劉海萍，郭　紅*， 王東偉，高騫皓， 晉學飛

(1.佳木斯大學附屬第一醫(yī)院 麻醉科， 黑龍江 佳木斯154002；2.吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院 泌尿外科， 吉林 長春130033)

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右美托咪定可能通過抑制TLR4通路對LPS誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠急性肺損傷起保護作用

劉海萍1，郭紅1*， 王東偉1，高騫皓1， 晉學飛2

(1.佳木斯大學附屬第一醫(yī)院 麻醉科， 黑龍江 佳木斯154002；2.吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院 泌尿外科， 吉林 長春130033)

摘要：目的研究右美托咪定(Dex)對脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的膿毒癥(Sep)小鼠急性肺損傷(ALI)起保護作用的分子機制。方法將100只清潔級成年雄性BALB/c小鼠隨機平均分為高濃度右美托咪定組(A組)、低濃度右美托咪定組(B組)、膿毒癥組(C組)和空白對照組(D組)。A、B兩組小鼠分別于建模前30 min經(jīng)腹腔注射Dex 12.5 μg/kg和25 μg/kg ，A、B、C三組小鼠均用腹腔內(nèi)注射LPS建立ALI模型，建模后0、12 h用Western blot法檢測各組小鼠肺組織中TLR-4水平，用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測各組小鼠肺組織中MyD88、NF-κB和IL-6水平，并檢測肺組織濕/干質(zhì)量比(W/D)。結(jié)果建模后，A、B、C三組小鼠肺組織中MyD88、NF-κB和IL-6水平均隨時間延長而提高，且均顯著高于D組(P<0.05)。各個時間點A、B、C三組MyD88、NF-κB和IL-6水平存在顯著差異，C組顯著高于A組(P<0.05)，A組顯著高于B組(P<0.05)。結(jié)論TLR-4信號通路可能參與了膿毒癥大鼠肺損傷過程，Dex可能通過抑制TLR-4通路來實現(xiàn)膿毒癥大鼠的肺保護作用。

關(guān)鍵詞：右美托咪定； 肺； 膿毒癥； 炎癥反應(yīng)

(ChinJLabDiagn,2016,20:0887)

膿毒癥(Sepsis)是機體對于感染所形成的超強的炎癥反應(yīng)，常發(fā)生于大手術(shù)術(shù)后、休克、燒傷等患者，其病死率較高[1]。肺組織在膿毒癥中極易受損，形成急性肺損傷(Acute lung injury,ALI)，患者出現(xiàn)呼吸窘迫，血氧進行性下降，是造成膿毒癥患者死亡的主要原因。目前研究發(fā)現(xiàn)Toll樣受體-4(TLR-4)信號傳導(dǎo)通路在ALI中起到重要作用[2]，通過阻斷或抑制TLR-4信號傳導(dǎo)通路成為預(yù)防和治療ALI的新方向。右美托咪定(dexmedetomidine，Dex)是α2受體激動劑，且具有較高的選擇性，臨床上主要用于對手術(shù)患者圍術(shù)期的鎮(zhèn)靜和鎮(zhèn)痛。新近研究發(fā)現(xiàn)Dex具有器官保護作用[3]，但機制尚不明了。此次研究擬通過觀察Dex對ALI小鼠模型非組織中TLR4的影響，探討Dex對ALI患者肺保護的機制。

1材料與方法

1.1實驗動物與試劑由佳木斯大學實驗動物中心[合格證號：scxk(黑)2013-001]提供的清潔級BALB/c雄性小鼠100只，體重20-24 g。鹽酸右美托咪定注射液(Dex)購自江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司；脂多糖(LPS)購自哈藥集團三精加濱藥業(yè)有限公司，來自于靈桿菌；Toll樣受體4(TLR-4)、髓樣分化因子88(MyD88)、核因子κB (NF-κB)和白細胞介素-6(IL-6)ELISA試劑盒均購自美國Abcam公司。采用隨機數(shù)表法將100只小鼠分為4組：高濃度右美托咪定組(A組)、低濃度右美托咪定組(B組)、膿毒癥組(C組)和空白對照組(D組)，每組各25只。所有小鼠建模前均禁食12 h，飲水不限制。

1.2方法

1.2.1模型建立A、B組小鼠建模前30 min，經(jīng)腹腔注入Dex 12.5 μg/kg和25 μg/kg。30 min后，將A、B、C三組小鼠經(jīng)腹腔注射LPS，濃度為20 mg/kg，D組小鼠經(jīng)腹腔注射生理鹽水0.2 ml。建模小鼠出現(xiàn)呼吸細速、抱團取暖、口唇發(fā)紺、抓取時無力反抗等狀態(tài)，表示建模成功。每組分別于建模后0、2、6、12小時，采用隨機數(shù)表法選取5只小鼠斷頸處死取右肺。將右肺上葉和中葉在生理鹽水中制成組織勻漿，5 000 r/min離心20 min，取上層清液置于-80℃冰箱中保存。將建模后12 h處死的小鼠右肺下葉取出后立刻用電子天平稱重，記為濕重，后置于70℃烘干箱中烘干72 h。

1.2.2觀察指標將凍存的小鼠肺組織用1 ml裂解液裂解，4℃恒溫，8 000r/min離心20 min，取上層清液0.5 ml，應(yīng)用Western blot法檢測TLR-4水平。TLR-4蛋白定量后，用10%濃度的聚丙烯胺凝膠對目標蛋白進行凝膠電泳，此次電泳選用β-actin為內(nèi)參。電泳結(jié)束后，將凝膠轉(zhuǎn)膜、封閉、加入一抗，在4℃環(huán)境中孵育12 h后加入二抗，37℃恒溫孵育2 h后加入顯色液顯色，避光脫色至條帶出現(xiàn)，終止顯色。應(yīng)用Quantity One軟件對條帶光密度值進行定量測定。此次研究以TLR-4/β-actin比值作為TLR-4的相對表達水平。用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測肺組織上清液中MyD88、NF-κB和IL-6水平。所有操作均嚴格按照相應(yīng)說明書進行操作。將建模后12 h處死的小鼠右肺下葉標本烘干后再次用電子天平測量重量，記為干重，據(jù)此計算干濕比(W/D)。

1.2.3統(tǒng)計學方法所有數(shù)據(jù)均應(yīng)用SPSS 14.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料均數(shù)比較采用單因素方差分析；組間比較采用LSD-t檢驗進行兩兩比較。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1各組肺組織中TLR-4表達情況建模后(0 h)，四組小鼠肺組織中TLR-4水平無明顯差異(P>0.05)；建模12 h后，A、B、C三組小鼠肺組織中TLR-4水平顯著升高，C組顯著高于A、B、D組(P<0.05)，A組顯著高于B組(P<0.05)。見圖1、2。

圖1　建模后0 h

圖2　建模12 h后

2.2各組肺組織中MyD88和NF-κB表達情況建模成功后(0 h)，四組小鼠肺組織中MyD88和NF-κB水平無顯著差異(P<0.05)，建模2 h至12 h，A、B、C三組小鼠肺組織中MyD88和NF-κB水平均逐漸升高，且均顯著高于D組(P<0.05)，但組間存在顯著差異(P<0.05)，C組顯著高于A組，A組顯著高于B組。見表1。

表1　各組肺組織中MyD88和NF-κB表達情況

2.3各組肺組織中IL-6表達情況建模成功后(0 h)，四組小鼠肺組織中IL-6水平無顯著差異(P<0.05)，建模2 h至12 h，A、B、C三組小鼠肺組織中IL-6水平均逐漸升高，且均顯著高于D組(P<0.05)，但組間存在顯著差異(P<0.05)，C組顯著高于A組，A組顯著高于B組。見表2。

表2　各組肺組織中IL-6表達情況(pg/ml)

2.4建模12 h各組小鼠肺組織W/D情況建模12 h后，D組小鼠W/D為(4.3±0.5)，A組小鼠W/D為(4.8±0.9)，B組小鼠W/D為(4.5±0.8)，C組小鼠W/D為(6.7±1.2)，C組顯著高于另外三組(P<0.05)。

3討論

膿毒癥導(dǎo)致急性肺損傷的病理生理基礎(chǔ)是大量炎癥因子的釋放，導(dǎo)致肺泡上皮細胞和毛細血管內(nèi)皮細胞的損傷，致使肺組織嚴重水腫，氧合作用下降，血氧急性進行性降低，故抑制炎癥反應(yīng)，治療急性肺損傷是降低膿毒癥病死率的重要一環(huán)[4-6]。

龔小衛(wèi)等人在研究中發(fā)現(xiàn)，脂多糖(LPS)注入小鼠腹腔后，LPS結(jié)合蛋白與之結(jié)合，繼而激活Toll樣受體4(TLR4)信號通路[7]。TLR-4是TLR家族跨膜受體蛋白的一員，是機體內(nèi)非特異性免疫過程中重要的蛋白之一。目前研究發(fā)現(xiàn)，TLR-4主要在巨噬細胞、中性粒細胞等免疫細胞表面[8]。當外源性LPS突破機體物理屏障后，TLR-4識別LPS，并與之結(jié)合，進而釋放大量炎性因子，這些炎性因子通過刺激中性粒細胞產(chǎn)生大量的活性氧簇，造成肺組織毛細血管內(nèi)皮細胞的損傷，形成肺水腫，于健認為這可能是形成ALI的原因之一[9]。石計朋在一項動物實驗中發(fā)現(xiàn)，ALI大鼠肺組織中IL-6和TNF-α水平顯著升高[10]。而IL-6和TNF-α是ALI中啟動炎癥級聯(lián)反應(yīng)的起始因子。有研究證實[11,12]，TLR-4可以通過激活MyD88非依賴型TRIL信號通路，激活TRL-4胞內(nèi)尾狀結(jié)構(gòu)，使之與MyD88蛋白分子結(jié)構(gòu)中的TLR受體結(jié)構(gòu)域相結(jié)合，從而實現(xiàn)刺激信號的傳導(dǎo)，啟動蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)。楊晶的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這個過程中，NF-κB結(jié)構(gòu)中的IκB被磷酸化，并從NF-κB中解離，實現(xiàn)NF-κB的激活，從而促進致炎因子的大量釋放[13]。

此次研究發(fā)現(xiàn)，Sep模型建立2 h后，A、B、C三組小鼠肺組織中TLR-4、MyD88、NF-κB和IL-6水平均顯著升高，且顯著高于D組；隨著時間的延長，A、B、C三組TLR-4、MyD88、NF-κB和IL-6水平逐漸升高，這與蔣海弦的研究結(jié)果相似，提示TLR4通路可能參與了ALI的形成[14]。此次研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，A、B兩組小鼠肺組織中TLR-4、MyD88、NF-κB和IL-6水平在除建模0 h外各個時間點均顯著低于C組，且B組顯著低于A組。Dex在臨床中主要用于圍術(shù)期患者的鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛，并可以通過激活突觸前α2受體來抑制交感神經(jīng)產(chǎn)生沖動，且對呼吸作用影響較小。近年來有研究發(fā)現(xiàn)右美托咪定具有抗炎作用，在膿毒癥小鼠模型中可以保護肝、肺等器官[15]。此次研究結(jié)果證實，Dex對Sep小鼠有較明顯的抗炎、減輕炎癥導(dǎo)致的肺損傷的作用，且抗炎效果與濃度有關(guān)，25 μg/kg濃度的抗炎效果顯著優(yōu)于12.5 μg/kg濃度。這提示Dex可能抑制了Sep小鼠肺組織中TLR-4的表達，從而降低了MyD88和NF-κB的合成，同時下調(diào)了炎癥肺組織中炎癥因子的水平。

綜上，TLR-4信號通路可能參與了膿毒癥大鼠肺損傷過程，Dex可能通過抑制TLR-4通路來實現(xiàn)膿毒癥大鼠的肺保護作用。

參考文獻：

[1]姚詠明,盛志勇,林洪遠,等.膿毒癥定義及診斷的新認識[J].中國危重病急救醫(yī)學,2004,16(6):321.

[2]齊眀祿,楊敬平,銀雪,等.外周血中TLR4、TIRAP表達與膿毒癥相關(guān)性研究[J].臨床肺科雜志,2015,1:19.

[3]冷亞書,李龍云,胡宇博,等.右美托咪定在圍術(shù)期鎮(zhèn)痛作用的研究進展[J].中國實驗診斷學,2014,9:1565.

[4]李麗娟,陳煒,古旭云,等.血漿PCT和CRP水平的動態(tài)變化對膿毒癥嚴重程度的評估及其相關(guān)性研究[J].中國實驗診斷學,2013,17(6):1010.

[5]張立華,張鐵麟,杜金,等.姜黃素對膿毒癥肺損傷患者血清NT-pro-BNP、IL-6、IL-10及肺功能影響研究[J].中國生化藥物雜志,2015,7:89.

[6]林名瑞.膿毒癥相關(guān)性肺損傷治療進展[J].中國急救醫(yī)學,2013,33(5):391.

[7]龔小衛(wèi),姜勇.TLR4在哺乳動物對脂多糖反應(yīng)中的作用[J].生物化學與生物物理進展,2001,28(3):300.

[8]Guillot L,Medjane S,Le Barillec K，et al.Response of human pulmonary epithelial cells to lipopolysaccharide involves Toll-like receptor 4 (TLR4)-dependent signaling pathways: evidence for an intracellular compartmentalization of TLR4[J].The Journal of biological chemistry,2004,279(4):2712.

[9]于健,李睿,姚文瑜,等.右美托咪啶預(yù)處理對下肢缺血再灌注致肺損傷的保護作用[J].中華醫(yī)學雜志,2014,44:3510.

[10]石計朋,黃麗密,錢燕,等.脂肪乳劑對脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷中細胞因子IL-1β和IL-6的影響[J].臨床兒科雜志,2014,3:250.

[11]楊國柱,周寅,呂兆瑛,等.TLR4通路關(guān)鍵蛋白MyD88在壞死性小腸結(jié)腸炎發(fā)病過程中的作用機制研究[J].中華小兒外科雜志,2015,36(2):113.

[12]Uto T,Akagi T,Yoshinaga K,et al.The induction of innate and adaptive immunity by biodegradable poly(gamma-glutamic acid) nanoparticles via a TLR4 and MyD88 signaling pathway.[J].Biomaterials,2011,32(22):5206.

[13]楊晶,李元建,胡長平,等.缺血預(yù)適應(yīng)通過抑制TLR4/NF-KB信號通路保護大鼠心肌缺血再灌注損傷[J].中南大學學報(醫(yī)學版),2011,36(10):972.

[14]蔣海弦,李天舒,顧國寶,等.外周血單核細胞TLR2、TLR4與急性胰腺炎肺損傷的關(guān)系[J].中國實驗診斷學,2013,17(5):902.

[15]徐穎臻,王耀岐,寧巧慶,等.右美托咪定通過抑制JAK2/STAT3通路改善脂多糖誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷[J].臨床麻醉學雜志,2015,31(11):1105.

*通訊作者

文章編號：1007-4287(2016)06-0887-04

中圖分類號：R614

文獻標識碼：A

(收稿日期：2015-11-27)

Dexmedetomidine may inhibit the TLR4 pathway play a protective effect on the acute lung injury in sepsis mice induced by LPS

LIUHai-ping，GUOHong,WANGDong-wei,etal.

(DepartmentofAnesthesiology,theFirstAffiliatedHospitalofJiamusiUniversity,Jiamusi154002,China)

Abstract:ObjectiveStudy on the molecular mechanism of protective effect of dexmedetomidine on acute lung injury in sepsis mice induced by lipopolysaccharide.MethodsPut randomly 100 clean grade adult male BALB/c mice into high concentrations of dexmedetomidine group (group A),low concentrations of dexmedetomidine group (group B),sepsis sepsis group (Group C) and blank control group (Group D).A and B group of mice were injected DEX 12.5 mu g / kg and 25 g/kg before 30 min of modeling.A,B and C group of mice were intraperitoneal injection of LPS to establish the model of ALI.Detecting the level of TLR-4 in lung tissue of mice with Western blot after modeling 0 and 12 hours.Using enzyme linked immunosorbent method (ELISA) to detected MyD88,NF-κB and IL-6 levels in the lung tissue of the mice,and detection of lung tissue wet/dry weight ratio (W/D).ResultsAfter modeling,level of MyD88,NF-κB and IL-6 in A,B and C group were increaseing with time,and were significantly higher than D group (P<0.05).Level of MyD88,NF- three groups of NF-κB in C group were significantly higher than that of group A (P<0.05),and those in A group was significantly higher than that of group B (P<0.05).ConclusionTLR-4 signaling pathway may be involved in the process of lung injury in septic rats,Dex may inhibit the TLR-4 pathway to achieve lung protective effect in septic rats.

Key words:Dexmedetomidine;lung;sepsis;inflammatory reaction