張　沖，劉麗春，郭利君，王　磊

（甘肅省人民醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000）

?

HMFG1-β-葡萄糖苷酶偶聯(lián)物聯(lián)合苦杏仁苷體外對(duì)膀胱癌EJ細(xì)胞殺傷作用的研究

張沖，劉麗春，郭利君*，王磊

（甘肅省人民醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000）

摘要：目的 本實(shí)驗(yàn)將鼠源性免疫球蛋白G1（以下簡(jiǎn)稱(chēng)HMFG1）與β-葡萄糖苷酶連接，研究HMFG1-β-葡萄糖苷酶偶聯(lián)物聯(lián)合苦杏仁苷在體外特異性殺傷人膀胱癌細(xì)胞（以下簡(jiǎn)稱(chēng)EJ細(xì)胞）的作用，探討HMFG1-β-葡萄糖苷酶偶聯(lián)物聯(lián)合苦杏仁苷用于膀胱癌治療的前景。方法 將不同濃度的苦杏仁苷加入HMFG1-β-葡萄糖苷酶偶聯(lián)物、HMFG1單抗、HMFG1單抗加β-葡萄糖苷酶中，作用于EJ細(xì)胞，采用四氮噻唑藍(lán)比色法（以下簡(jiǎn)稱(chēng)MTT法）與水溶性四唑鹽比色法（以下簡(jiǎn)稱(chēng)WST-8法）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果 在不同方法下，不同苦杏仁苷濃度的HMFG1-β-葡萄糖苷酶偶聯(lián)物對(duì)EJ細(xì)胞的殺傷活性吸光度值與其他組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；在不同方法下，各組對(duì)EJ細(xì)胞的抑制率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。偶聯(lián)物在250 mmol·l-1濃度下，MTT法IC50為2.12 mmol·l-1、WST-8法IC50為1.17 mmol·l-1。結(jié)論 本實(shí)驗(yàn)證明HMFG1-β-葡萄糖苷酶偶聯(lián)物聯(lián)合苦杏仁苷具有明顯特異性殺傷EJ細(xì)胞的作用，HMFG1-β-葡萄糖苷酶偶聯(lián)物聯(lián)合苦杏仁苷可能成為治療膀胱癌的有效策略，可以進(jìn)入動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。

關(guān)鍵詞：HMFG1-β-葡萄糖苷酶偶聯(lián)物；苦杏仁苷；EJ細(xì)胞

苦杏仁苷（amygdalin）在自然界中主要存在于苦杏、苦扁桃、油桃、枇杷、蘋(píng)果、黑櫻桃等果仁和葉子當(dāng)中，1920年美國(guó)首次將苦杏仁苷用于治療腫瘤?？嘈尤受债a(chǎn)生的氰化物雖然能殺傷腫瘤細(xì)胞，但缺乏特異性，對(duì)機(jī)體可造成嚴(yán)重的系統(tǒng)毒性［1］。為了發(fā)揮苦杏仁苷的抗腫瘤作用，本實(shí)驗(yàn)將HMFG1（鼠源性免疫球蛋白G1）與β-葡萄糖苷酶連接，使酶與抗體偶聯(lián)為一體。采用MTT（四氮噻唑藍(lán)比色法）［2］與WST-8法（水溶性四唑鹽比色法）研究HMFG1-β-葡萄糖苷酶偶聯(lián)物兼有抗原MUC1結(jié)合活性及水解苦杏仁苷的β-葡萄糖苷酶活性，對(duì)EJ細(xì)胞（人膀胱癌細(xì)胞）有特異性殺傷作用，為治療膀胱癌、降低復(fù)發(fā)率、控制術(shù)后轉(zhuǎn)移提供進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，現(xiàn)介紹如下。

1　材料與方法

1.1試劑與儀器

EJ細(xì)胞購(gòu)于中科院上海細(xì)胞庫(kù)；RPMI-1640（Roswell Park Memorial Institute）培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司）；新生小牛血清（蘭州榮曄生物科技有限責(zé)任公司）；胰蛋白酶粉末（美國(guó)Gibco BRL公司）；MTT（美國(guó)Fluka公司）；HMFG1-β-葡萄糖苷酶偶聯(lián)物、CCK-8試劑盒（同仁化學(xué)研究所）；苦杏仁苷（美國(guó)波士頓生物技術(shù)公司）。儀器：CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（型號(hào)：shellab 2306）；酶標(biāo)儀（ELX800型）；細(xì)胞培養(yǎng)瓶、96孔培養(yǎng)板（丹麥NuNc公司）；倒置顯微鏡（日本Olympus產(chǎn)品）。

HMFG1-β-葡萄糖苷酶偶聯(lián)物的制備：本實(shí)驗(yàn)選用異型雙功能交聯(lián)劑間-馬來(lái)酰亞胺基苯甲酸N-羥基琥珀酰亞胺酯（MBS）。MBS具有兩個(gè)不同的選擇性反應(yīng)基團(tuán)，N-羥基琥珀酰亞胺酯可專(zhuān)一地與蛋白質(zhì)分子中的氨基結(jié)合，馬來(lái)酰亞胺可與蛋白質(zhì)中的巰基反應(yīng)，再通過(guò)還原劑2-亞胺基四氫噻吩（2-IT）與單抗反應(yīng)，在抗體中引入了巰基，使先與β-葡萄糖苷酶的氨基結(jié)合了的MBS只能同巰基化的抗體結(jié)合，避免了連接反應(yīng)中抗體與抗體、酶與酶之間的自身聚合，提高了交聯(lián)反應(yīng)的效率。

1.2方法

1.2.1MTT法 分為：（1）HMFG1單抗-β-葡萄糖苷酶偶聯(lián)物組；（2）HMFG1單抗加β-葡萄糖苷酶組；（3）HMFG1單抗組。準(zhǔn)備苦杏仁苷溶液，濃度分別為1 mmol·l-1，5 mmol·l-1，10 mmol·l-1，15 mmol·l-1。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的EJ細(xì)胞接種于96孔板（1×105/孔），待細(xì)胞貼壁后［3-4］去除培養(yǎng)基，分別加入以上3組藥物，終濃度為250 mmol·l-1，不加藥組為陰性對(duì)照組，并以不加細(xì)胞只加培養(yǎng)基作為空白進(jìn)行調(diào)零。繼續(xù)培養(yǎng)2小時(shí)，然后用無(wú)血清RPM-1640培養(yǎng)基洗3次，再在3組中加入4個(gè)濃度的苦杏仁苷，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。然后加入MTT 20 μl/孔（濃度5 mg/ml），培養(yǎng)4小時(shí)，吸去上清液，加入DMSO 150 μl/孔，充分震蕩10分鐘，放入酶標(biāo)儀，在490 nm下測(cè)定各孔吸光度值（A），取平均值，按公式計(jì)算細(xì)胞抑制率：細(xì)胞抑制率=（1-A實(shí)驗(yàn)組/A對(duì)照組）×100%，求出細(xì)胞生長(zhǎng)抑制50%時(shí)的苦杏仁苷濃度，即IC50值，并進(jìn)行比較。

1.2.2WST-8法 分為：（1）HMFG1單抗-β-葡萄糖苷酶偶聯(lián)物組；（2）HMFG1單抗加β-葡萄糖苷酶組；（3）HMFG1單抗組。準(zhǔn)備苦杏仁苷溶液，濃度分別為 1 mmol·l-1，5 mmol·l-1，10 mmol·l-1，15 mmol·l-1。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的EJ細(xì)胞接種于96孔板（1×105/孔），37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)12小時(shí)，待細(xì)胞貼壁后，分別加入以上3組藥物，終濃度為250 mmol·l-1，不加藥組作為陰性對(duì)照組，并以不加細(xì)胞只加培養(yǎng)基作為空白進(jìn)行調(diào)零。繼續(xù)培養(yǎng)2小時(shí)，然后用無(wú)血清RPM-1640培養(yǎng)基洗3次，再在3組中加入4個(gè)濃度的苦杏仁苷溶液，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。然后加入CCK-8 10 μl/孔，培養(yǎng)4小時(shí)，充分震蕩10分鐘，放入酶標(biāo)儀，在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔吸光度值（A）。計(jì)算IC50值同上，之后進(jìn)行比較。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

數(shù)據(jù)采用SPSS15.0軟件統(tǒng)計(jì)［5］，組間比較采用方差分析，IC50的計(jì)算用Probit分析，兩方法比較采用非參數(shù)兩相關(guān)樣本W(wǎng)licoxon統(tǒng)計(jì)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

由結(jié)果可以看出，采用不同方法，結(jié)果均顯示HMFG1-β-葡萄糖苷酶偶聯(lián)物組有較強(qiáng)的細(xì)胞抑制作用，對(duì)苦杏仁苷呈劑量依賴(lài)性。偶聯(lián)物組與其他各組間的吸光度值比較，有顯著性差異（P＜0.01）。在不同方法下，各組對(duì)EJ細(xì)胞的抑制率比較，無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。經(jīng)計(jì)算，藥物劑量曲線［6］顯示，MTT法IC50為2.12 mmol·l-1，WST-8法IC50為1.17 mmol·l-1，見(jiàn)表1～3。

3　討論

膀胱癌是國(guó)內(nèi)男性泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤中最常見(jiàn)的惡性腫瘤，據(jù)中國(guó)癌癥基金會(huì)腫瘤數(shù)據(jù)庫(kù)統(tǒng)計(jì)顯示，膀胱癌的發(fā)生約占所有惡性腫瘤的5%，并呈逐年上升趨勢(shì)。在膀胱癌中，90%以上為移行細(xì)胞癌，膀胱癌術(shù)后極易復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)率為80%，其中10%進(jìn)展為較高分級(jí)。為治療以及降低術(shù)后復(fù)發(fā)率，通常采用膀胱灌注藥物局部化療，但用化療藥物進(jìn)行膀胱灌注時(shí)也能被機(jī)體吸收，造成全身毒性反應(yīng)，且治療效果并不理想。這就需要研制出一種新的、特異性高的藥物，能夠在早期識(shí)別并靶向殺傷膀胱腫瘤細(xì)胞，降低術(shù)后復(fù)發(fā)率，且對(duì)正常組織細(xì)胞無(wú)毒性作用或毒性作用很小，減輕患者痛苦，提高其生存質(zhì)量［7］。

從天然產(chǎn)物中提取的苦杏仁苷本身毒性很低，但經(jīng)β-葡萄糖苷酶水解后能產(chǎn)生氰化物，且有極強(qiáng)的細(xì)胞毒性。正常細(xì)胞中存在硫氰酸酶，可將一部分氰化物轉(zhuǎn)化為無(wú)毒的硫氰酸鹽，而腫瘤細(xì)胞無(wú)硫氰酸酶，所以對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用更明顯［8］。HMFG1-β-葡萄糖苷酶偶聯(lián)物就是一種針對(duì)腫瘤細(xì)胞特異性高表達(dá)的MUC1黏蛋白，且符合（Antibody Directed Enzyme Prodrug Therapy，ADEPT）理念［9］的前體藥物。本實(shí)驗(yàn)采用MTT法與WST-8法測(cè)定不同濃度的苦杏仁苷與偶聯(lián)物聯(lián)合共同作用于膀胱癌EJ細(xì)胞24小時(shí)后的抑制率，結(jié)果顯示，1 mmol·l-1、5 mmol·l-1、10 mmol·l-1、15 mmol·l-1的苦杏仁苷溶液與HMFG1-β-葡萄糖苷酶偶聯(lián)物聯(lián)合共同作用后，表現(xiàn)出明顯的抑制效應(yīng)，與其他各組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），并且隨著苦杏仁苷濃度的加大而增加，呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性。MTT法IC50為2.12 mmol·l-1、WST-8法IC50為1.17 mmol·l-1，從而證明HMFG1-β-葡萄糖苷酶偶聯(lián)物聯(lián)合苦杏仁苷具有特異性殺傷EJ細(xì)胞活性的作用，提示HMFG1-β-葡萄糖苷酶偶聯(lián)物聯(lián)合苦杏仁苷可能是治療膀胱癌、進(jìn)行早期干預(yù)、降低復(fù)發(fā)率、進(jìn)行個(gè)體化治療、改善預(yù)后、控制術(shù)后轉(zhuǎn)移的有效策略，值得進(jìn)一步研究。

表1　MTT法不同組EJ細(xì)胞特異性殺滅活性吸光度值（±s）

表1　MTT法不同組EJ細(xì)胞特異性殺滅活性吸光度值（±s）

注：*與其他組比較，P＜0.01

苦杏仁苷濃度1 mmol·l-15 mmol·l-110 mmol·l-115 mmol·l-1單抗加酶組0.639±0.006 0.618±0.005 0.420±0.008 0.340±0.009陰性對(duì)照組0.678±0.008 0.678±0.008 0.678±0.008 0.678±0.008偶聯(lián)物組0.620±0.007*0.604±0.006*0.429±0.009*0.268±0.008*單抗組0.658±0.007 0.621±0.008 0.601±0.009 0.467±0.006

表2　WST-8法不同組EJ細(xì)胞特異性殺滅活性吸光度值（±s）

表2　WST-8法不同組EJ細(xì)胞特異性殺滅活性吸光度值（±s）

注：*與其他組比較，P＜0.01

單抗加酶組0.629±0.008 0.607±0.005 0.413±0.010 0.328±0.009苦杏仁苷濃度1 mmol·l-15 mmol·l-110 mmol·l-115 mmol·l-1陰性對(duì)照組0.667±0.008 0.667±0.008 0.667±0.008 0.667±0.008偶聯(lián)物組0.610±0.009*0.594±0.007*0.418±0.006*0.264±0.005*單抗組0.647±0.008 0.611±0.007 0.591±0.006 0.466±0.006

表3　MTT法與WST-8法不同組對(duì)EJ細(xì)胞的抑制率比較（%）

參考文獻(xiàn)：

［1］沈映君.中藥藥理學(xué)［M］.2版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2011.

［2］方蓉，李芳秋，武建國(guó)，等.MTT比色法的條件探討［J］.臨床檢驗(yàn)雜志，2003，21（1）：34-35.

［3］張卓然.實(shí)用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2001.

［4］葉蘭萍，徐華，茍海濤，等.重離子對(duì)人肝癌細(xì)胞凋亡及bcl-2/bax基因表達(dá)的研究［J］.蘭州大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2006，32（2）：1-3.

［5］胡志潔.SPSS 11.5軟件在正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)中的應(yīng)用［J］.醫(yī)學(xué)信息，2007， 20（5）：737-740.

［6］劉桂芬.醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)［M］.2版.北京：中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社，2007.

［7］Kaufman D S，Shiply W U，F(xiàn)eldman A S.Bladder cancer［J］.Lancet，2009，373（9686）：239-249.

［8］許寧俠.苦杏仁苷的研究進(jìn)展［J］.內(nèi)蒙古中醫(yī)藥，2012（9）：66-67.

［9］Schellmann N，Deckert P M，Bachran D，et al.Targeted enzyme prodrug therapies［J］.Mini-Rev in Medic Chem，2010，10（10）：887-904.

（*通訊作者：郭利君）■

中圖分類(lèi)號(hào)：G642.423

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

文章編號(hào)：1671-1246（2016）12-0146-02

基金項(xiàng)目：甘肅省科技廳自然基金項(xiàng)目（0710RJZA008）