驗(yàn)中分離得到的4種鐮刀菌屬的真菌：腐皮鐮刀菌（Fusarium solani）、燕麥鐮刀菌（Fusarium avenaceum）、三隔鐮刀菌（Fusarium tricinctum）尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum f. ciceris）均被報(bào)道能引起植物病害[17-18]，可以認(rèn)為是潛伏的致病菌。本研究中亦從黃草烏中分離得到芽枝狀枝孢，該菌曾被報(bào)道可產(chǎn)生二萜生物堿類化合物烏頭堿，本研究所分離得到的芽枝狀枝孢是否能在一定的培養(yǎng)條件下產(chǎn)生二萜生物堿則有待進(jìn)一步研究。

結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道及本研究的結(jié)果，表明烏頭屬植物中的內(nèi)生真菌具有豐富的多樣性[19-20]。內(nèi)生真菌的次生代謝產(chǎn)物具豐富的化學(xué)多樣性和廣泛的生物活性，烏頭屬植物內(nèi)生真菌可作為潛在資源供藥物篩選。對(duì)黃草烏內(nèi)生真菌的活性代謝成分進(jìn)行系統(tǒng)而深入的研究，有利于保護(hù)植物資源、開發(fā)新型藥物，我們將在今后的工作中有針對(duì)性地進(jìn)行菌株的活性篩選和成分分離。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 中國科學(xué)院植物志編輯委員會(huì).中國植物志（第27卷）[M].北京：科學(xué)出版社，1978：245-246.

[2] Li M，He J，Jiang LL et al. The anti-arthritic effects of Aconitum vilmorinianum， a folk herbal medicine in Southwestern China [J]. J Ethnopharmacol，2013，147（1）：122-127.

[3] Yin TP，Cai L，F(xiàn)ang HX，et al. Diterpenoid alkaloids from Aconitum vilmorinianum [J]. Phytochem，2015，116（8）：314-319.

[4] Tang TX，Chen DL，Wang FP. A new C19-diterpenoid alkaloid from Aconitum vilmorinianum [J]. Chin. J. Org. Chem，2014，34（5）：909.

[5] Yin T，Cai L，Lei G，et al. Two new diterpenoid alkaloids from the roots of Aconitum duclouxii Levl. [J]. Chin J Org Chem，2013，33（12）：2528.

[6] Yin TP，Cai L，Zhou H，et al. A new C19-diterpenoid alkaloid from the roots of Aconitum duclouxii [J]. Natur Prod Res，2014，28（19）： 1649-1654.

[7] 趙永堂.新烏頭堿，烏頭堿與次烏頭堿在附子不同炮制法中含量變化的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2012，9（5）：27-28.

[8] 周皓，楊亞濱，黎唯，等.植物內(nèi)生菌中生物堿成分研究進(jìn)展[J].云南民族大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2015，24（1）：1-9.

[9] Tan RX，Zou WX. Endophytes：a rich source of functional metabolites [J]. Natur Prod Rep， 2001，18（4）：448-459.

[10] Stierle A，Strobel G，Stierle D. Taxol and taxane production by Taxomyces andreanae，an endophytic fungus of Pacific yew [J]. Science，1993，260（5）：214-216.

[11] Yang K，Liang J，Li Q，et al. Cladosporium cladosporioides XJ-AC03， an aconitine-producing endophytic fungus isolated from Aconitum leucostomum [J]. World J Microbiol Biotechnol，2013，29（5）：933-938.

[12] 魏靜超.真菌鑒定手冊(cè)[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1997：1-571.

[13] Minnis AM， Lindner DL. Phylogenetic evaluation of Geomyces and allies reveals no close relatives of Pseudogymnoascus destructans， combnov.，in bat hibernacula of eastern North America [J]. Fungal Biol，2013，117（9）：638-649.

[14] 李治瀅，李紹蘭，楊麗源，等.滇南黃草烏內(nèi)生真菌的分離和初步鑒定[J].中國民族民間醫(yī)藥雜志，2008，17（7）：10-12.

[15] Wilson D. Endophyte：the evolution of a term，and clarification of its use and definition [J]. Oikos，1995，73（2）：274-276.

[16] 李治瀅，楊麗源，周斌，等.燈盞細(xì)辛內(nèi)生真菌的研究Ⅰ：菌種分離及其分類鑒定[J].云南大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2003，25（1）：65-68.

[17] 張向民.鐮刀菌屬分類學(xué)研究歷史與現(xiàn)狀[J].菌物研究，2005，3（2）：59-62.

[18] Yang YB，Yang FF，Miao CP，et al. Antifungal metabolites from the rhizospheric Penicillium sp. YIM PH 30003 associated with Panax notoginseng [J]. Phytochem Lett，2015，11（5）：249-253.

[19] 李治瀅，陳有為，楊麗源，等.川烏植物內(nèi)生真菌抗菌活性的研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2009，21（4）：676-678.

[20] 艾嫦，朱妍妍，趙長(zhǎng)琦.烏頭屬植物化學(xué)成分，藥理作用及其內(nèi)生菌的研究進(jìn)展[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2012， 24（2）：248-259.

（收稿日期：2016-07-15 本文編輯：趙魯楓）