習(xí)偉宏王真朱洪水李曉峰熊遠(yuǎn)飛

1.南昌大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科；2.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科，南昌 330006

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·顳下頜關(guān)節(jié)專欄·

下頜骨髁突仿生復(fù)合支架的制備與表征

習(xí)偉宏1王真1朱洪水1李曉峰2熊遠(yuǎn)飛2

1.南昌大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科；2.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科，南昌 330006

［摘要］目的 構(gòu)建下頜骨髁突一體化殼聚糖（CS）-聚己酸內(nèi)酯（PCL）-羥磷灰石（HA）（HA/PCL-CS）仿生復(fù)合支架，并探討其在髁突組織工程中應(yīng)用的可行性。方法 應(yīng)用快速成形技術(shù)形成下頜骨髁突模具，利用溶液澆鑄-冰瀝方法制備下頜骨髁突一體化仿生復(fù)合支架模型，PCL︰CS按4︰1的比例混合，分別加入質(zhì)量比為40%、50%、60%、70%的HA，分為a、b、c、d組，觀察支架的微觀形貌、孔隙率、紅外光譜、X線衍射、力學(xué)性能等特性。結(jié)果 支架與下頜骨髁突形狀相吻合，外觀黃白色，堅(jiān)硬，分上層及下層兩部分。掃描電子顯微鏡顯示該復(fù)合支架具有三維網(wǎng)絡(luò)空間結(jié)構(gòu)，孔隙率70%～85%，孔徑大小10～200 μm。紅外光譜顯示隨著HA的含量減少，其波峰強(qiáng)度降低。X線衍射結(jié)果顯示隨著HA含量的增加，其衍射峰強(qiáng)度相對(duì)降低。HA含量為50%時(shí)支架具有適宜的抗拉伸強(qiáng)度及抗壓、抗彎強(qiáng)度。結(jié)論 溶液澆鑄-冰瀝方法制得的支架具有良好的綜合材料性能，有望成為一種髁突自體組織工程用支架材料。

［關(guān)鍵詞］下頜骨髁突； 骨組織工程； 仿生支架； 殼聚糖； 聚己酸內(nèi)酯； 羥磷灰石

顳下頜關(guān)節(jié)是頜面部唯一的聯(lián)動(dòng)關(guān)節(jié)，在頜面部肌肉作用下參與咀嚼、吞咽、語(yǔ)言及表情等重要活動(dòng)。流行病學(xué)調(diào)查顯示6%～12%的人患有顳下頜關(guān)節(jié)疾患［1］，嚴(yán)重的可引起骨關(guān)節(jié)病變，造成髁突破壞。此外，髁突腫瘤、外傷也常常造成髁突的缺損和破壞。對(duì)于這類骨性病變的患者，手術(shù)治療是其必要的選擇，但臨床目前缺少有效的髁突植入或置換材料，多采用自體骨移植或者人工材料替換，但自體骨缺乏較好的外形且增加供骨區(qū)損傷，現(xiàn)有人工材料因力學(xué)韌性要求、降解周期及術(shù)后感染等問(wèn)題而難以取得理想的效果［2-3］。隨著組織工程的發(fā)展，雙相復(fù)合材料的出現(xiàn)為人們尋找新的髁突組織材料提供了新的思路［4-5］。本研究采用溶液澆鑄-冰瀝方法制備了一種上下層不同孔徑、孔隙率的一體化殼聚糖（chitosan，CS）-聚己酸內(nèi)酯（polycaprolactone， PCL）-羥磷灰石（hydroxyapatite，HA）（HA/PCL-CS）仿生復(fù)合支架，并對(duì)其性能進(jìn)行一系列檢測(cè)，探討其在髁突骨軟骨一體化組織工程中應(yīng)用的可行性。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器

殼聚糖（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、四氫呋喃（成都西亞試劑有限公司）、聚己酸內(nèi)酯（上海阿拉丁試劑有限公司）、羥磷灰石（上?；鈱?shí)業(yè)有限公司）、恒溫磁力攪拌器（常州國(guó)華電器有限公司）；髁突陰模（上海交通大學(xué)）、XL-30掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）（Philips公司，日本）、萬(wàn)能測(cè)試機(jī)（Toshiba公司，日本）、EQUINOX55型傅立葉變換紅外光譜儀（fourier transform infrared spectrometer，F(xiàn)T-IR）（Bruker公司，德國(guó)）、MASL2XD2型全自動(dòng)X-射線衍射（X-ray diffraction，XRD）儀（北京大學(xué)儀器廠）。

1.2 致孔劑的制備

采用冰粒子作為致孔劑。將蒸餾水通過(guò)毛細(xì)管快速噴入裝有液氮的容器中，使其迅速凝固成冰粒子。由于表面張力的作用，制備出來(lái)的冰粒子呈圓球型。在零度以下的環(huán)境下篩選出直徑50～100 μm和直徑100～200 μm的2種冰顆粒，真空下-80 ℃保存以備用。

1.3 多孔支架的制備

應(yīng)用快速成形技術(shù)形成下頜骨髁突模具，利用溶液澆鑄-冰瀝方法制備下頜骨髁突一體化仿生復(fù)合支架模型。在室溫下將PCL︰CS按4︰1的比例溶于20 mL四氫呋喃溶液中，并分別加入質(zhì)量比為40%、50%、60%、70%的HA，分為a、b、c、d組。將混合溶液在磁力攪拌儀上攪拌30 min，放入冰箱（-20 ℃）中預(yù)凍一段時(shí)間。將準(zhǔn)備好的冰顆粒分別加入混合液，并混合均勻。調(diào)整冰粒子的大小及含量以制得不同冰含量的混合物。-20 ℃冷凍干燥得到較稠混合物，依次將混合物根據(jù)加入的致孔劑大小及含量從小到大分別呈梯度加入髁突模具。-20 ℃再次冷凍干燥，去除溶劑四氫呋喃，最后室溫下干燥去除致孔劑得到HA/PCL-CS復(fù)合支架。

1.4 孔隙率的測(cè)定

采用排乙醇法測(cè)定孔隙率。在室溫下，取兩個(gè)相同的空容器，將支架放入容器甲中，倒入一定無(wú)水乙醇，記錄此時(shí)體積為V1，使完全浸泡，密封，將容器中空氣盡量排出，這時(shí)標(biāo)記體積位置，將容器乙倒入相同標(biāo)記位置的乙醇，記錄體積為V2，按以下公式計(jì)算支架的孔隙率（P），P = V2/V1×100%。1.5 FT-IR分析

使用FT-IR，先將產(chǎn)物用KBr壓片法制樣，然后對(duì)支架進(jìn)行紅外光譜分析。

1.6 XRD分析

使用全自動(dòng)X-射線衍射儀測(cè)定支架共聚物的XRD曲線，研究其結(jié)晶性能。

1.7 SEM檢查

使用SEM先對(duì)樣品進(jìn)行噴金處理，然后觀察支架內(nèi)部的形態(tài)。

1.8 力學(xué)性能測(cè)試

使用萬(wàn)能測(cè)試機(jī)測(cè)試材料的三點(diǎn)抗彎及抗壓強(qiáng)度?？箯潖?qiáng)度測(cè)試條件為：加載速度10 mm·min-1，跨度 30 mm，壓頭直徑4 mm?？箯潖?qiáng)度的計(jì)算公式為：R=（3F×L）/（2b×h×h），式中F為破壞載荷，L為跨距，b為寬度，h為厚度?？箟簭?qiáng)度測(cè)試條件為：加載速度5 mm·min-1。如果支架材料在形變小于25%之前斷裂，其斷裂強(qiáng)度即為抗壓強(qiáng)度；如果材料在形變25%時(shí)未斷裂，則其抗壓強(qiáng)度取其形變25%時(shí)的強(qiáng)度。

2 結(jié)果

2.1 支架形態(tài)

支架的形態(tài)見(jiàn)圖1、2。從圖1可見(jiàn)，支架的外觀與髁突形狀相吻合，外觀黃白色，質(zhì)地堅(jiān)硬，表面呈蜂窩狀。SEM（圖2）可見(jiàn)，材料呈多網(wǎng)孔狀結(jié)構(gòu)，支架上層相當(dāng)于軟骨部分的孔徑大小為100～200 μm，孔隙率約為85%，支架下層相當(dāng)于軟骨下骨部分的孔徑大小為50～100 μm，孔隙率約為70%。HA均勻分布在PCL-CS基質(zhì)中，分散性良好，PCL以半結(jié)晶方式堆砌排列，其內(nèi)有少部分更小的孔隙（孔徑10～40 μm）。從總體上看，形成的支架從下層往上呈孔徑（70%～85%）、孔隙率（10～200 μm）逐漸變大的三維網(wǎng)絡(luò)空間結(jié)構(gòu)。

圖 1 支架的大體觀Fig 1 The generally appearance of scaffold

圖 2 支架內(nèi)部形態(tài) SEM × 100Fig 2 Internal form of scaffold SEM × 100

2.2 FT-IR分析

不同含量HA支架的FT-IR分析結(jié)果見(jiàn)圖3。HA 在1 038 cm-1左右出現(xiàn)P-O鍵特征吸收峰，在1 375 cm-1出現(xiàn)PCL的甲基，在1 820 cm-1出現(xiàn)C=O雙鍵特征吸收峰，而在此區(qū)間，CS、PCL的C-O鍵、酰胺鍵、N-H鍵的重疊，使此區(qū)間呈現(xiàn)一個(gè)不規(guī)則波峰，在3 450 cm-1呈現(xiàn)CS的羥基鍵特征吸收峰。隨著HA的含量減少，其波峰強(qiáng)度也降低。

圖 3 不同含量HA支架的FT-IR結(jié)果Fig 3 FT-IR results of different content of HA scaffold

2.3 XRD分析

不同含量HA支架的XRD分析見(jiàn)圖4。由于PCL為半結(jié)晶聚合物，其在22.4°及24.9°時(shí)均出現(xiàn)了較強(qiáng)的衍射峰，譜圖上的峰形尖銳，表明該顆粒的結(jié)晶度較好；隨著HA含量的增加，22.4°及24.9°出現(xiàn)的衍射峰強(qiáng)度相對(duì)降低，說(shuō)明其隨著HA含量的增加，支架材料的結(jié)晶度相對(duì)降低。

圖 4 不同含量HA支架的X-射線衍射結(jié)果Fig 4 X-ray diffraction results of different content of HA scaffold

2.4 力學(xué)性能測(cè)試

不同含量HA支架的力學(xué)性能測(cè)試結(jié)果見(jiàn)圖5。從圖5可見(jiàn)，支架的抗壓強(qiáng)度和抗彎強(qiáng)度隨著HA含量的增加而增大；而抗拉伸強(qiáng)度隨著HA含量的增加而減少。HA含量為50%時(shí)支架具有適宜的抗拉伸強(qiáng)度及抗壓、抗彎強(qiáng)度。

圖 5 不同含量HA支架的力學(xué)性能測(cè)試結(jié)果Fig 5 Mechanical test results of different content of HA scaffold

3 討論

顳下頜關(guān)節(jié)是人體最復(fù)雜的關(guān)節(jié)，髁突病變?nèi)睋p的修復(fù)十分困難［6］?？焖俪尚渭夹g(shù)的發(fā)展，給其復(fù)雜的外形提供了新的技術(shù)支持。關(guān)于骨支架材料的研究很多［7］，但目前尚未找出相對(duì)理想的材料。臨床上關(guān)節(jié)損傷通常包括軟骨及軟骨下骨區(qū)域損傷，兩者所含細(xì)胞類型及細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成不同，生物力學(xué)要求也不相同，因此在構(gòu)造復(fù)合支架時(shí)可采用多相復(fù)合構(gòu)型。骨相材料力學(xué)強(qiáng)度大，軟骨相材料多孔高彈性，同時(shí)促進(jìn)骨、軟骨再生。研究［8］發(fā)現(xiàn)大多數(shù)的軟骨組織工程支架修復(fù)骨軟骨缺損時(shí)，支架或植入物常出現(xiàn)脫落、塌陷以及移位，導(dǎo)致修復(fù)失敗。學(xué)者［5］利用磷酸鈣骨水泥-聚乳酸-羥基乙酸共聚物獲得個(gè)性化下頜骨髁突雙相支架，但骨水泥脆性大、力學(xué)強(qiáng)度低，結(jié)果顯示軟骨相與骨相鏈接不甚牢靠。

Sherwood等［9］使用三維打印機(jī)制備一種雙層支架，分軟骨下骨及軟骨兩層，分別具有不同孔徑、孔隙率的三維支架構(gòu)造。該特殊的設(shè)計(jì)使兩層過(guò)度區(qū)域的內(nèi)部結(jié)構(gòu)呈梯度變化，避免了不同材料在軟骨再生過(guò)程中出現(xiàn)的分層和分離。本研究采用HA/ CS-PCL作為支架材料，構(gòu)建一體化髁突結(jié)構(gòu)，制備了上下層不同孔徑、孔隙率的一體化HA/CS-PCL仿生支架。這種特殊的設(shè)計(jì)使髁突支架上下層間移行區(qū)域的材料和孔隙率呈梯度變化，實(shí)現(xiàn)了兩者間的緊密結(jié)合。其中殼聚糖和聚己酸內(nèi)酯是生物相容性良好的可降解材料，其降解產(chǎn)物為二氧化碳和水，能被人體吸收及排出體外［10］。聚己酸內(nèi)酯以堆砌和折疊的方式排列，并形成細(xì)長(zhǎng)的結(jié)晶區(qū)，在非晶區(qū)中分子鏈互相交錯(cuò)，為半結(jié)晶性的線性聚合物，因而聚己酸內(nèi)酯具有良好的抗壓性能以及力學(xué)松弛和蠕變性能，具有良好的柔韌性，其降解半衰期達(dá)1年以上［11］，是髁突缺損植入的理想材料。聚己酸內(nèi)酯缺少良好的親水性，而殼聚糖的羥基導(dǎo)致其親水性強(qiáng)，但機(jī)械性能相對(duì)較差。羥磷灰石具有與自然骨無(wú)機(jī)礦物質(zhì)相似的化學(xué)成分組成，而且有良好的生物活性和較高的機(jī)械強(qiáng)度，但抗疲勞性差，且易發(fā)生遷移。

天然材料和人工合成材料各有優(yōu)缺點(diǎn)，單一成分構(gòu)建支架僅具備部分優(yōu)點(diǎn)，難以滿足組織器官對(duì)支架材料的要求。劉建斌［12］在殼聚糖—明膠復(fù)合支架中加入磷酸三鈣，提高了復(fù)合支架的壓縮強(qiáng)度，隨著植入時(shí)間的延長(zhǎng)復(fù)合支架逐漸降解、吸收，并最后由增生的軟骨細(xì)胞所代替。Frenkel等［13］在兔關(guān)節(jié)軟骨缺損修復(fù)實(shí)驗(yàn)中，一組支架采用透明質(zhì)酸—?dú)ぞ厶蔷垭娊赓|(zhì)復(fù)合物，另一組支架采用Ⅰ型膠原蛋白，軟骨缺損區(qū)域均植入含透明質(zhì)酸的聚乳酸，結(jié)果顯示兩組均可形成軟骨，但透明質(zhì)酸—?dú)ぞ厶蔷垭娊赓|(zhì)復(fù)合物組更有利于軟骨及軟骨下骨組織再生。本研究將HA、CS、PCL三者合一，對(duì)天然材料和人工合成材料取長(zhǎng)補(bǔ)短，制成比較理想的髁突支架。

本研究采用溶液澆鑄-冰瀝法取得的一體化仿生髁突支架模型，無(wú)致孔劑殘留。經(jīng)過(guò)電鏡檢查顯示其孔隙率為70%～85%，大小從基底層50 μm往上逐漸遞增，最上層部分孔隙大小為150～200 μm。根據(jù)細(xì)胞歸巢理論，支架具有潛在的誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化成骨祖細(xì)胞［14］，在所構(gòu)建的結(jié)構(gòu)中，分化出相應(yīng)的細(xì)胞來(lái)重新進(jìn)行組織結(jié)構(gòu)的重建。Lee等［15］報(bào)道在無(wú)培養(yǎng)種子細(xì)胞而直接將含有細(xì)胞因子的支架結(jié)構(gòu)植入體內(nèi)獲得成功的案例，孔隙的孔徑及連通性是設(shè)計(jì)支架結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵［16］。研究表明，15～50 μm的孔隙可以誘導(dǎo)纖維組織的長(zhǎng)入，50～100 μm的孔隙則可刺激骨樣組織的生成，而100～400 μm的孔隙可以直接誘發(fā)礦化骨的生成。因此通過(guò)調(diào)控孔隙孔徑、復(fù)合可緩釋的誘導(dǎo)因子一體化仿生髁突支架結(jié)構(gòu)有望形成雙相支架，這有待在今后的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步研究。

林宗瓊等［17］研究表明，PCL︰CS為4︰1時(shí)，其復(fù)合構(gòu)造材料不改變PCL的韌性結(jié)晶結(jié)構(gòu)，且具有一定親水性。本研究根據(jù)該實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，調(diào)整HA在HA/PCL-CS中的比例，從力學(xué)檢測(cè)結(jié)果來(lái)看，HA 在50%含量時(shí)具有相對(duì)適宜的抗拉伸強(qiáng)度和抗壓、抗彎強(qiáng)度，此時(shí)復(fù)合支架抗拉伸強(qiáng)度為8.12 MPa，有學(xué)者［18］報(bào)告髁突軟骨需要承受的抗拉伸強(qiáng)度為（2.50±0.72）MPa，因此筆者認(rèn)為該支架符合髁突所需力學(xué)要求，由于其含有CS及PCL成分，具有一定的生物相容性，并利于支架的誘導(dǎo)成骨，總體而言該方法制作的復(fù)合支架有望成為綜合性能良好的髁突組織工程支架。

體內(nèi)植入后隨著PCL-CS的降解與軟骨重建，支架力學(xué)性能是否會(huì)發(fā)生改變？其耐磨性如何？組織相容性是否發(fā)生改變？能否適應(yīng)髁突運(yùn)動(dòng)的力學(xué)性能及咀嚼功能要求？在大塊支架內(nèi)是否能實(shí)現(xiàn)理想的細(xì)胞團(tuán)營(yíng)養(yǎng)和廢物交換？這些問(wèn)題都需要通過(guò)進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行探討。

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（本文編輯 李彩）

［中圖分類號(hào)］Q 81

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A ［doi］ 10.7518/hxkq.2016.01.014

［收稿日期］2015-05-29； ［修回日期］ 2015-09-20

［基金項(xiàng)目］江西省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（20132BBG70095）

［作者簡(jiǎn)介］習(xí)偉宏，副主任醫(yī)師，博士，E-mail：xwh1975@163.com

［通信作者］朱洪水，主任醫(yī)師，碩士，E-mail：zhuhongshui@126.com

Synthesis and characteristics of integrated bionic mandibular condylar scaffold

Xi Weihong1， Wang Zhen1， Zhu Hongshui1， Li Xiaofeng2， Xiong Yuanfei2.
（1. Dept. of Oral and Maxillofacial Surgery， Affiliated Stomatological Hospital of Nanchang University， Nanchang 330006， China； 2. Dept. of Orthopaedics， The First Affiliated Hospital of Nanchang University，Nanchang 330006， China）

Supported by: Science and Technology Support Program of Jiangxi Province （20132BBG70095）. Correspondence: Zhu Hongshui， E-mail: zhuhongshui@126.com.

［Abstract］Objective This study aims to construct a chitosan （CS）-polycaprolactone （PCL）-hydroxyapatite （HA） composite biomimetic scaffold to replace condyle and to explore the tissue engineering applications of condylar. Methods A resin mold of the mandibular condyle was prepared by using rapid prototyping techniques. A mandibular condylar integrated biomimetic scaffold model was prepared by solution casting-ice Lek. PCL and CS were mixed at a ratio of 4︰1. HA at quality ratios of 40%， 50%， 60%， and 70% was added to groups a， b， c， and d， respectively. The microscopic morphology， porosity，infrared spectra， X-ray diffraction pattern， and mechanical properties of the scaffold were observed. Results The scaffold that includes both upper and lower parts displayed the same features （i.e.， shape， yellow-white appearance， and hard texture）as the mandibular condyle. Scanning electron microscopy showed that the composite scaffold had a 3D network spatial structure， 70%-85% porosity， and 10-200 μm pore size. Infrared spectra showed that the peak intensity reduced with decreasing HA content. X-ray diffraction showed that the diffraction peak decreased with increasing HA content. Suitable tensile and compressive and flexural strength were discovered in the presence of 50% HA. Conclusion The scaffold prepared by solution casting-ice Lek shows favorable comprehensive features and is expected to replace human condylar.

［Key words］mandibular condyle； bone tissue engineering； biomimetic scaffolds； chitosan； polycaprolactone； hydroxyapatite