趙志常++張波++高愛平

摘要：花色素苷的合成是紅色芒果果實著色的主要代謝途徑，類黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶（UFGT）是花色素苷合成的最后一個酶，它可以將不穩(wěn)定的花色素催化成花色素苷。根據(jù)已經(jīng)報道的UFGT基因的序列設(shè)計兼并引物，采用3′RACE、5′RACE方法，克隆得到芒果果實UFGT基因的全長cDNA序列。該基因開放閱讀框為1 392 bp，編碼463個氨基酸，分子量為51.15 ku。對基因組擴增得到2 770 bp長度的片段分析發(fā)現(xiàn)，該基因含有2個內(nèi)含子，分別在501～1 095 bp、1 548～2 330 bp。通過系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)，該基因編碼的蛋白與荔枝、山竹子等熱帶果樹具有較近的親緣關(guān)系。對不同芒果品種的UFGT基因表達(dá)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，紅色的芒果品種中表達(dá)量較高，黃色的芒果品種中表達(dá)量較低。

關(guān)鍵詞：芒果；花色素苷；UFGT基因；基因克隆

中圖分類號： S667.701；Q785文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2016）05-0031-03

芒果（Mangifera indica）是重要的熱帶、亞熱帶果樹，其果實顏色多樣[1]。芒果果實富含類胡蘿卜素、花色素苷等物質(zhì)，其中花色素苷合成途徑是紅色芒果果實著色的主要代謝途徑。類黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶（UFGT）是花色素苷合成的最后一個酶，可以將不穩(wěn)定的花色素催化成花色素苷。盧其能等[1]、劉海峰等[2]分別從紅巴梨果皮、馬鈴薯以及山葡萄中克隆了UFGT 基因，并且作了表達(dá)分析，到目前為止，山竹子（Garcinia mangostana）、草莓（Fragaria×ananassa）、西洋梨（Pyrus communis）、葡萄柚（Citrus×paradisi）、荔枝（Litchi chinensis Sonn.）等果樹中的UFGT基因得到了克隆[3-6]。UFGT是花色素苷合成的關(guān)鍵基因。Ju等發(fā)現(xiàn)，蘋果果實發(fā)育過程中，UFGT只在果實接近成熟的轉(zhuǎn)色期表達(dá)，表達(dá)的強度與花色素苷合成呈正相關(guān)[7]。Boss等對白皮葡萄、黑皮葡萄的不同組織進(jìn)行表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，UFGT基因只在有色的葡萄果皮中表達(dá)[4]。本研究采用RACE方法從芒果的果實中克隆得到了一個UFGT基因，探討該基因在芒果果實花色素苷合成的作用機制及其對果實著色的影響，深入揭示該基因在芒果果實花色素苷生物合成的分子機制，旨在為芒果果實著色提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

以貴妃芒果的果實（取自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所的農(nóng)業(yè)部芒果種質(zhì)資源圃）為試材。大腸桿菌DH5а為本實驗室保存，引物合成自英駿生物技術(shù)有限公司，DEPC、IPTG、Tryptone、Yeast extract、Amp、X-GaL、pMD-19T載體、Taq DNA 聚合酶、dNTP、T4 DNA連接酶、各種限制性內(nèi)切酶均購于大連寶生物公司。

1.2方法

參照王家保等所述的方法[5]提取芒果DNA，用無菌的雙蒸水溶解，采用核酸蛋白測定儀進(jìn)行測定，-20 ℃保存?zhèn)溆?。采用天根總RNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]提取芒果總RNA，用RNase-free無菌水溶解，用大連寶生物公司的DNase試劑盒進(jìn)行DNA去除，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性和DNA是否去除干凈，并用核酸蛋白測定儀對所得RNA的D260 nm/D230 nm、D260 nm/D280 nm及濃度進(jìn)行測定，用TaKaRa公司的3′和5′-RACE 試劑盒進(jìn)行目的基因的3′、5′轉(zhuǎn)錄。PCR反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃變性50 s，50 ℃復(fù)性50 s，72 ℃延伸2 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸7 min；反應(yīng)體系為25 μL，其中含10×PCR buffer （含Mg2+） 2.5 μL、25 ng/μL DNA模板2.0 μL、20 μmol引物各1.0 μL、2.5 U/μL Taq DNA聚合酶0.4 μL、5.0 mmol/L dNTPs 2.0 μL；反應(yīng)體系在eppendor PCR儀上擴增，擴增反應(yīng)結(jié)束后取10 μL進(jìn)行擴增產(chǎn)物的電泳，采用gelred染色后在紫外凝膠成像儀上觀察、拍照分析。

1.3UFGT基因全長cDNA和基因組DNA序列的獲得

以貴妃芒果的果實總RNA作為模板，采用SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit （Clontech）反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，并參照該試劑盒的說明書進(jìn)行cDNA 3′ 端和5′末端cDNA的擴增。根據(jù)cDNA片段的測序結(jié)果，分別設(shè)計2條上游引物，以接頭為錨定引物進(jìn)行半巢式PCR反應(yīng)。將3′ 端和5′末端的PCR反應(yīng)產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，確定所得到的片段大小是否與預(yù)測的片段大小一致。目的基因片段回收、連接、轉(zhuǎn)化、鑒定及測序，并根據(jù)已知的片段和得到的cDNA 3′ 端和5′末端的序列結(jié)果拼接該基因的全長 cDNA。以上述cDNA和提取的基因組DNA為模板，設(shè)計特異引物，進(jìn)行全長cDNA和基因組DNA序列擴增反應(yīng)，PCR反應(yīng)體系25 μL，從中取6 μL PCR產(chǎn)物加入0.2 mL PCR管中，加入1 μL 6×Loading Buffer，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增的片段大小是否正確。確定PCR產(chǎn)物中含有所需大小的目的片段一致后，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行普通瓊脂糖凝膠電泳，用手術(shù)刀在紫外燈下切下含有目的片段膠塊，再用DNA凝膠回收試劑盒（Agarose Gel DNA Purification Kit，TaKaRa公司）進(jìn)行目的片段回收，參照試劑盒說明書上的步驟進(jìn)行回收。取5 μL回收純化后的目的DNA產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖電泳檢測，以檢驗回收效果及大致含量，根據(jù)回收產(chǎn)物片段大小及其有效濃度，取適量回收純化的產(chǎn)物與克隆載體pMD19-T（TaKaRa公司）連接，目的DNA與克隆載體的摩爾比控制在3 ∶1左右。反應(yīng)混合液包括1 μL pMD19-T vector、4 μL 純化后的DNA、5 μL Ligation solution Ⅰ，混合均勻后在16 ℃ 下恒溫水浴過夜連接。

1.4UFGT基因氨基酸序列的結(jié)構(gòu)特征和分子進(jìn)化的分析

將所擴增得到的全長序列進(jìn)行NCBI序列比對，確定該基因是否為UFGT基因，并進(jìn)行其他物種UFGT基因的比對，采用DNAMAN軟件分析基因核苷酸和氨基酸的結(jié)構(gòu)特征和同源性，分析該基因所推定氨基酸序列，進(jìn)行多序列比較并構(gòu)建系統(tǒng)樹。

1.5表達(dá)分析

分別提取不同芒果品種的RNA，反轉(zhuǎn)為cDNA 并采用Primer 5.0設(shè)計引物進(jìn)行RT-PCR擴增。RT-PCR分析采用內(nèi)參引物actin-F：5′-AATGGAACTGGAATGGTCAAGGC-3′和actin-R：5′- TGCCAGATCTTCTCCATGTCATCCCA-3′。目的基因擴增采用引物UFGT-F：5′-CAGCATAGCCCATATAGCACTC-3′和UFGT-R：5′-CAATGGAGCCGATATAAAACTAT-3′，PCR 產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，采用Quantity One 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，作出相對表達(dá)量。

2結(jié)果與分析

2.1UFGT基因的獲得

根據(jù)得到的3′端、5′端序列信息進(jìn)行拼接，最后得到UFGT基因的全長cDNA序列。設(shè)計特異引物進(jìn)行全長cDNA和基因組DNA序列擴增，電泳結(jié)果如圖1所示。將電泳條帶回收測序后得到的UFGT基因的cDNA全長序列為1 573 bp，分析發(fā)現(xiàn)開放閱讀框為 1 392 bp，編碼463個氨基酸序列（圖2）。通過NCBI上已經(jīng)登錄的蘋果、草莓、荔枝的UFGT蛋白序列進(jìn)行比對（圖3），發(fā)現(xiàn)克隆的基因為UFGT基因。對基因組DNA擴增得到約2 770 bp的片段，通過與cDNA序列比對發(fā)現(xiàn)，該基因含有2個內(nèi)含子，分別位于501～1 095 bp、1 548～2 330 bp之間（圖4）。

2.2芒果UFGT基因的部分生物信息學(xué)分析

采用DNAMAN進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測，發(fā)現(xiàn)芒果UFGT基因蛋白的二級結(jié)果主要以無規(guī)則卷曲和β-折疊為主，也具有少量的α-螺旋結(jié)構(gòu)（圖5）。采用bioedit軟件的Kyte 和Doolittle 算法對UFGT蛋白的親水/疏水性（正值表示疏水性，負(fù)值表示親水性）進(jìn)行分析，UFGT蛋白所含的氨基酸主要介于+1.3～-3之間（圖6），采用DNAMAN軟件分析發(fā)現(xiàn)，芒果UFGT蛋白與荔枝、山竹子等熱帶果樹的蛋白序列聚為一類。草莓、蘋果、桃、西洋梨、櫻桃等溫帶果樹可以聚為一類（圖7）。

2.3UFGT基因的RT-PCR分析

分別提取不同著色程度的芒果果皮RNA，反轉(zhuǎn)錄為 cDNA，通過上述RT-PCR分析的引物進(jìn)行擴增，對擴增結(jié)果進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)：該基因在紅色果皮的貴妃的果實中表達(dá)較多，綠色果皮中次之，黃皮果皮中相對表達(dá)較少（圖8），初步推斷UFGT基因可能與紅色果實的花色素苷合成有密切關(guān)系，而黃皮的芒果品種可能與類胡蘿卜素合成有密切關(guān)系。

3結(jié)論與討論

本研究成功從芒果果實中分離得到了1個全長UFGT基因，該基因的cDNA的開放閱讀框為1 392 bp，編碼463個氨基酸，對基因組分析發(fā)現(xiàn)，該基因含有2個內(nèi)含子，荔枝的UFGT基因含有1個內(nèi)含子。通過在線軟件對cDNA和蛋白序列分析證實了該序列是植物UFGT基因的一員，也發(fā)現(xiàn)其所推導(dǎo)的氨基酸序列含有UDPGT、COG1819、MGT等保守結(jié)構(gòu)域[8]。芒果UFGT基因與所選其他物種UFGT基因序列相比較發(fā)現(xiàn)，無論在全長cDNA序列上還是其編碼氨基酸序列上都具有較高的保守結(jié)構(gòu)域。同時，通過與其他部分物種的氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹發(fā)現(xiàn)，芒果UFGT基因編碼的蛋白與荔枝、山竹子等熱帶果樹可以聚為一類，草莓、蘋果、桃、西洋梨、櫻桃等溫帶果樹可以聚為一類。付海輝等采用MEGA 4.1軟件對部分植物的UFGT基因分析發(fā)現(xiàn)，草莓、葡萄、蘋果等可以聚為一類[9]，本研究的結(jié)果與其具有一致性。付海輝等預(yù)測，部分植物的UFGT基因可能亞細(xì)胞定位于液

泡或葉綠體中，在液泡中催化不穩(wěn)定的花色素轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的花色素苷，從而使花色素苷在液泡中大量積累[9]。芒果UFGT基因是芒果花色素苷合成代謝途徑中的關(guān)鍵基因，它對芒果果皮紅色形成具有重要的作用。

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