王玲慧等

摘 要：采集楊凌五泉、揉谷和李臺3個番茄主產(chǎn)區(qū)表現(xiàn)矮化、黃化及曲葉癥狀的植株嫩葉，克隆番茄黃化曲葉病毒（TYLCV）基因全長并測序，依次得到病毒分離物TYLCV-SXYL2、TYLCV-SXYL3和TYLCV-SXYL4。通過多序列比對、系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)預(yù)測等生物信息學(xué)方法進(jìn)行基因組和蛋白質(zhì)的特征分析，結(jié)果表明，楊凌區(qū)3個TYLCV分離物之間全長核苷酸相似度為99.3%～99.4%，是不伴隨衛(wèi)星分子的單組分病毒，屬TYLCV-IS株系的不同分離物，全長為2 781 nt；與山東壽光病毒分離物TYLCV-SDSG親緣關(guān)系最近，相似度為99.6%，與陜西涇陽的分離物TYLCV-SX8相似度為99.1%，與以色列株系TYLCV-IS相似度達(dá)97.7%～97.8%；編碼6個蛋白質(zhì)，其中CP、Rep、REn為跨膜蛋白，V2、TrAP、C4為胞內(nèi)蛋白，Rep和REn為穩(wěn)定蛋白，CP、V2、TrAP、C4為不穩(wěn)定蛋白。

關(guān)鍵詞：番茄黃化曲葉病毒；楊凌；番茄；生物信息學(xué)分析

中圖分類號：S436.412.1+1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1001-3547（2014）04-0054-07

番茄（Solanum lycopersicum L.）是世界上最重要的蔬菜作物之一[1]，而番茄黃化曲葉?。═omato

yellow leaf curl disease，TYLCD）為全球番茄生產(chǎn)中最具威脅的“植物癌癥”[2]，1961年以色列最先鑒定的番茄黃化曲葉病毒（Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）是其主要病原。TYLCV為單鏈環(huán)狀DNA病毒，屬于雙生病毒科（Geminiviridea）菜豆金色花葉病毒屬（Begomovirus），由煙粉虱（Bemisia tabaci）以持久性方式傳播[3，4]，在寄主細(xì)胞核內(nèi)形成的雙鏈DNA復(fù)制中間體共編碼6個開放閱讀框。楊凌區(qū)是我國唯一的農(nóng)業(yè)高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)示范區(qū)，位于陜西省關(guān)中平原中部，2011年楊凌暴發(fā)的TYLCD已成為限制楊凌區(qū)番茄生產(chǎn)的主要因素，但目前未見有楊凌TYLCV全基因組分子特征及編碼蛋白生物信息學(xué)分析的研究報道。本試驗對楊凌區(qū)五泉、揉谷和李臺的番茄主產(chǎn)區(qū)進(jìn)行調(diào)查采樣，對病毒分離物進(jìn)行全長克隆、測序和變異分析，并對病毒編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列和蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)、不穩(wěn)定系數(shù)等性質(zhì)進(jìn)行了比較分析，旨在進(jìn)一步明確陜西楊凌番茄黃化曲葉病毒基因組結(jié)構(gòu)和進(jìn)化起源，為進(jìn)一步開展番茄黃化曲葉病的防控工作、番茄分子抗病育種、病毒變異進(jìn)化和病毒編碼蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

①毒源樣品 在陜西省楊凌區(qū)五泉、揉谷和李臺的番茄主產(chǎn)區(qū)采集表現(xiàn)生長遲滯矮化、上部葉片黃化、葉片邊緣向上卷曲、褶皺簇狀、后期不能正常開花結(jié)果癥狀的番茄植株嫩葉各1份，常溫下用采樣袋密封帶回，液氮速凍后置于-80℃保存。

②試劑 Pfu DNA Polymerase購自Fermenents公司，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（離心柱型）購自Bioteke公司，質(zhì)粒微量提取試劑盒購自BIOMIGA公司，PrimeSTAR Max DNA Polymerase、加A尾試劑盒A-Tailing Kit、克隆載體PMD18-T和DH5α感受態(tài)大腸桿菌購自TaKaRa公司，試驗所用引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列測定由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

1.2 試驗方法

①植物總DNA的提取和病毒分子鑒定 DNA的提取用CTAB法，得到的樣品DNA溶液于-20℃保存?zhèn)溆?。TYLCV鑒定用李常保等[5]設(shè)計的TYLCV特異引物TYLCV-F/TYLCV-R；陽性對照TYLCV-SH2由浙江大學(xué)周雪平教授饋贈。DNA-B組分鑒定用雙生病毒DNA-B組分鑒定通用引物PCRc1/PBLv2040[6]；衛(wèi)星DNA β鑒定用雙生病毒衛(wèi)星DNA β鑒定通用引物Beta01/Beta02[7]，引物序列和目標(biāo)條帶大小見表1。

②分子克隆和測序 用TYLCV特異引物TYLCV-F/TYLCV-R，Pfu DNA Polymerase擴(kuò)增部分片段（約500 bp）后回收，用A-tailing Kit加A尾后克隆至PMD18-T載體，轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)大腸桿菌，經(jīng)氨芐抗性篩選、菌液PCR鑒定及提取質(zhì)粒酶切驗證后用于測序。依據(jù)測得的519 bp序列用Primer Premier軟件（Version 5.0，Premier，Canada）設(shè)計相鄰背向引物SX-F/SX-R，用PrimeSTAR Max DNA Polymerase擴(kuò)增病毒基因組全長，經(jīng)克隆并測序得到基因組全序列。

③序列比對分析和進(jìn)化樹的構(gòu)建 通過NCBI Blast（Basic local alignment search tool）尋找TYLCV同源序列信息。用DNAStar Package的MEGA （Version 5.05，Madison，Wis，USA）軟件[8]中的

MUSCLE算法進(jìn)行多序列比對分析后，用鄰近相連法（Neighbor-joining）構(gòu)建基于病毒DNA-A核苷酸全序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹。用DNAMAN（Version 5.2.2，Lynnon Biosoft，Quebec Canada）軟件構(gòu)建不同TYLCV分離物的同源矩陣。

④病毒基因組結(jié)構(gòu)分析 病毒開放閱讀框的查找利用NCBI的ORF Finder （Open Reading Frame Finder，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）在線工具。病毒基因組結(jié)構(gòu)圖利用DNAStar Package中的SeqBuilder軟件繪制。

⑤蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)的預(yù)測及分析 病毒蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)利用TMpred （http：//www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html）在線工具預(yù)測。蛋白質(zhì)理化性質(zhì)利用ExPASy的ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）在線工具進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 采集樣品DNA病毒全長克隆和聚類分析

①TYLCV病毒分子鑒定 通過用TYLCV特異引物TYLCV-F/TYLCV-R對樣品DNA進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果顯示，3個樣品TYLCV-SXYL2、SXYL3和SXYL4都為帶毒植株（圖1），并克隆測序得到519 bp序列。以雙生病毒DNA-B組分通用引物PCRc1/PBLv2040進(jìn)行PCR擴(kuò)增，未得到預(yù)期500～650 bp大小的條帶，以雙生病毒衛(wèi)星DNA β鑒定通用引物Beta01/Beta02進(jìn)行PCR反應(yīng)，也未得到預(yù)期1 200～1 400 bp大小的條帶。結(jié)果表明，陜西楊凌地區(qū)侵染番茄的TYLCV為不含DNA-B且不伴隨衛(wèi)星DNA β的單組分病毒，只含DNA-A。

②DNA-A全長的同源矩陣 選擇NCBI登錄的國內(nèi)外不同地區(qū)分離的19個TYLCV分離物（表2），用DNAMAN多序列比對后構(gòu)建同源矩陣（表3）。發(fā)現(xiàn)楊凌區(qū)3個分離物TYLCV-SXYL2、SXYL3、SXYL4核苷酸序列全長之間相似度為99.3%～99.4%，且和TYLCV-IS相似度為97.7%～97.8%。楊凌區(qū)的3個病毒分離物與山東壽光分離物TYLCV-SDSG的相似度都為99.6%，與陜西涇陽的分離物TYLCV-SX8的相似度都為99.1%。

③基于DNA-A全長的系統(tǒng)進(jìn)化樹 陜西楊凌3個TYLCV分離物同19個不同國家地區(qū)的TYLCV通過MEGA5.05軟件中MUSCLE算法多序列比對后，用鄰近相連（Neighbor-Joining）法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖2）發(fā)現(xiàn)，楊凌分離物和山東壽光分離物TYLCV-SDSG、河北石家莊分離物TYLCV-SJZ1、陜西涇陽分離物TYLCV-SX8、安徽分離物TYLCV-AH1、北京分離物TYLCV-Beijing3、美國分離物TYLCV-USA及浙江分離物TYLCV-ZJ8在同一小支上，且與山東壽光分離物TYLCV-SDSG親緣關(guān)系最近。上述分離物還與上海分離物TYLCV-SH2[9]、日本分離物TYLCV-Janpan、荷蘭分離物TYLCV-Netherlands和以色列株系TYLCV-IS在同一大支上。意大利撒丁島分離物TYLCSV和西班牙馬加拉分離物TYLCMalV在同一支。廣東分離物TYLCGV-G3和越南分離物TYLCVNV在同一支。新疆分離物TYLCV-XJ26-4和廣西分離物中國番茄黃化曲葉病毒TYLCCNV為同一支。云南分離物TYLTHV-Y72和泰國分離物TYLCTHV在同一支。由此可知，我國番茄黃化曲葉病毒的分布和種類同樣有較大的復(fù)雜性和多樣性，而楊凌番茄黃化曲葉病毒分離物很可能由最早發(fā)現(xiàn)的TYLCV-IS發(fā)展而來，且與山東壽光分離物親緣關(guān)系最近，基于楊凌地區(qū)與山東壽光種苗交易頻繁的現(xiàn)狀，推測很可能是因為感病幼苗交易帶來了病毒傳播與蔓延。

2.2 病毒DNA-A全長序列和基因組結(jié)構(gòu)

設(shè)計背向引物PCR擴(kuò)增并克隆得到病毒DNA-A全長。測序結(jié)果表明，TYLCV-SXYL2、SXYL3、SXYL4（GenBank登錄號依次為KC138545、KC138544、KC138543）全長都為2 781 nt，共編碼6個開放閱讀框（圖3），在病毒鏈上編碼外殼蛋白和AV2蛋白，在互補鏈上編碼復(fù)制相關(guān)蛋白、轉(zhuǎn)錄激活子、復(fù)制增強子和AC4蛋白。在AC1和AV2之間有313 nt的非編碼區(qū)，也叫基因間隔區(qū)。

①基因間隔區(qū) 基因間隔區(qū)（Intergenic Region，IR）位于1～147 nt和2 616～2 781 nt，共含313個核苷酸，有調(diào)控病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄起始必須的元件，含有病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄所必需的結(jié)構(gòu)域以及莖環(huán)結(jié)構(gòu)，莖環(huán)頂端有保守的九核苷酸TAATATT/AC序列。由于IR區(qū)相對于編碼區(qū)選擇壓小，也是病毒變異最活躍的區(qū)域。通過對TYLCV-SXYL2、SXYL3、SXYL4 和 TYLCV-IS的IR區(qū)核苷酸序列比較（圖4）發(fā)現(xiàn)，其特征序列中莖環(huán)頂端的九核苷酸TAATATT/AC（位于2 775～2 781 nt及1～2 nt）保守序列、TATA box和TATATA box，與TYLCV-IS一致，但CAAT box和5～8 nt短重復(fù)序列已表現(xiàn)出與TYLCV-IS有較大差異，其中短重復(fù)序列是Rep蛋白的結(jié)合位點。

②編碼蛋白的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)分析 為進(jìn)一步了解楊凌番茄黃化曲葉病毒分離物編碼蛋白質(zhì)氨基酸序列的變異特點和更好地進(jìn)行蛋白質(zhì)性質(zhì)分析，將TYLCV-SXYL4與19個其他地區(qū)分離物及TYLCV-SXYL2、SXYL3編碼的6個蛋白質(zhì)氨基酸序列相似度進(jìn)行比較分析（表5），結(jié)果顯示，楊凌3個分離物和越南番茄黃化曲葉病毒TYLCVNV、以色列TYLCV-IS轉(zhuǎn)錄激活子TrAP的氨基酸序列完全相同。TYLCV- SXYL3、 SXYL4和山東壽光分離物TYLCV-SDSG及河北石家莊分離物TYLCV-SJZ1復(fù)制增強子REn的氨基酸序列完全相同，且與TYLCV-IS的REn氨基酸序列相比，第58位由纈氨酸（Valine， V）突變?yōu)楸彼幔ˋlanine，A）、第59位由甲硫氨酸（Methionine，M）突變?yōu)榱涟彼幔↙eucine，L）、第94位由天冬氨酸（Aspartic acid，D）突變?yōu)槔野彼幔═yrosine，Y）、第124位由谷氨酸（Glutamic acid，E）突變?yōu)楸彼?。TYLCV-SXYL2、SXYL3、SXYL4和日本分離物TYLCV-Japan、山東壽光分離物TYLCV-SDSG、上海分離物TYLCV-SH2、河北石家莊分離物TYLCV-SJZ1的C4蛋白氨基酸序列完全相同，與TYLCV-IS的C4蛋白氨基酸序列相比，第64位由脯氨酸（Proline，P）突變?yōu)榻z氨酸（Ser，S）、第67位由甲硫氨酸突變?yōu)楫惲涟彼幔↖soleucine，I）、第84位由賴氨酸（Lysine，K）突變?yōu)榫彼幔ˋrginine，R）。

通過TMpred在線工具分別對楊凌3個病毒分離物編碼的6個蛋白進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，CP、 Rep、REn存在跨膜結(jié)構(gòu)（圖5），而V2、TrAP、C4為胞內(nèi)蛋白；楊凌3個病毒分離物的CP、V2、Rep和REn氨基酸序列有1～2個位點的區(qū)別，沒有影響蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)的預(yù)測結(jié)果。

利用ExPasy的ProtParam在線工具對TYLCV-SXYL2、SXYL3、SXYL4和TYLCV-IS編碼蛋白的理論等電點、不穩(wěn)定系數(shù)和親水性平均系數(shù)進(jìn)行預(yù)測和比較分析（表6），發(fā)現(xiàn)楊凌番茄黃化曲葉病毒分離物和TYLCV-IS編碼AV2蛋白和REn的理論等電點差異較大。按不穩(wěn)定系數(shù)<40為穩(wěn)定蛋白、不穩(wěn)定系數(shù)>40為不穩(wěn)定蛋白推測，CP、V2、TrAP、C4為不穩(wěn)定蛋白，Rep和REn為穩(wěn)定蛋白。

3 討論與結(jié)論

為了進(jìn)一步明確引起楊凌地區(qū)不同番茄主產(chǎn)區(qū)番茄黃化曲葉病害的病原種類和分子特征，依據(jù)Begomovirus分類中同時滿足外殼蛋白氨基酸序列相似度>90%和核苷酸全長相似性>89%才可能為同一病毒的不同分離物的標(biāo)準(zhǔn)[10]，本研究在楊凌區(qū)3個不同番茄主產(chǎn)區(qū)調(diào)查采樣并對全基因組進(jìn)行了測序和基因組結(jié)構(gòu)分析。本研究表明，在楊凌區(qū)五泉、揉谷和李臺的番茄主產(chǎn)區(qū)引起番茄黃化曲葉病的病原確為TYLCV-IS株系的不同分離物（TYLCV-SXYL2、TYLCV-SXYL3、TYLCV-SXYL4），經(jīng)鑒定，這3個分離物都為單組分雙生病毒且不伴隨衛(wèi)星分子。李云洲等[11]克隆了楊凌地區(qū)西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝實驗場番茄黃化曲葉病毒外殼蛋白基因后發(fā)現(xiàn)，其氨基酸序列與以色列株系TYLCV-IS相似度>90%。

陜西省涇陽縣2010年暴發(fā)番茄黃化曲葉病

后[12]，楊凌地區(qū)各大番茄主產(chǎn)區(qū)在2011年相繼發(fā)現(xiàn)番茄黃化曲葉病。但由系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建及病毒編碼的6個蛋白氨基酸相似度比對結(jié)果發(fā)現(xiàn)，楊凌與山東壽光分離物TYLCV-SXSG親緣關(guān)系比與地理位置最近的涇陽分離物TYLCV-SX8的近，病毒蛋白特別是TYLCV-SXYL3、SXYL4編碼的REn的氨基酸序列相似度與TYLCV-SDSG達(dá)100%，與涇陽TYLCV-SX8僅為97.8%，這說明了植物病毒的傳播流行不僅受地理位置、氣候環(huán)境的影響，人為因素也起著越來越重要的作用。

雖然TYLCV基因組小，編碼的蛋白數(shù)量有限，但其與寄主的互作及致病機理仍然不清楚[13]。本研究對不同TYLCV編碼的蛋白質(zhì)間的氨基酸相似度、蛋白質(zhì)的理化特性和跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行了生物信息學(xué)分析及比較，表明CP、Rep、REn為跨膜蛋白，V2、 TrAP、C4為胞內(nèi)蛋白，Rep和REn為穩(wěn)定蛋白，CP、 V2、TrAP、C4為不穩(wěn)定蛋白。

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通過TMpred在線工具分別對楊凌3個病毒分離物編碼的6個蛋白進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，CP、 Rep、REn存在跨膜結(jié)構(gòu)（圖5），而V2、TrAP、C4為胞內(nèi)蛋白；楊凌3個病毒分離物的CP、V2、Rep和REn氨基酸序列有1～2個位點的區(qū)別，沒有影響蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)的預(yù)測結(jié)果。

利用ExPasy的ProtParam在線工具對TYLCV-SXYL2、SXYL3、SXYL4和TYLCV-IS編碼蛋白的理論等電點、不穩(wěn)定系數(shù)和親水性平均系數(shù)進(jìn)行預(yù)測和比較分析（表6），發(fā)現(xiàn)楊凌番茄黃化曲葉病毒分離物和TYLCV-IS編碼AV2蛋白和REn的理論等電點差異較大。按不穩(wěn)定系數(shù)<40為穩(wěn)定蛋白、不穩(wěn)定系數(shù)>40為不穩(wěn)定蛋白推測，CP、V2、TrAP、C4為不穩(wěn)定蛋白，Rep和REn為穩(wěn)定蛋白。

3 討論與結(jié)論

為了進(jìn)一步明確引起楊凌地區(qū)不同番茄主產(chǎn)區(qū)番茄黃化曲葉病害的病原種類和分子特征，依據(jù)Begomovirus分類中同時滿足外殼蛋白氨基酸序列相似度>90%和核苷酸全長相似性>89%才可能為同一病毒的不同分離物的標(biāo)準(zhǔn)[10]，本研究在楊凌區(qū)3個不同番茄主產(chǎn)區(qū)調(diào)查采樣并對全基因組進(jìn)行了測序和基因組結(jié)構(gòu)分析。本研究表明，在楊凌區(qū)五泉、揉谷和李臺的番茄主產(chǎn)區(qū)引起番茄黃化曲葉病的病原確為TYLCV-IS株系的不同分離物（TYLCV-SXYL2、TYLCV-SXYL3、TYLCV-SXYL4），經(jīng)鑒定，這3個分離物都為單組分雙生病毒且不伴隨衛(wèi)星分子。李云洲等[11]克隆了楊凌地區(qū)西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝實驗場番茄黃化曲葉病毒外殼蛋白基因后發(fā)現(xiàn)，其氨基酸序列與以色列株系TYLCV-IS相似度>90%。

陜西省涇陽縣2010年暴發(fā)番茄黃化曲葉病

后[12]，楊凌地區(qū)各大番茄主產(chǎn)區(qū)在2011年相繼發(fā)現(xiàn)番茄黃化曲葉病。但由系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建及病毒編碼的6個蛋白氨基酸相似度比對結(jié)果發(fā)現(xiàn)，楊凌與山東壽光分離物TYLCV-SXSG親緣關(guān)系比與地理位置最近的涇陽分離物TYLCV-SX8的近，病毒蛋白特別是TYLCV-SXYL3、SXYL4編碼的REn的氨基酸序列相似度與TYLCV-SDSG達(dá)100%，與涇陽TYLCV-SX8僅為97.8%，這說明了植物病毒的傳播流行不僅受地理位置、氣候環(huán)境的影響，人為因素也起著越來越重要的作用。

雖然TYLCV基因組小，編碼的蛋白數(shù)量有限，但其與寄主的互作及致病機理仍然不清楚[13]。本研究對不同TYLCV編碼的蛋白質(zhì)間的氨基酸相似度、蛋白質(zhì)的理化特性和跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行了生物信息學(xué)分析及比較，表明CP、Rep、REn為跨膜蛋白，V2、 TrAP、C4為胞內(nèi)蛋白，Rep和REn為穩(wěn)定蛋白，CP、 V2、TrAP、C4為不穩(wěn)定蛋白。

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通過TMpred在線工具分別對楊凌3個病毒分離物編碼的6個蛋白進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，CP、 Rep、REn存在跨膜結(jié)構(gòu)（圖5），而V2、TrAP、C4為胞內(nèi)蛋白；楊凌3個病毒分離物的CP、V2、Rep和REn氨基酸序列有1～2個位點的區(qū)別，沒有影響蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)的預(yù)測結(jié)果。

利用ExPasy的ProtParam在線工具對TYLCV-SXYL2、SXYL3、SXYL4和TYLCV-IS編碼蛋白的理論等電點、不穩(wěn)定系數(shù)和親水性平均系數(shù)進(jìn)行預(yù)測和比較分析（表6），發(fā)現(xiàn)楊凌番茄黃化曲葉病毒分離物和TYLCV-IS編碼AV2蛋白和REn的理論等電點差異較大。按不穩(wěn)定系數(shù)<40為穩(wěn)定蛋白、不穩(wěn)定系數(shù)>40為不穩(wěn)定蛋白推測，CP、V2、TrAP、C4為不穩(wěn)定蛋白，Rep和REn為穩(wěn)定蛋白。

3 討論與結(jié)論

為了進(jìn)一步明確引起楊凌地區(qū)不同番茄主產(chǎn)區(qū)番茄黃化曲葉病害的病原種類和分子特征，依據(jù)Begomovirus分類中同時滿足外殼蛋白氨基酸序列相似度>90%和核苷酸全長相似性>89%才可能為同一病毒的不同分離物的標(biāo)準(zhǔn)[10]，本研究在楊凌區(qū)3個不同番茄主產(chǎn)區(qū)調(diào)查采樣并對全基因組進(jìn)行了測序和基因組結(jié)構(gòu)分析。本研究表明，在楊凌區(qū)五泉、揉谷和李臺的番茄主產(chǎn)區(qū)引起番茄黃化曲葉病的病原確為TYLCV-IS株系的不同分離物（TYLCV-SXYL2、TYLCV-SXYL3、TYLCV-SXYL4），經(jīng)鑒定，這3個分離物都為單組分雙生病毒且不伴隨衛(wèi)星分子。李云洲等[11]克隆了楊凌地區(qū)西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝實驗場番茄黃化曲葉病毒外殼蛋白基因后發(fā)現(xiàn)，其氨基酸序列與以色列株系TYLCV-IS相似度>90%。

陜西省涇陽縣2010年暴發(fā)番茄黃化曲葉病

后[12]，楊凌地區(qū)各大番茄主產(chǎn)區(qū)在2011年相繼發(fā)現(xiàn)番茄黃化曲葉病。但由系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建及病毒編碼的6個蛋白氨基酸相似度比對結(jié)果發(fā)現(xiàn)，楊凌與山東壽光分離物TYLCV-SXSG親緣關(guān)系比與地理位置最近的涇陽分離物TYLCV-SX8的近，病毒蛋白特別是TYLCV-SXYL3、SXYL4編碼的REn的氨基酸序列相似度與TYLCV-SDSG達(dá)100%，與涇陽TYLCV-SX8僅為97.8%，這說明了植物病毒的傳播流行不僅受地理位置、氣候環(huán)境的影響，人為因素也起著越來越重要的作用。

雖然TYLCV基因組小，編碼的蛋白數(shù)量有限，但其與寄主的互作及致病機理仍然不清楚[13]。本研究對不同TYLCV編碼的蛋白質(zhì)間的氨基酸相似度、蛋白質(zhì)的理化特性和跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行了生物信息學(xué)分析及比較，表明CP、Rep、REn為跨膜蛋白，V2、 TrAP、C4為胞內(nèi)蛋白，Rep和REn為穩(wěn)定蛋白，CP、 V2、TrAP、C4為不穩(wěn)定蛋白。

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