許可 趙艷紅 李洪發(fā)

天津醫(yī)科大學口腔醫(yī)院正畸科，天津 300070

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·基礎(chǔ)研究·

模擬體液仿生礦化法制備的羥磷灰石-殼聚糖支架的性能研究

許可 趙艷紅 李洪發(fā)

天津醫(yī)科大學口腔醫(yī)院正畸科，天津 300070

［摘要］目的 應用模擬體液（SBF）仿生礦化法制備羥磷灰石（HA）-殼聚糖支架，探討礦化時間對HA-殼聚糖支架結(jié)構(gòu)及細胞相容性的影響。方法 應用冷凍干燥法制備殼聚糖支架，將該支架應用交替浸泡法進行預鈣化，然后浸入SBF中進行礦化，控制礦化時間分別為7、14、21 d，即為3組實驗組，以單純殼聚糖支架為對照組，檢測4組支架的理化性質(zhì)。再將經(jīng)過成骨誘導后的脂肪基質(zhì)干細胞（ADSCs）接種到HA-殼聚糖支架上，檢測不同礦化時間支架的細胞相容性。結(jié)果 礦化14 d，HA-殼聚糖支架的礦化物分布均勻，晶體組成符合HA特征，壓縮彈性模量隨著礦化時間的延長而增強，在礦化21 d時其壓縮彈性模量與對照組的差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。礦化14 d，ADSCs的增殖量最多，與其他實驗組的差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；其鈣離子和Ⅰ型膠原的分泌量也最多。結(jié)論 SBF仿生礦化法可用于制備HA-殼聚糖骨組織工程支架，該支架在SBF中礦化14 d左右時其生物相容性及理化性質(zhì)可達到最佳狀態(tài)。

［關(guān)鍵詞］仿生礦化； 羥磷灰石； 殼聚糖

傳統(tǒng)口腔頜面部的骨缺損修復方法有自體骨移植及同種異體骨移植，然而，供體組織的有限性以及可能出現(xiàn)的排異反應限制了該方法在臨床上的應用［1］。

口腔骨組織工程為口腔頜面部骨缺損修復帶來了契機。羥磷灰石（hydroxyapatite，HA）是最常用于口腔頜面部骨缺損修復的合成材料。在制備組織工程支架的過程中，可以采用仿生礦化法復合HA與天然高分子，在經(jīng)過修飾的支架材料上模擬體內(nèi)的礦化過程［2-4］生成HA。本實驗采用模擬體液浸泡生成HA的方法，在殼聚糖有機基質(zhì)上進行體外溶液浸泡，并進行細胞培養(yǎng)，觀察礦化時間對礦化物生成的影響，探討采用該方法生成的支架的理化性質(zhì)以及生物相容性。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1 000 mL模擬體液（simulated body fluid，SBF），配制方法參見Tadashi等［5］的報道；殼聚糖（90%脫乙酰度），Ⅰ型膠原蛋白抗體；二抗試劑盒；DAB顯色劑，茜素紅粉末。

1.2 方法

1.2.1 HA-殼聚糖支架的制備 將2%殼聚糖-乙酸溶液冷凍干燥，0.1%NaOH-乙醇-水溶液除酸，2.5%多聚磷酸鈉溶液交聯(lián)，采用超純水洗去支架上的無機鹽離子，得到初始支架。將初始殼聚糖支架分別浸入100 mL 0.1 mol·L-1CaCl2溶液和Na2HPO4溶液中，中間用蒸餾水沖洗20 min，重復5個周期，進行交替浸泡［6］。

1.2.2 分組 將預鈣化后的殼聚糖支架浸入SBF中進行礦化，按照礦化時間不同，將實驗分為3組，礦化至第7天時為Ⅰ組，礦化至第14天時為Ⅱ組，礦化至第21天時為Ⅲ組；并以單純殼聚糖支架組作為對照組。

將成骨誘導后的脂肪基質(zhì)干細胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）接種到各組中，觀察支架的細胞相容性。

1.2.3 HA-殼聚糖支架性能檢測 將Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組及對照組支架分別進行掃描電子顯微鏡（scanning electron microscopy，SEM）、X射線衍射（X-ray diffraction，XRD）、傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）及機械性能測試。

在ADSCs培養(yǎng)至第7天時進行Live/Dead染色和SEM觀察，測定細胞的活性和黏附性；在3個實驗組分別培養(yǎng)至第7、14、21天時分別進行細胞計數(shù)（cell counting kit-8，CCK-8）檢測、茜素紅染色、Ⅰ型膠原免疫組織化學染色，觀察細胞的成骨情況及基質(zhì)分泌情況。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行分析，機械性能測試采用單因素方差分析，CCK-8細胞增殖量采用析因分析，樣本數(shù)均為5，檢驗水準為雙側(cè)α=0.05。

圖 1 實驗組及對照組的支架特征 SEM × 600Fig 1 The characteristics of the experimental and control groups SEM × 600

2 結(jié)果

2.1 支架特征

實驗組及對照組支架見圖1：支架均為多孔狀，隨著礦化時間的延長，由模擬體液法生成的HA增多，其中Ⅲ組的HA呈團聚狀，且有雜質(zhì)碎片，支架孔隙變小。

實驗組及對照組支架的XRD和FTIR圖見圖2。由XRD圖像可見，Ⅰ組在2θ角度為25°～26°時出現(xiàn)很窄的峰，其結(jié)晶體不如Ⅱ、Ⅲ組HA晶體典型，Ⅱ、Ⅲ組在31.79°、32.21°、32.90°處出現(xiàn)3個特征衍射峰，說明在礦化至14 d時形成了HA晶體。在FTIR中，Ⅰ組在1 033 cm-1和962 cm-1處出現(xiàn)了P-O伸縮振動峰，在874 cm-1處和1 094 cm-1處出現(xiàn)C-O伸縮振動峰；Ⅱ、Ⅲ組在1 033 cm-1、564 cm-1和472 cm-1處出現(xiàn)P-O振動峰，說明Ⅰ組產(chǎn)生了碳酸化HA。

圖 2 實驗組及對照組的XRD（左）和FTIR（右）圖Fig 2 XRD （left） and FTIR （right） spectra of experimental and control groups

實驗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組及對照組經(jīng)機械性能測試，其壓縮彈性模量分別為（78.388±0.398）、（78.516± 0.473）、（79.198±1.032）、（77.732±0.548） kPa，4組之間的差異有統(tǒng)計學意義（F=4.128，P=0.024），經(jīng)兩兩比較，只有Ⅲ組與對照組的差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.003），說明實驗組在礦化3周左右的壓縮彈性模量與對照組有較大差異。

2.2 接種后ADSCs的成活性及黏附性

實驗組接種ADSCs培養(yǎng)7 d后的黏附性及成活性見圖3。

圖 3 實驗組支架接種ADSCs培養(yǎng)7 d后的黏附性及成活性Fig 3 Viability and adhesion of ADSCs seeded in the experimental groups after 7 days culture time

由圖3可見，在Ⅲ組的細胞和支架復合物中出現(xiàn)死亡細胞及過多碎片，過多碎片的存在以及過量的HA生成量影響到了ADSCs的成活性。在Ⅰ、Ⅱ組中均可以觀察到細胞外基質(zhì)的分泌，其黏附性及分布狀態(tài)良好。

2.3 細胞增殖量的觀察

實驗組及對照組ADSCs在不同培養(yǎng)時間的CCK-8計數(shù)測量的吸光度A值及統(tǒng)計學分析結(jié)果見表1和表2。經(jīng)兩因素析因分析（表2），組別效應組的差異具有統(tǒng)計學意義，細胞培養(yǎng)時間效應組的差異也有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；但是組別和細胞培養(yǎng)時間兩因素之間沒有交互效應。進一步經(jīng)兩兩比較，Ⅱ組與其他各組的差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），且Ⅱ組的均數(shù)值最大，提示Ⅱ組細胞的增殖能力最強（P＜0.05）。

2.4 茜素紅染色及免疫組織化學染色

接種的成骨誘導后的ADSCs均能在實驗組支架上生長，細胞成骨分化良好；隨著培養(yǎng)時間的延長，ADSCs鈣離子及Ⅰ型膠原分泌量增加，其中，Ⅱ組細胞的分泌量增加最多，Ⅲ組細胞的分泌量增加最少（圖4、5）。

表 1 實驗組及對照組ADSCs在不同培養(yǎng)時間的吸光度A值Tab 1 The A values of experimental and control groups after different cell culture time

表 2 兩因素析因分析結(jié)果Tab 2 The results of two factor analysis

圖 4 實驗組接種ADSCs在不同培養(yǎng)時間的成骨情況 茜素紅染色 × 100Fig 4 The bone formation of experimental groups seeded with ADSCs in different culture time alizarin red staining × 100

圖 5 實驗組接種ADSCs在不同培養(yǎng)時間的基質(zhì)分泌情況 Ⅰ型膠原染色 × 100Fig 5 The matrix secretion of experimental groups seeded with ADSCs in different culture time typeⅠcollagen staining × 100

3 討論

組織工程材料表面在體內(nèi)形成HA是在蛋白質(zhì)參與下復雜的蛋白調(diào)控過程；而組織工程支架中有機高分子化合物與無機物的體外結(jié)合方法主要有共混法、沉淀法和原位沉積法等［7］。這些結(jié)合方法需要有機質(zhì)為溶解狀態(tài)，其后的提取過程復雜，增加了工作量和不必要的負擔，而且提取過程易使支架形態(tài)遭到破壞。現(xiàn)在的研究趨勢逐漸轉(zhuǎn)向采用仿生法研究HA在支架上的生成情況。有學者將基質(zhì)材料浸泡于過飽和鈣磷混合溶液中［8-11］，但是忽略了人體血漿中其他電解質(zhì)的存在，而模擬體液中各種離子的濃度與人體血漿非常接近，pH值也相近，可以最大程度地模擬人體血漿的濃度及微環(huán)境，是真正的仿生方法。本實驗采用模擬體液法作為生成生物活性HA的主要方法，該方法對pH值、溫度有著嚴格要求，觀察應用該方法在天然高分子支架材料上生成生物活性HA的能力具有真正的仿生意義和實用價值，與傳統(tǒng)的機械結(jié)合方法有明顯不同。

體外仿生礦化生成HA是一個復雜的過程。在進行仿生礦化之前往往需要對支架材料或者仿生礦化液進行預處理，這樣可以降低殼聚糖支架表面的自由能，引入HA成核的附著點，加速HA的成核及晶體形成。預處理的方法有多種。Yin等［9］為減少生成時間及增加類骨磷灰石礦化量，將殼聚糖甲基磷酸化，引入磷酸根后的殼聚糖支架孔的表面性質(zhì)改變，能促使類骨磷灰石在孔壁上成核及生長；但是該方法過程復雜，會引入雜質(zhì)且不易去除。Sahil等［12］將仿生礦化液中的HCO3-的濃度由原來的4.2 mmol·L-1提高到27 mmol·L-1，顯著縮短了類骨磷灰石生成的時間，但是易使溶液產(chǎn)生沉淀，反應過程不容易控制?；谏鲜龇椒ǖ母鞣N不足，本實驗采用交替浸泡法［6］。該方法預鈣化過程易于控制，簡便易行，所引入的CaCl2和Na2HPO4是少量的HA前體，不會有雜質(zhì)引入。趙勇［13］應用仿生礦化方法在3周后才在支架表面出現(xiàn)散在的晶體沉積，本實驗生成HA的礦化時間與其相比明顯縮短，可能原因在于趙勇的預鈣化方法為在飽和Ca（OH）2中浸泡3 d，而本實驗采用交替浸泡過飽和礦化液的方法，過飽和礦化液可以將能加速HA成核的帶陰性基團的磷酸根引入到支架中，明顯縮短礦化時間。

Zhao等［7］通過實驗研究發(fā)現(xiàn)，礦化15 d左右的晶體構(gòu)成符合HA特征，其產(chǎn)生的量均勻，HA的形態(tài)呈網(wǎng)狀分布，本實驗的結(jié)果與其基本一致。根據(jù)本實驗XRD結(jié)果，在礦化時間不足時（如礦化時間為7 d）會出現(xiàn)少量低結(jié)晶度的HA晶體，當?shù)V化時間到達14 d時，其結(jié)晶體結(jié)構(gòu)較為典型，之后雖然時間延長（礦化21 d時），礦化物的構(gòu)成與礦化14 d時沒有明顯差別。從實驗組及對照組的XRD圖可以看出，14、21 d時殼聚糖支架上沉積的HA結(jié)晶形態(tài)較好，根據(jù)機械性能測試結(jié)果，礦化21 d時隨著礦化物的增多其機械性增強；但是從SEM結(jié)果來看，礦化14 d礦化物與殼聚糖支架結(jié)合良好，分布均勻，而礦化21 d時HA產(chǎn)生的量明顯增多，造成礦化物的團聚，且有雜質(zhì)碎片進入支架，礦化物在支架中形成樹突狀、團塊狀等結(jié)構(gòu)，使支架孔隙變小甚至封閉，這樣會降低支架的生物相容性，細胞在這樣的支架中增殖能力降低，出現(xiàn)死亡細胞，造成細胞計數(shù)吸光度A值、茜素紅和Ⅰ型膠原染色結(jié)果所呈現(xiàn)的礦化14 d時優(yōu)于21 d的結(jié)果。由此可見，超過14 d后延長礦化時間對于細胞培養(yǎng)來說是不利的，說明礦化過程中控制礦化時間非常必要。

根據(jù)FTIR測試結(jié)果，在礦化時間不足時（Ⅰ組礦化7 d），會產(chǎn)生碳酸化HA，礦化時間延長后，磷酸根基團會取代碳酸根基團，生成更符合生物活性的HA。

本實驗為了檢驗支架材料對細胞分化的影響，先將鼠ADSCs體外誘導分化為骨樣細胞再接種到支架上，在培養(yǎng)過程中對培養(yǎng)基加入成骨誘導因子，觀察發(fā)現(xiàn)，細胞分泌的鈣離子和Ⅰ型膠原的量隨著培養(yǎng)時間的增加而增多，并且細胞數(shù)量也隨著培養(yǎng)時間的延長而增加，而無論是鈣離子、Ⅰ型膠原的分泌量還是細胞增殖量，礦化14 d組均優(yōu)于其他兩個實驗組，說明礦化14 d支架的理化性質(zhì)和細胞相容性均達到最佳狀態(tài)。該結(jié)果提示，采用模擬體液仿生礦化法制備的支架材料在成骨誘導因子存在的條件下支持ADSCs向成骨細胞方向分化，生物相容性良好。

綜上所述，采用模擬體液法與殼聚糖制備的HA-殼聚糖支架具有良好的生物相容性，且在礦化14 d左右其理化性質(zhì)及生物特性達到最佳狀態(tài)，是修復骨軟骨缺損的良好選擇。

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（本文采編 石冰）

［中圖分類號］Q 81

［文獻標志碼］A ［doi］ 10.7518/hxkq.2016.01.002

［收稿日期］2015-09-15； ［修回日期］ 2015-11-02

［基金項目］國家自然科學基金（31300798）

［作者簡介］許可，碩士，E-mail：15510931689@163.com

［通信作者］李洪發(fā)，教授，學士，E-mail：leehongfa@aliyun.com

Fabrication and evaluation of hydroxyapatite-chitosan scaffold via simulated body fluid biomimetic mineralization

Xu Ke， Zhao Yanhong， Li Hongfa.
（Dept. of Orthodontics， Stomatological Hospital， Tianjin Medical University， Tianjin 300070， China）

Supported by: Natural Science Foundation of China （31300798）. Correspondence: Li Hongfa， E-mail: leehongfa@aliyun.com.

［Abstract］Objective This research aimed to fabricate a hydroxyapatite （HA）-chitosan scaffold via simulated body fluid （SBF） biomimetic mineralization and determine how mineralization time affects scaffold construction and cell compatibility. Methods The HA-chitosan scaffolds were fabricated by freeze-drying technique and then subjected to precalcification， also known as alternative soaking method. Afterward， precalcificated scaffolds were placed into the SBF to conduct the mineralization process. Mineralization time was set at 7， 14， and 21 days， corresponding to three experimental groups. Pure chitosan scaffolds acted as the control group， and the physical and chemical properties of the four groups were tested. Osteogenicinduced adipose-derived stem cells （ADSCs） were seeded into the scaffolds to investigate the scaffolds’ cell compatibility. Results The mineral substance of the 14-day group exhibited a uniform distribution. The crystal composition of the mineral substance suited the HA’s features. The compressive elastic modulus increased along with the extension of mineralization time. The 21-day group showed a statistically significant increase in compressive elastic modulus compared with the control group （P＜0.05）. The cell proliferation level of the 14-day group was significantly the highest among the three experimental groups （P＜0.05）. The calcium ion and the typeⅠcollagen had the highest secretion amount when the cells were seeded into the 14-day group. Conclusion The SBF biomimetic mineralization method can be used to fabricate HA-chitosan bone-tissueengineering scaffolds. The biological compatibility， as well as the chemical and physical properties， reached the optimum levels at day 14.

［Key words］biomimetic mineralization； hydroxyapatite； chitosan