龔麗++李云霞

摘要：運用基因克隆技術(shù)，以分離鑒定獲得的蛋白水解酶高活性類芽孢桿菌（Paenibacillus lautus）CHN26菌株的基因組DNA為模板，經(jīng)克隆鑒定該菌株是一種新型ATP-依賴型ClpP家族蛋白水解酶PlclpP基因，全長585 bp，編碼194個氨基酸，分子量約為21 ku。采用大腸桿菌（Eschericia coli）pET表達系統(tǒng)構(gòu)建PlclpP基因表達質(zhì)粒pET-28-PlclpP，并在大腸桿菌BL21中實現(xiàn)了重組PlClpP蛋白的表達。利用組氨酸標簽（His-tag）親和純化法獲得 PlClpP 純化蛋白，發(fā)現(xiàn)PlClpP可能與宿主菌未知伴侶分子形成蛋白復合物。PlClpP復合物具有ATP-依賴型酪蛋白水解酶活性，最適反應溫度為40 ℃、pH值7.0。表面活性劑強烈抑制PlClpP復合物的酶活性，而常規(guī)絲氨酸蛋白酶抑制劑對其活性沒有抑制作用。本研究結(jié)果為蛋白酶新基因資源的開發(fā)、ClpP家族蛋白酶的基礎理論和應用研究奠定了基礎。

關(guān)鍵詞：ClpP家族蛋白水解酶；類芽孢桿菌；基因；克隆；表達；酶學特性

中圖分類號： Q789文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）05-0047-04

蛋白水解酶約占全球酶制劑市場的60%，被廣泛應用于食品、醫(yī)藥、洗滌劑、農(nóng)業(yè)等領域[1]。微生物是水解酶的主要來源，探索并開發(fā)微生物新基因資源，對于解決目前商品化酶制劑種類及來源較少、底物單一、價格昂貴等問題具有重要意義。

ClpP（caseinolytic peptidase）家族ATP-依賴型伴侶分子相連（chaperone-linked）的酪蛋白水解肽酶廣泛存在于原核生物及真核生物中[2]，其利用ATP驅(qū)動蛋白底物解折疊并轉(zhuǎn)位進入蛋白水解腔（chamber）中降解成小分子肽[3]。1988年，ClpP蛋白酶首次被發(fā)現(xiàn)于大腸桿菌（Eschericia coli）中[4]。此后的大量研究表明，大腸桿菌中ClpP蛋白酶（EcClpP）由蛋白水解核心ClpP、依賴ATP的伴侶分子ClpA或ClpX組成，其蛋白水解腔由催化位點序列形成的2個反向同型七聚體環(huán)構(gòu)成[2]。在國外，ClpP蛋白酶已商品化，而目前國內(nèi)尚無涉及ClpP家族蛋白酶的研究報道。此外，有關(guān)類芽孢桿菌屬（Paenibacillus spp.）中clpP基因功能的研究國內(nèi)外均無報道。采用基因克隆技術(shù)，以筆者所在實驗室分離鑒定獲得的蛋白水解酶高活性類芽孢桿菌（P. lautus） CHN26菌株基因組DNA為模板，克隆鑒定了該菌株的一種新型ATP-依賴型ClpP家族蛋白水解酶PlclpP基因，并在大腸桿菌BL21中實現(xiàn)了異源表達。本研究結(jié)果為ClpP家族蛋白酶的基礎理論和應用研究奠定了基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料

Mini BEST細菌基因組DNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、Premix Ex Taq Verision 2.0、T4 DNA ligase均購自寶生物工程（大連）有限公司。限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ 購自Promega（美國）公司，Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基購自北京陸橋技術(shù)有限責任公司?？敲顾?、氨芐青霉素、聚丙烯酰胺和N，N′-亞甲雙丙烯酰胺等SDS-PAGE試劑、蛋白質(zhì)定量檢測試劑盒均購自生工生物工程（上海）有限公司。蛋白裂解試劑BugBuster Protein Extraction、純化試劑Ni-NTA His·Bindresin均購自Merck Millipore（德國）公司。β-酪蛋白購自Sigma-Aldrich（美國）公司。

大腸桿菌TOP10、大腸桿菌BL21、基因克隆載體pGM-T（Ampr）均購自天根生物技術(shù)有限公司；基因表達載體pET-28a（Kmr）購自Merck Millipore（德國）公司；類芽孢桿菌CHN26由筆者所在實驗室分離鑒定并保存。

1.2試驗方法

1.2.1分子生物學方法采用Primer 5.0軟件（http：//www.premierbiosoft.com/）設計PlclpP基因PCR擴增上、下游引物ClpP-P1f（5′-ATGGAGGATGAAACCATGAA-3′）、ClpP-P1r（5′-TCACAGTTTGGTGACGATGT-3′），以及在5′端分別引入限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ、HindⅢ酶切位點（以下劃線表示）的上、下游引物ClpP-P2f（5′-CGGGATCCATGGAGGATGA-3′）、ClpP-P2r（5′-CCCAAGCTTCAGTTTGGTGAC-3′）。寡核苷酸引物合成、DNA序列測定由生工生物工程（上海）有限公司完成，基因組和質(zhì)粒DNA的提取參照試劑盒說明書完成。參考Shi等的方法[5]進行PCR反應、產(chǎn)物純化、酶切、DNA片段連接與轉(zhuǎn)化、菌落PCR檢測等。采用Clustal 2.1軟件（www.ebi.ac.uk/Tools/services）進行多序列比對分析。

1.2.2蛋白表達及純化參考Li等的方法[6]進行PlclpP基因表達質(zhì)粒的構(gòu)建、蛋白的誘導表達、組氨酸標簽（His-tag）親和純化、SDS-PAGE等。

1.2.3蛋白水解酶活性的檢測以β-酪蛋白為底物，在150 μL酶反應液[2.7 μg β-casein，5 μL 0.1 mol/L ATP，2 mmol/L ZnCl2，50 mmol/L Tris-HCl（pH值為7.3）]中加入50 μL純化酶進行反應。將40 ℃、pH值7.0條件下，30 min內(nèi)水解β酪蛋白使D562 nm值增加0.01的酶量定義為1個酶活性單位（U）[7]。參考Li等的方法[6]測定溫度、pH值，表明活性劑（SDS、Tween-20、Tween-80）和蛋白酶抑制劑（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）對PlClpP復合物酶活性的影響。

2結(jié)果與分析

2.1蛋白水解酶高活性菌株類芽孢桿菌CHN26的分離鑒定

基于酶功能的篩選方法[6]，筆者所在實驗室從東海水產(chǎn)養(yǎng)殖池塘底泥中分離獲得1株蛋白水解酶高活性菌株，經(jīng)16S rRNA基因序列測定（GenBank登錄號為KF460030）分析及生理生化鑒定，發(fā)現(xiàn)其為厚壁菌門（Firmicutes）芽孢桿菌綱（Bacilli）芽孢桿菌目（Bacillales）類芽孢桿菌科（Paenibacillaceae）類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）的細菌，命名為類芽孢桿菌CHN26[6]。筆者所在實驗室對該菌株的多種蛋白水解酶基因進行了研究，本次報道其中一種酪蛋白水解肽酶clpP基因的克隆和表達。

2.2類芽孢桿菌CHN26的PlclpP基因分子克隆及序列分析

迄今為止，國內(nèi)外涉及類芽孢桿菌中clpP基因功能的研究尚無文獻報道。本研究利用目前GenBank數(shù)據(jù)庫中類芽孢桿菌屬Y412MC10菌株的全基因組信息（GenBank登錄號為NC_013406.1），基于其clpP基因序列設計了PCR擴增引物clpP-P1f/r。提取類芽孢桿菌CHN26基因組DNA并以其為模板進行PCR擴增，獲得約0.6 kb的單一PCR擴增產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后與克隆載體pGM-T連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細胞。篩選并提取Ampr陽性轉(zhuǎn)化子重組質(zhì)粒，經(jīng)DNA序列測定發(fā)現(xiàn)，克隆所得類芽孢桿菌CHN26的clpP基因全長585 bp，編碼194個氨基酸，預測分子量約為 21 ku，將其命名為PlclpP。

BLAST序列比對分析結(jié)果顯示，PlclpP序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中類芽孢桿菌屬的ATP-依賴型ClpP蛋白酶水解亞單位氨基酸序列的相似性為71%～98%，而與EcClpP的氨基酸序列相似性僅為62%。然而clpP基因多序列比對分析結(jié)果顯示，PlclpP基因序列含有S14_ClpP家族的特征性八肽結(jié)構(gòu)域（KDIHMYIN，第59個至第66個氨基酸）（圖1），其中第59個的賴氨酸（Lys58，K）、第60個的天冬氨酸（Asp59，D）、第64個的催化親核物質(zhì)（catalytic nucleophile）酪氨酸（Tyr63，Y）為高度保守的催化三分體殘基（catalytic triad residues），在酪蛋白水解中發(fā)揮重要作用[8]。此外，PlclpP序列還含有絲氨酸蛋白水解酶高度保守的催化活性位點（Ser99-His124-Asp173）（圖1）。

2.3PlclpP基因表達質(zhì)粒pET-28a-PlclpP的構(gòu)建與鑒定

基于本研究獲得的PlclpP基因序列，設計了攜帶限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ酶切位點的引物clpP-P2f/r，采用PCR方法擴增PlclpP基因，獲得單一PCR產(chǎn)物。采用BamHⅠ和HindⅢ雙酶切PCR產(chǎn)物，回收純化酶切產(chǎn)物。同時，提取表達載體pET-28a的質(zhì)粒DNA，經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ 雙酶切為線性的DNA片段，酶切產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果見圖2。

將上述純化后的酶切片段經(jīng)T4-DNA連接酶連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞，在含有30 μg/mL卡那霉素的LB瓊脂平板上，采用菌落PCR方法篩選獲得陽性轉(zhuǎn)化子克?。▓D2）。提取陽性轉(zhuǎn)化子重組質(zhì)粒DNA，經(jīng)BamHⅠ和 HindⅢ 雙酶切驗證為單一DNA片段插入，大小約0.6 kb（圖2）。經(jīng)DNA序列測定，驗證插入片段為PlclpP基因。

2.4PlclpP基因的表達和純化

采用LB液體培養(yǎng)基（含30 μg/mL卡那霉素）于20 ℃培養(yǎng)含有重組表達質(zhì)粒的大腸桿菌BL21（pET-28a-PlclpP），通過0.6 mmol/L IPTG誘導表達18 h，獲得含有組氨酸標簽的重組PlClpP蛋白，分子量約為21ku，與預測的ClpP蛋白分子量大小相一致，SDS-PAGE分析結(jié)果見圖3。利用Ni-NTA-His·Bind resin純化法純化大腸桿菌BL21菌體裂解后的無細胞提取液，經(jīng)SDS-PAGE分析洗脫液各組分，獲得了純化的目標蛋白PlClpP。在大腸桿菌BL21中異源表達的PlClpP蛋白在SDS-PAGE圖譜上呈現(xiàn)2個條帶，分子量分別約為21、25 ku（圖3）。鑒于大腸桿菌EcClpP蛋白酶伴侶分子ClpA、ClpX的分子量分別為80、46 ku[9-10]，推測PlClpP可能與大腸桿菌BL21中未知伴侶分子形成復合物，未知伴侶分子的序列和功能有待進一步研究。采用BCA蛋白定量試劑盒檢測PlClpP的表達量，結(jié)果顯示，1 g細胞濕質(zhì)量可以產(chǎn)生純化的重組PlClpP蛋白復合物約0.54 mg，約占細胞總蛋白的 5.25%。

2.5PlClpP復合物的蛋白水解酶活

本研究以非折疊態(tài)模式底物β-酪蛋白為底物，在含有2.5 mmol/L ATP的反應液中分析純化PlClpP復合物在不同溫度下的蛋白水解酶活性，PlClpP復合物的最適反應溫度為 40 ℃（圖4），明顯高于類芽孢桿菌CHN26和大腸桿菌BL21的最適生長溫度37 ℃。同時分析了該復合物在不同溫度下的穩(wěn)定性，結(jié)果顯示，PlClpP復合物在10～40℃下處理3h后相對酶活性仍高于90%，進一步證明了PlClpP復合物的嗜中溫反應特性（圖4）。此外還分析了pH值對PlClpP復合物蛋白水解酶活性的影響，結(jié)果顯示，該復合物的最適反應pH值為7.0。在強酸（pH值≤6.0）、強堿（pH值≥7.0）條件下于 4 ℃ 處理12 h后，相對酶活性迅速減弱，而在pH值6.0～7.0 條件下相對酶活性強于87%，證明PlClpP復合物的中性pH值反應特性。

2.6表面活性劑和蛋白酶抑制劑對PlClpP復合物酶活性的影響

分別采用SDS、Tween-20、Tween-80表面活性劑于 40 ℃ 條件下處理純化的PlClpP復合物1 h，并在最適溫度和pH值條件下測定殘余酶活。結(jié)果顯示，終濃度為0.5%的表面活性劑強烈抑制PlClpP性復合物的酶活性50%～60%；PlClpP 復合物對常規(guī)絲氨酸蛋白酶抑制劑具有較強的抗性，10 mmol/L PMSF處理PlClpP復合物1 h對其酶活性無明顯影響，表明PlClpP屬于一類非常規(guī)的絲氨酸蛋白酶。

3結(jié)論

運用基因克隆技術(shù)，以分離鑒定獲得的蛋白水解酶高活性類芽孢桿菌CHN26基因組DNA為模板，經(jīng)克隆鑒定該菌株為一種新型蛋白水解酶基因PlclpP，編碼194個氨基酸，分子量約為 21 ku。PlClpP氨基酸序列含有保守的ClpP家族特征性八肽結(jié)構(gòu)域（KDIHMYIN，第59個至第66個氨基酸），以

及絲氨酸蛋白水解酶保守的催化活性位點（Ser99-His124-Asp173）。采用大腸桿菌的pET表達系統(tǒng)構(gòu)建了PlclpP基因表達質(zhì)粒pET-28-PlclpP，在大腸桿菌BL21中實現(xiàn)了重組PlClpP蛋白的表達。利用組氨酸標簽（His-tag）親和純化法獲得了PlClpP純化蛋白，發(fā)現(xiàn)PlClpP可能與宿主菌未知伴侶分子形成蛋白復合物。PlClpP復合物具有ATP-依賴型酪蛋白水解酶活性，最適反應溫度為40 ℃、pH值7.0。終濃度為0.5%的表面活性劑SDS、Tween-20、Tween-80均強烈抑制PlClpP復合物的酶活性，而常規(guī)絲氨酸蛋白酶抑制劑（PMSF）對其活性無抑制作用。本研究填補了我國ClpP家族蛋白水解酶研究領域的空白，為開發(fā)蛋白酶新基因資源、ClpP家族蛋白酶的基礎理論和應用研究奠定了基礎。

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