□ 朱 敏 葉丹怡 上海市金山食品藥品檢驗(yàn)所

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HPLC/MS定性定量檢測(cè)清腦保心康膠囊中非法添加的氫氯噻嗪

□ 朱 敏 葉丹怡 上海市金山食品藥品檢驗(yàn)所

摘 要：目的：建立HPLC/MS方法，快速定性定量檢測(cè)保健食品中非法添加的氫氯噻嗪。方法：采用高效液相色譜串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)。色譜條件：Agilent Eclipse Plus C18（4.6 mm×100 mm，3.5 μm）色譜柱。柱溫：30℃。流動(dòng)相：甲醇：0.1%甲酸水溶液=80：20。流速為0.5 mL/min。質(zhì)譜條件：ESI源，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）。以保留時(shí)間及定性離子對(duì)之間的相對(duì)豐度定性，以定量離子對(duì)峰面積定量。結(jié)果：氫氯噻嗪在10.29～1 028.79 ng/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（r＞0.999 7）。平均加樣回收率：99.12%。定量限為10.29 ng。結(jié)論：本方法定性可靠、定量準(zhǔn)確，且快速簡(jiǎn)便?？捎糜诒＝∈称分蟹欠ㄌ砑託渎揉玎旱臋z驗(yàn)。

關(guān)鍵詞：HPLC/MS；清腦保心康膠囊；氫氯噻嗪

氫氯噻嗪為利尿、抗高血壓藥。對(duì)肝原性水腫、心原性水腫、腎性水腫有一定的治療效果，例如：急性腎小球腎炎、腎上腺皮質(zhì)激素、慢性腎功能衰竭以及雌激素過(guò)多導(dǎo)致的水腫，高血壓，尿崩癥；膽囊炎、胰腺炎、性功能減退、光敏感、色覺(jué)障礙等較為罕見(jiàn)。長(zhǎng)期服用本藥品可能出現(xiàn)的不良反應(yīng)：渾身無(wú)力、疲倦、頭暈、食欲下降、反胃嘔吐、腹瀉、血壓降低等不適的癥狀，減少藥品的用量或者適量調(diào)節(jié)電解質(zhì)失衡后不適癥狀會(huì)馬上減退。有一部分違法的商人，在一部分聲稱有降低高血壓作用的保健食品中非法添加化學(xué)藥品，因?yàn)樵谠鎏砘瘜W(xué)藥物的用量上不明確，導(dǎo)致一部分患者在毫不知情的情況下服用。無(wú)意中增加了風(fēng)險(xiǎn)性，造成不良反應(yīng)，嚴(yán)重的更是威脅患者的生命［1］。因此，急需對(duì)此類非法添加行為進(jìn)行檢驗(yàn)檢測(cè)，嚴(yán)厲打擊。之前已有不少研究者用不同的儀器監(jiān)測(cè)中成藥制劑中添加降壓藥物。此保健品已報(bào)道的只有樊磊磊 等定量檢測(cè)非法添加物利血平，他們懷疑其中不止混有利血平，還有其他降壓化學(xué)藥品。本文采用超高效液相色譜串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀，檢測(cè)出其還混有氫氯噻嗪，并首次進(jìn)行定量定性同步檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（Agilent 6460 安捷倫公司）；色譜柱Eclipse Plus C18（4.6 mm×100 mm，3.5 μm） （安捷倫公司）；濾膜0.8μm（上海半島實(shí)業(yè)有限公司凈化器材廠）；SK5210HO超聲清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；BT124S電子分析天平（北京賽多利斯公司）；BP211 D電子分析天平（北京賽多利斯公司）。

氫氯噻嗪對(duì)照品（供含量測(cè)定用，含量為99.4%批號(hào)：100309-201103中國(guó)藥品生物制品檢定所），清腦保心康膠囊（國(guó)藥準(zhǔn)字Z20002158 藥品安全專項(xiàng)整治行動(dòng)送檢樣品）；甲醇均為色譜純（Merck公司），水為超純水。

1.2 HPLC/MS條件

1.2.1 HPLC條件

色譜柱：Eclipse Plus C18（4.6 mm×100 mm，3.5 μm），柱溫：30℃，進(jìn)樣量：2 μL，甲醇：0.1%甲酸水溶液=80∶20；流速：0.5 mL/min。

1.2.2 MS條件

ESI源（-），毛細(xì)管電壓：3.5 kV，離子源溫度：100℃，干燥氣溫度：350℃，干燥氣流速：10 L/min，霧化器壓力：50 psi。監(jiān)測(cè)方式：MRM，監(jiān)測(cè)離子對(duì)（m/z）：295.5＞269.0；295.5＞205.1；295.5＞78.0。

1.3 對(duì)照品溶液的制備

在避免光線的條件下，嚴(yán)格稱量氫氯噻嗪標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品10.35 mg，置100 m L棕色容量瓶中，加甲醇溶解稀釋至刻度，制成102.88 ug/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1），再精密吸取1.0 mL至100 m L棕色容量瓶中，加甲醇定量稀釋制成濃度為1.028 8 ug/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液（2），2～8℃冷藏保存，備用。

1.4 供試品溶液的制備

避光條件下，先取適量的樣品內(nèi)容物，將其混合攪拌，均勻后再取一次性服用量樣品，對(duì)其精確稱量，然后放入50 mL的容量瓶中，再添加40 m L的甲醇，冷卻至室溫后，用甲醇稀釋至刻度，輕搖至均勻，再次稀釋50倍后，過(guò)0.8 μm微孔濾膜，便可得到［2］。

1.5 空白溶液制備

直接取稀釋溶劑即得。

2 結(jié)果

2.1 定性分析

取標(biāo)準(zhǔn)貯備液（2），稀釋制成51.439 5 ng/mL的對(duì)照品溶液，進(jìn)樣2 μ L，準(zhǔn)確記錄下所得到的質(zhì)譜MRM色譜圖。記錄、對(duì)比解析對(duì)照品溶液所得圖譜中氫氯噻嗪的色譜保存時(shí)間（RT=1.89 min）及定性離子碎片存在有（m/z：295.5＞269.0；295.5＞205.1；295.5＞78.0）。

取供試品溶液，進(jìn)樣2 μ L，記錄得到的質(zhì)譜MRM色譜圖。記錄、對(duì)比解析供試品溶液的圖譜，比如：檢測(cè)氫氯噻嗪的質(zhì)譜MRM離子通道中有色譜峰出現(xiàn)，先與對(duì)照品中峰的保留時(shí)間對(duì)比（供試品峰RT=1.89 min的±2.5%允許誤差范圍內(nèi)），此一致，再對(duì)比定性離子碎片是否跟對(duì)照品一致，也一致，則判斷供試品溶液中含有此化學(xué)藥品。

2.2 定量分析

對(duì)判定供試品溶液中含有氫氯噻嗪的供試品，則按其定量離子對(duì)（m/z）：347.1＞269.0的峰面積進(jìn)行含量計(jì)算。含量測(cè)定方法研究如下。

線性觀察和定量限配制系列濃度的對(duì)照品溶液，進(jìn)行樣品的測(cè)定，以濃度為橫坐標(biāo)，縱坐標(biāo)是離子對(duì)的峰面積，對(duì)其進(jìn)行線性回歸。結(jié)果顯示，在10.2 879～1 0 28.79 ng/mL范圍內(nèi)，氫氯噻嗪的線性方程式為：Y=2.664 247X+18.077 545 （r=0.999 7），進(jìn)樣量是2 μL，其線性關(guān)系良好，氫氯噻嗪的定量限為10.287 9 ng。

精密度試驗(yàn)取對(duì)照品溶液1份，連續(xù)進(jìn)樣6次，氫氯噻嗪定量離子對(duì)峰面積的RSD為0.94%。

取陽(yáng)性樣品6份，反復(fù)進(jìn)行試驗(yàn)，按照供試品的制備方法制備，逐次測(cè)定樣品。氫氯噻嗪中含有RSD0.86%。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取上述反復(fù)的試驗(yàn)所得到的同一樣品溶液，區(qū)分在2、4、8、16 h，進(jìn)行樣品的測(cè)定，結(jié)果氫氯噻嗪的峰面積RSD為1.45%。結(jié)果顯示，制備后16 h內(nèi)，供試品溶液的穩(wěn)定性良好。

回收率試驗(yàn)：取一次性服用量的陽(yáng)性樣品6份，分別放置于50 mL的容量瓶中，每個(gè)容量瓶都加入以102.88 μg/mL為標(biāo)準(zhǔn)的貯備液（1）5 mL，將其用超聲處理15 min，再冷卻到室溫，然后用甲醇稀釋至刻度，搖至均勻，稀釋50倍后，過(guò)0.8 μm微孔濾膜，進(jìn)行測(cè)定。平均回收率為99.77%，RSD 為0.12%。見(jiàn)表1。

表1 回收率結(jié)果

（6）樣品測(cè)定：取一定的樣品溶液，進(jìn)行測(cè)定，以監(jiān)測(cè)到的MRM色譜圖中定量離子對(duì)（m/z）：347.1＞269.0的峰面積進(jìn)行計(jì)算，氫氯噻嗪含量為：0.54 mg/g。

3 結(jié)語(yǔ)

清腦保心康膠囊具有降壓功效，其以純中藥制劑保健品的形式，違法增添化學(xué)藥品氫氯噻嗪進(jìn)行出售，膠囊中所含成分繁雜，摻雜著許多干擾成分，不利于一般檢測(cè)措施的實(shí)施。而使用串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜MRM檢測(cè)措施，有更好的選擇性，還能有效消除其他的干擾成分，不需要對(duì)樣品進(jìn)行繁雜的前處理，減少了因前處理而增加的誤差，采取相對(duì)保留時(shí)間及離子碎片進(jìn)行定性，定性結(jié)果更為準(zhǔn)確，且靈敏度也極高。采用HPLC分析樣品，在3 min內(nèi)即可完成樣品的檢測(cè)，把兩種方法相互結(jié)合使用可使快速的定性定量檢測(cè)得以快速實(shí)現(xiàn)。綜上所述，HPLC/MS法效果顯然比簡(jiǎn)單的HPLC法效果更好［3］。

參考文獻(xiàn)：

［1］周蘭坤.談降壓藥物的不良反應(yīng)［J］.中外醫(yī)療，2009，28（15）：90.

［2］劉吉金.降壓保健品及中成藥中非法添加化學(xué)成分的快速檢測(cè)方法研究［J］.中成藥，2008，30（1）：144-146.

［3］劉吉金，楊敏，李軍，等.HPLC同時(shí)檢測(cè)保健品及中成藥中非法添加9種抗高血壓化學(xué)藥物的研究［J］.中國(guó)現(xiàn)在應(yīng)用藥學(xué)，2008，25（z2）：717-719.

作者簡(jiǎn)介：朱敏（1987-），男，漢，上海金山人，本科，助理工程師。研究方向：食品藥品檢測(cè)。葉丹怡（1982-），女，漢，上海金山人，本科，助理工程師。研究方向：食品藥品檢測(cè)。