石小兵++楊航++趙致

摘要：以三葉木通種子為外植體誘導(dǎo)產(chǎn)生叢生芽，再用不同濃度的秋水仙素溶液對(duì)叢生芽進(jìn)行不同時(shí)間的誘導(dǎo)，并用染色體計(jì)數(shù)法檢測(cè)材料倍性。結(jié)果表明，叢生芽誘導(dǎo)的較好方式為消毒好的種子沿其背腹線縱切成半后接種于MS+1.0 mg/L 6-BA的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)出無菌苗，然后將無菌苗接種于MS+2.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA的繼代增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)。0.3%的秋水仙素處理24 h效果最好，多倍體誘導(dǎo)率達(dá)12%。

關(guān)鍵詞：三葉木通；組織培養(yǎng)；叢生芽；多倍體

中圖分類號(hào)： S567.904文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2016）05-0069-03

三葉木通[Akebia trifoliate （Thunb.） Koidz.]為木通科木通屬藤本植物，全株均可入藥，具有通經(jīng)下乳、清熱利尿等功效，主要分布于甘肅、貴州、河北、河南、山東等地[1]。三葉木通果實(shí)具有發(fā)達(dá)的胎座組織，味甜可口，具有獨(dú)特的風(fēng)味，含有許多人體必需營養(yǎng)成分[2-3]，是一種具有開發(fā)潛力的保健水果，但存在果皮厚、種子多、可食率低的問題。多倍體植株具有生物產(chǎn)量增加、藥用活性成分增加、抗逆性增強(qiáng)、植株育性下降、少籽或無籽等特點(diǎn)，多倍體育種可成為三葉木通遺傳改良的途徑之一。植物離體誘導(dǎo)多倍體的方法已成功地在許多植物中取得成功，其中建立組培快繁體系是其必要環(huán)節(jié)。本試驗(yàn)旨在以三葉木通幼嫩種子為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)獲得叢生芽，再用秋水仙素對(duì)叢生芽進(jìn)行處理，以獲得三葉木通多倍體材料，為無籽三葉木通的研究奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

三葉木通果實(shí)采自貴州省貴陽市花溪區(qū)棉花關(guān)，植株經(jīng)貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院趙財(cái)副教授鑒定為木通科木通屬植物三葉木通。

1.2方法

1.2.1外植體處理2014年8月中旬摘取三葉木通幼嫩果實(shí)，毛刷刷去表面塵土→洗潔精浸泡7 min→自來水沖洗20 min→超凈工作臺(tái)中取出種子→無菌水清洗種子數(shù)次→濾紙吸干表面水分→75%乙醇消毒15 s→0.1% HgCl2浸泡7 min→無菌水沖洗3次。將消毒好的種子橫切成半、沿背腹線縱切成半，以不切作對(duì)照處理，然后分別接種到MS培養(yǎng)基（添加蔗糖30 g/L、瓊脂7 g/L，pH值5.8～6.0，下同）中。每個(gè)處理接種20個(gè)培養(yǎng)瓶，每瓶4粒種子。（25±2） ℃黑暗培養(yǎng)40 d，統(tǒng)計(jì)出苗情況。

1.2.2無菌苗誘導(dǎo)培養(yǎng)采用合適的切種方式，將消毒好的種子接種在含6-BA不同濃度（0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L）的MS培養(yǎng)基中進(jìn)行無菌苗誘導(dǎo)，每個(gè)處理接種10個(gè)培養(yǎng)瓶，每瓶放5粒種子。（25±2） ℃黑暗培養(yǎng)30 d后，統(tǒng)計(jì)6-BA不同濃度處理下出苗率（出苗率=萌發(fā)外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100%）。

1.2.3繼代增殖培養(yǎng)以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，設(shè)置不同激素組合的處理，共8種培養(yǎng)基（見表1中A1～A8號(hào)培養(yǎng)基）。將無菌苗接種于這些培養(yǎng)基中，每種培養(yǎng)基接種10瓶，每瓶3個(gè)外植體。（25±2） ℃光照培養(yǎng)（光照時(shí)間 12 h/d，光照度1 000 lx）45 d統(tǒng)計(jì)增殖系數(shù)。

表1繼代增殖培養(yǎng)基

編號(hào)培養(yǎng)基A1MS+0 mg/L 6-BA+0.0 mg/L NAA A2MS+0.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA A3MS+1.0 mg/L 6-BA+0.0 mg/L NAA A4MS+1.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA A5MS+2.0 mg/L 6-BA+0.0 mg/L NAA A6MS+2.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA A7MS+3.0 mg/L 6-BA+0.0 mg/L NAA A8MS+3.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA

1.2.4多倍體誘導(dǎo)將生長良好的幼嫩叢生芽接入抽濾滅菌的秋水仙素溶液中，搖床振蕩培養(yǎng)。試驗(yàn)采用2因素3水平L9（32）正交試驗(yàn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表2。搖床轉(zhuǎn)速設(shè)定為50 r/min，培養(yǎng)溫度設(shè)定為24 ℃，光照24 h/d，光照強(qiáng)度為1 000 lx。處理完畢后轉(zhuǎn)接于MS+2.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件同上。

1.2.5多倍體鑒定取出小叢生芽塊，放入卡諾氏固定液（無水乙醇 ∶冰乙酸體積比 3 ∶1）中，0 ℃固定1周后，將小叢生芽塊取出放到載破片上，用鑷子搗碎小叢生芽塊，用改良

`寶品紅染色液染色1～2 min，蓋上蓋破片后在光學(xué)顯微鏡下觀察，拍照。根據(jù)染色體數(shù)確定加倍處理材料的倍性。

2結(jié)果與分析

2.1切種方式對(duì)種子出苗的影響

從表3可知，沿背腹線縱切成半的種子出苗率最高（325%），橫切成半的次之，不切半的種子出苗率最低（75%）；縱切成半的種子平均出苗天數(shù)最短（15 d），不切半的種子平均出苗天數(shù)最長（35 d）。表明縱切種子能加快種子出苗，其原因可能是縱切處理使種子的胚暴露于培養(yǎng)基中，胚無種皮限制而得以直接從培養(yǎng)基中吸收養(yǎng)分而快速生長；橫切可能破壞了胚的完整性或沒有使胚完全暴露于培養(yǎng)基中而對(duì)種子出苗沒有太大影響。

2.26-BA濃度對(duì)種子出苗的影響

消毒好的種子沿背腹線縱切成半，接種于培養(yǎng)基中，培養(yǎng)15 d左右種子便開始萌發(fā)，繼續(xù)培養(yǎng)15 d后無菌苗高度可達(dá)2 cm左右（圖1）。由表4可知，MS培養(yǎng)基添加6-BA后能提高種子出苗率。隨著6-BA濃度升高，種子出苗率呈先升高后下降的趨勢(shì)。當(dāng)6-BA濃度為1.0 mg/L時(shí)出苗率最高，為60%。

2.3繼代增殖培養(yǎng)基篩選

由表5可知，當(dāng)培養(yǎng)基中不添加6-BA時(shí)，NAA處理的無菌苗增殖系數(shù)均為1；當(dāng)6-BA濃度一定時(shí)，添加 0.3 mg/L NAA與不添加NAA的相比，無菌苗增殖系數(shù)均有所提高；當(dāng)NAA濃度一定，隨著6-BA濃度升高，無菌苗增殖系數(shù)先上升后下降，當(dāng)6-BA濃度為2.0 mg/L時(shí)無菌苗增殖系數(shù)最高（5.70）。無菌苗轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時(shí)間后其基部可分化出白色的不定芽（圖2）；對(duì)不定芽繼代增殖后，能得到數(shù)目眾多的叢生芽，這些叢生芽具有分化成完整植株的能力。

2.4秋水仙素對(duì)叢生芽多倍體誘導(dǎo)的影響

秋水仙素濃度越低，叢生芽死亡率也越低（表6）。0.1%的秋水仙素處理下的叢生芽死亡率低，0.5%的秋水仙素處理過的叢生芽死亡率最高。0.1%的秋水仙素處理的叢生芽雖然有較低的死亡率，但并未得到加倍的叢生芽；0.5%的秋水仙素處理過的叢生芽得到了2塊加倍的叢生芽；0.3%的秋水仙素處理叢生芽后得到加倍的叢生芽塊數(shù)最多，其中以處理24 h的效果較好，誘導(dǎo)率為12%。同一濃度的秋水仙素在不同時(shí)間處理下多倍體誘導(dǎo)率并未呈現(xiàn)常見的先上升后下降趨勢(shì)，其原因可能是高濃度的秋水仙素對(duì)叢生芽的傷害大，使得存活下來的叢生芽數(shù)減少，并且生活力下降，從而使檢測(cè)到加倍的叢生芽塊數(shù)相應(yīng)很少。

2.5多倍體鑒定

對(duì)三葉木通正常的根尖和叢生芽進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)，得出正常的三葉木通染色體數(shù)2n=2x=16，為二倍體（圖3），這與熊大勝等得出的結(jié)果[4]一致。成功加倍成多倍體的叢生芽染色體數(shù)為2n=4x=32，為四倍體（圖4）。這說明用秋水仙素誘導(dǎo)三葉木通獲得多倍體的方法是有效的。

3結(jié)論與討論

沈國林等以三葉木通葉片、莖段為外植體進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)，但污染率高[5]。本試驗(yàn)選用三葉木通幼嫩種子為外植體，建立三葉木通組織培養(yǎng)體系。選用幼嫩種子為外植體具有材料多（1個(gè)果實(shí)約有種子150～200粒）、污染率低（幼嫩種子在果實(shí)里處于一種相對(duì)無菌的環(huán)境）等優(yōu)勢(shì)。

繼代增殖培養(yǎng)是組織培養(yǎng)的關(guān)鍵，篩選合適的增殖培養(yǎng)基才能達(dá)到離體快繁目的[6]。在無菌苗的繼代增殖過程中，6-BA和NAA組合是常用的激素組合[7-8]。在三葉木通無菌苗繼代增殖培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)使用NAA不能使無菌苗增殖，單獨(dú)使用6-BA可以使無菌苗增殖，附加NAA后增殖系數(shù)提高，表明6-BA在三葉木通繼代增殖培養(yǎng)中起主導(dǎo)作用。

叢生芽結(jié)構(gòu)完整、材料幼嫩，可直接形成小植株，而且成苗率高，經(jīng)化學(xué)誘變劑誘導(dǎo)處理后，易于獲得純的多倍體植株，所以本試驗(yàn)采用了叢生芽作為誘導(dǎo)材料。秋水仙素是常用的化學(xué)誘變劑，通過抑制紡錘體微管的形成而導(dǎo)致染色體不能移向細(xì)胞兩極從而產(chǎn)生多倍體。秋水仙素對(duì)不同的植物和植物不同部位的誘導(dǎo)所需要的濃度和處理時(shí)間不同。三葉木通為木質(zhì)藤本，對(duì)秋水仙素處理的濃度要求較高，在本試驗(yàn)中體現(xiàn)在0.1%的秋水仙素處理叢生芽24、48、72 h均未檢測(cè)到多倍體細(xì)胞。雖然較高濃度秋水仙素處理過的叢生芽存活率小，但憑借其快速增殖的優(yōu)勢(shì)，能獲得大量的加倍的叢生芽。

三葉木通多倍體的研究國內(nèi)僅見熊大勝等用秋水仙素處理種子和幼苗的報(bào)道[9-10]。熊大勝等對(duì)加倍誘導(dǎo)的材料只進(jìn)行了生理學(xué)和形態(tài)學(xué)鑒定。目前流式細(xì)胞儀能用于鑒定植株的倍性[11-12]，使得常規(guī)誘導(dǎo)多倍體方法有了可靠的鑒定方法。但組培技術(shù)和化學(xué)誘導(dǎo)相結(jié)合的離體培養(yǎng)誘導(dǎo)法已成為一種最常用的染色體加倍方法。離體培養(yǎng)誘導(dǎo)法與常規(guī)的誘變育種方法相比，具有明顯的優(yōu)越性。首先在組織培養(yǎng)條件下可以反復(fù)大批量地在培養(yǎng)瓶中處理植物愈傷組織、叢生芽，提高多倍體誘導(dǎo)的成功率；其次由于組織培養(yǎng)技術(shù)不受節(jié)氣等自然調(diào)節(jié)的影響，可以大大縮短誘導(dǎo)時(shí)間，并在短期內(nèi)快速鑒定出大批量株系，繁殖大量試管苗。本試驗(yàn)從種子無菌材料的獲得、無菌苗的誘導(dǎo)、繼代增殖培養(yǎng)及叢生芽多倍體誘導(dǎo)過程中建立了三葉木通無菌苗的組織培養(yǎng)體系，進(jìn)行了三葉木通多倍體誘導(dǎo)和鑒定研究，可為三葉木通多倍體育種奠定基礎(chǔ)。

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