劉廣文　丁勃

[摘要] 目的 對(duì)溴芬酸鈉滴眼液中所添加的抑菌劑抑菌效力進(jìn)行確認(rèn)。 方法 將金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌和黑曲霉作為挑戰(zhàn)菌株，分別加入到抑菌劑含量為處方濃度0、80%、100%和120%的4組溴芬酸鈉滴眼液中，在不同時(shí)間段檢測(cè)樣品中微生物的存活情況。 結(jié)果 不含抑菌劑的溴芬酸鈉滴眼液不具有充分的抗菌活性，抑菌劑含量為處方濃度80%、100%和120%的溴芬酸鈉滴眼液，均可有效抑制微生物的生長(zhǎng)繁殖。 結(jié)論 可選擇濃度為0.05mg/mL的苯扎氯銨，作為溴芬酸鈉滴眼液的抑菌劑。

[關(guān)鍵詞] 溴芬酸鈉滴眼液；抑菌劑；抑菌效力；苯扎氯銨

[中圖分類號(hào)] R927.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 2095-0616（2016）09-45-05

[Abstract] Objective To demonstrate the effectiveness of antimicrobial preservatives for Bromfenac Sodium Eye Drops. Methods Staphylococcus aureus，Escherichia coli，Pseudomonas aeruginosa，Candida albicans and aspergillus niger were used as challenging strains and added into four sets of Bromfenac Sodium Eye Drops with concentrations of Antimicrobial preservatives at 0，80%，100% and 120% respectively.Survival rates of microbes were then examined at different points in time. Results Bromine Finn acid sodium eye drops except for the Bacteriostatic agent sample were no antimicrobial preservatives.The Bromfenac Sodium Eye Drops with concentrations of Antimicrobial preservatives at 80%，100% and 120% could inhibit the growth of microorganisms sufficiently， Conclusion Benzalkonium chloride can be used as antimicrobial preservative for Bromfenac Sodium Eye Drops.

[Key words] Bromfenac Sodium Eye Drops；Antimicrobial preservatives；Antimicrobial effectiveness；Benzalkonium chloride

本品為滴眼液，主要活性成分為溴酚酸鈉，用于外眼部和前眼部的炎癥性疾病的對(duì)癥療法（結(jié)膜炎、鞏膜炎、術(shù)后炎癥）。[1]處方中含有的輔料為聚維酮K30、硼酸、硼砂、無水亞硫酸鈉、聚山梨酯80、依地酸二鈉和注射用水，氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值8.0～8.6，采用聚丙烯藥用滴眼劑瓶作為內(nèi)包裝。本品為非甾體抗炎藥，主藥不具有抗菌活性，溴酚酸鈉滴眼液為多劑量包裝，為防止正常貯藏和使用過程中潛在的微生物污染，應(yīng)添加適宜的抑菌劑，以避免藥物變質(zhì)對(duì)患者造成危害。[2]參照《中國(guó)藥典》2015年版通則和指導(dǎo)原則“1121抑菌效力檢查法” [2]，對(duì)本品進(jìn)行測(cè)定，評(píng)價(jià)最終產(chǎn)品的抑菌效力。

1 儀器與試藥

1.1 試藥

供試品批號(hào)：150201（未添加抑菌劑），150202（含處方量80%苯扎氯銨），150203（含處方量100%苯扎氯銨），150204（含處方量120%苯扎氯銨）；規(guī)格：5mL﹕4.5mg（按C15H12BrNO3計(jì)）；包裝：聚丙烯瓶；性狀：本品為黃色的澄明液體。

1.2 儀器

MJ-250I型霉菌培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司，儀器編號(hào)：WS-21-19）；GHP-9270型隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司，儀器編號(hào)：WS-21-15）；HFsafe-900生物安全柜（上海力康醫(yī)療設(shè)備有限公司，儀器編號(hào)：WS-76-10）；MLS-3780型濕熱滅菌器（日本三洋公司，儀器編號(hào)：WS-41-07）；VITEK 2 DensiCHEK型細(xì)菌濁儀（生物酶理埃，儀器編號(hào)：WS-96-02）。

1.3 菌種

銅綠假單胞菌[CMCC（B）10 104]、大腸埃希菌[CMCC（B）44 102]、金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26 003]、白色念珠菌[CMCC（F）98 001]、黑曲霉 [CMCC（F）98 003]，均來自中國(guó)食品藥品檢定研究院醫(yī)學(xué)菌種保藏中心。

1.4 培養(yǎng)基

胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：3103091）；胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（批號(hào)3302011）；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)3102306）；沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（批號(hào)3102387），購(gòu)于環(huán)凱微生物科技有限公司，培養(yǎng)基適用性檢查符合規(guī)定。

2 菌液制備方法

接種銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌新鮮培養(yǎng)物至胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，30～35℃，培養(yǎng)18～24h；接種白色念珠菌新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，20～25℃，培養(yǎng)24～48h。將上述培養(yǎng)物用適量的0.9%無菌氯化鈉溶液自瓊脂表面洗脫，無菌操作轉(zhuǎn)移至無菌試管內(nèi)，比濁法制成濃度為108cfu/mL的菌懸液。接種黑曲霉新鮮培養(yǎng)物，至沙氏葡萄糖瓊脂斜面，20～25℃，培養(yǎng)5～7d，至培養(yǎng)基斜面產(chǎn)生豐富的孢子，加入含0.05%聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫，用含0.05%聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，制成濃度為108cfu/mL的孢子懸液。

3 存活菌數(shù)測(cè)定方法適用性試驗(yàn)

抑菌效力檢查實(shí)驗(yàn)過程中，需要在規(guī)定的間隔時(shí)間從每個(gè)容器取供試品1mL，測(cè)定每份供試品中所含的菌數(shù)。存活微生物測(cè)定方法及適用性試驗(yàn)照非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計(jì)數(shù)法（通則1105）進(jìn)行。本次實(shí)驗(yàn)涉及4類供試品：未添加抑菌劑的供試品、含處方量80%苯扎氯銨的供試品、含處方量100%苯扎氯銨的供試品和含處方量120%苯扎氯銨的供試品。采用5種試驗(yàn)菌，分別對(duì)4類供試品進(jìn)行計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)。

試驗(yàn)結(jié)果表明，抑菌劑含量不同的4類供試品，對(duì)白色念珠菌、黑曲霉和金黃色葡萄球菌有一定抑制作用，試驗(yàn)菌回收率達(dá)不到70%，需采用薄膜過濾法進(jìn)行細(xì)菌和真菌計(jì)數(shù)；4類供試品的1∶10稀釋液對(duì)5種試驗(yàn)菌均沒有抑制作用，因此，1∶10稀釋級(jí)及更高稀釋級(jí)的供試液均可采用平皿法進(jìn)行細(xì)菌和真菌計(jì)數(shù)

4 未添加抑菌劑供試品抑菌效力測(cè)定

測(cè)定未添加抑菌劑供試品的抑菌效力，考察其對(duì)微生物的殺滅或抑制能力，評(píng)價(jià)本品是否具有充分的抗菌活性。

本品規(guī)格為5mL，按抑菌效力檢查法規(guī)定，接種菌液的體積應(yīng)不超過0.05mL，實(shí)驗(yàn)誤差較大；整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程，需對(duì)供試品多次取樣，原包裝供試品體積無法滿足實(shí)驗(yàn)需要。因此，將供試品轉(zhuǎn)移至與本品內(nèi)包裝材質(zhì)相同，每瓶轉(zhuǎn)入供試品50mL。

取轉(zhuǎn)移包裝后的供試品5瓶，分別接種0.5mL銅綠假單孢菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌和黑曲霉孢子懸液，接種后，供試液染菌量為105～106cfu/mL，混勻，模20～25℃避光貯存。試驗(yàn)過程中，分別在6h、24h、7d和28d對(duì)供試品進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)；分別在7、14和28d對(duì)供試品進(jìn)行真菌計(jì)數(shù)。同時(shí)以0.9%無菌氯化鈉溶液接種試驗(yàn)菌作為對(duì)照，按上述方法平行操作。見表1～6。

未添加抑菌劑的供試品，6h計(jì)數(shù)，銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌減少的lg值均小于2；24h計(jì)數(shù)，金黃色葡萄球菌減少的lg值小于1，銅綠假單胞菌和大腸埃希菌減少的lg值均小于3。因此，按抑菌效力判斷標(biāo)準(zhǔn)“A”和“B”，未添加抑菌劑的供試品均不符合規(guī)定。未添加抑菌劑的供試品7d計(jì)數(shù)，白色念珠菌和黑曲霉減少的lg值均大于2；28d計(jì)數(shù)，白色念珠菌和黑曲霉未恢復(fù)生長(zhǎng)，符合抑菌效力判斷標(biāo)準(zhǔn)“A”。未按“B”標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定在第14d，對(duì)供試品中真菌進(jìn)行計(jì)數(shù)。0.9%的無菌氯化鈉溶液對(duì)照組，各試驗(yàn)菌在6h、24h、7d和28d未表現(xiàn)出異常的增多或降低。試驗(yàn)結(jié)果表明，溴芬酸鈉滴眼液本身不具有充分的抗菌效力，應(yīng)加入抑菌劑。

5 添加抑菌劑供試品的抑菌效力測(cè)定

本品以苯扎氯銨做為抑菌劑，處方含量為0.05mg/mL，參考苯扎氯銨安全用量相關(guān)文獻(xiàn)，本品中用量在常規(guī)安全用量范圍內(nèi)。本品主要成分包括溴芬酸鈉、聚維酮K30、硼酸、硼砂、無水亞硫酸鈉、聚山梨酯80、依地酸二鈉，本品采用聚丙烯瓶包裝，參考藥用輔料手冊(cè)，本品成分、包裝與苯扎氯銨均無配伍禁忌[3]。

雖然苯扎氯銨是滴眼液中最常用的防腐劑，但大量臨床及實(shí)驗(yàn)研究表明，使用含苯扎氯銨的滴眼液會(huì)引起包括細(xì)胞凋亡在內(nèi)的一系列眼表?yè)p傷。[4-5]因此，含有苯扎氯銨的供試品可能會(huì)增加臨床不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)，且隨濃度的增加，不良反應(yīng)發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)也將提高[6]。按照中國(guó)藥典抑菌效力檢查法中所述：表中“A”是指應(yīng)達(dá)到的抑菌效力標(biāo)準(zhǔn)，特殊情況下，如抑菌劑可能增加不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)，那至少應(yīng)達(dá)到“B”的抑菌效力標(biāo)準(zhǔn)。本產(chǎn)品所添加的抑菌劑符合該條件，因此，對(duì)本品含處方量100%抑菌劑供試品進(jìn)行抑菌效力測(cè)定，如果結(jié)果判定不能達(dá)到“A”標(biāo)準(zhǔn)，可以按照“B”標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。

5.1 含處方量100%苯扎氯銨的供試品抑菌效力檢查試驗(yàn)

將供試品轉(zhuǎn)移至與本品內(nèi)包裝材質(zhì)相同，裝量為50mL的聚丙烯瓶中，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每瓶轉(zhuǎn)入供試品50mL。取轉(zhuǎn)移包裝后的供試品5瓶，分別接種0.5mL銅綠假單孢菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌和黑曲霉孢子懸液，使接種后供試液染菌量每1毫升約為105～106cfu，混勻，20～25℃避光貯存。試驗(yàn)過程中，分別在6h、24h、7d和28d對(duì)供試品進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)；分別在7、14和28d對(duì)供試品進(jìn)行真菌計(jì)數(shù)。本次試驗(yàn)與未添加抑菌劑供試品的抑菌效力測(cè)定同時(shí)進(jìn)行，見表7～9。

5.2 含處方量80%和120%苯扎氯銨的供試品抑菌效力檢查試驗(yàn)

對(duì)處方含量80%和120%苯扎氯銨的供試品抑菌效力進(jìn)行測(cè)試，考察生產(chǎn)過程中的投料偏差對(duì)產(chǎn)品的抑菌效力產(chǎn)生的影響。按“8.1含處方量100%苯扎氯銨的供試品抑菌效力檢查試驗(yàn)”試驗(yàn)方法進(jìn)行操作。見表10～13。

按抑菌效力檢查法注射劑和眼用制劑抑菌效力判斷標(biāo)準(zhǔn)，細(xì)菌計(jì)數(shù)按“B”標(biāo)準(zhǔn)判斷，各試驗(yàn)菌24h減少的lg值均大于1，7d減少的lg值均大于3，28天為NI；真菌計(jì)數(shù)按“A”標(biāo)準(zhǔn)判斷，各試驗(yàn)菌7d減少的lg值均大于2，28d為NI。含處方量80%苯扎氯銨的供試品和含處方量120%苯扎氯銨的供試品抑菌效力檢查結(jié)果均符合規(guī)定。

6 討論

按《中國(guó)藥典》2015年版通則和指導(dǎo)原則：1121抑菌效力檢查法，溴芬酸鈉滴眼劑以苯扎氯銨作為抑菌劑，處方含量為0.05mg/mL，抑菌效力檢查結(jié)果符合規(guī)定；含處方量80%苯扎氯銨的溴芬酸鈉滴眼液和含處方量120%苯扎氯銨的供試品溴芬酸鈉滴眼液抑菌效力檢查結(jié)果均符合規(guī)定。

藥物生產(chǎn)過程中，添加抑菌劑允許偏差為±20%[8]。因此，在藥物研發(fā)階段，應(yīng)對(duì)抑菌劑處方濃度80%的劑量和120%的劑量，進(jìn)行有效性確認(rèn)，以保證投料的偏差不會(huì)對(duì)抑菌劑抗菌活性的有效性造成影響。

新版中國(guó)藥典抑菌效力檢查法對(duì)比原抑菌效力檢查法指導(dǎo)原則，在操作方法、結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)上均有較大調(diào)整，例如取消了“供試品接種（0時(shí)）” [8]的概念，增加了“A”“B”判斷標(biāo)準(zhǔn)，增加了 “NI”“NR”結(jié)果表示方法等，新版標(biāo)準(zhǔn)對(duì)產(chǎn)品的抑菌效力檢測(cè)更加科學(xué)合理，基苯和國(guó)外先進(jìn)藥典保持一致。本文以溴芬酸鈉滴眼劑抑菌效力研究為例，對(duì)新版藥典抑菌效力檢查法進(jìn)行了探索，結(jié)合試驗(yàn)操作對(duì)新增的名詞、定義進(jìn)行了解釋。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 趙文鏡，夏炎.溴芬酸鈉滴眼液的制備及含量測(cè)定[J].西北藥學(xué)雜志，2011，2（26）：10-12.

[2] 國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典[M].2015年版，通則和指導(dǎo)原則：1121抑菌效力檢查法，2015：151-153.

[3] RC羅，PJ舍斯基，PJ韋勒.藥用輔料手冊(cè)[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：367-373.

[4] 黃彩虹，陳文生，陳永雄，等.苯扎氯銨的眼表毒性研究現(xiàn)狀[J].中華眼科雜志，2014，50（4）：303-305.

[5] 劉揚(yáng)，劉祖國(guó)，許傳超，等.苯扎氯銨對(duì)人結(jié)膜上皮細(xì)胞毒性的研究[J].中國(guó)實(shí)用眼科雜志，2008，26（6）：631-634.

[6] 成海平.藥品研發(fā)中防腐劑的應(yīng)用及質(zhì)控[J].中國(guó)新藥雜志，2005，8（14）：954-956.

[7] 丁勃，徐曉潔，謝元超.氫溴酸加蘭他敏口服液添加抑菌劑篩選與抑菌效力研究[J].藥物分析雜志，2011，31（12）：2312-2317.

[8] 寧黎麗.眼用制劑研發(fā)過程中應(yīng)關(guān)注抑菌劑的合理使用和質(zhì)量控制[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，2007（23）：1836-1838.

[9] 國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典[M].2010年版二部附錄.2010：215-216.

[10] 張乃茹，李曉莉.食品防腐劑山梨酸的研究進(jìn)展[J].長(zhǎng)春師院學(xué)報(bào)，1995（5）：16-19.

[11] 沈萍，衛(wèi)揚(yáng)保，王靜怡，等.微生物學(xué)[M].北京：高等教育出版社，2000：197.

[12] 丁勃，鞏麗萍，謝元超.阿齊霉素滴眼液抑菌劑篩選與抑菌效力研究[J].中國(guó)藥品標(biāo)準(zhǔn)，2012，13（4）：281-284.

[13] 曹軍衛(wèi)，馬輝文，張甲耀.微生物工程[M].北京：科學(xué)出版社，2010：82.

[14] 胡春紅，陳龍，李季平，等.苯甲酸鈉和山梨酸鉀的復(fù)配抑菌效果研究[J].中國(guó)調(diào)味品，2012，3（37）：46-49.

[15] 張新妹，胡昌勤，李艷，等.一般用途的抗生素滴眼劑的微生物限度檢查方法[J].天津藥學(xué)，2003，15（3）：16-19.

（收稿日期：2016-01-12）